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Genetics

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos uma levedura melhorada híbrido-um protocolo para identificar os fatores de transcrição (TFs) que podem ligar a uma região de DNA humana de interesse de triagem. Esse método usa um pipeline de rastreio com throughput alto que pode interrogar a vinculação de > 1.000 TFs em uma única experiência.

Abstract

Identificar os conjuntos de factores de transcrição (TFs) que regulam cada gene humano é uma tarefa difícil que requer a integração de diversas abordagens experimentais e computacionais. Um tal método é o ensaio (Y1H) um híbrido do fermento, em qual dessas interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando genes repórter. Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma 'DNA-isca' (ex.., promotores, melhoradores, silenciadores, etc.) e um 'TF-presas,' que podem ser rastreada para ativação do gene repórter. Mais protocolos publicados para a realização de telas Y1H são baseados em transformar bibliotecas TF-presa ou matrizes em cepas de leveduras de DNA-isca. Aqui, descrevemos um pipeline, chamado Y1H reforçada (eY1H) os ensaios, onde interações TF-DNA são interrogadas por linhagens de DNA-isca com uma coleção de matriz de cepas de TF-presas usando uma matriz de alta densidade de acasalamento plataforma de robótica (HDA) que permite o rastreio em um 1.536 formato de colônia. Isto permite um aumento dramático na taxa de transferência (60 sequências de DNA-isca contra > 1.000 TFs leva duas semanas por pesquisador) e reprodutibilidade. Ilustraremos os diferentes tipos de resultados esperados através do teste de sequências de promotor humano contra uma matriz de 1.086 TFs humano, bem como exemplos de problemas que podem surgir durante as telas e como solucioná-los.

Introduction

Um problema central no campo biomédico é determinar os mecanismos pelo qual cada gene humano é regulamentado. Transcrição é o primeiro passo para controlar os níveis de expressão do gene, e ela é regulada por conjuntos de fatores de transcrição (TFs) que são exclusivos para cada gene. Dado que os seres humanos codificam para > 1.500 TFs1,2, identificando o conjunto completo do TFs que controlam a expressão de cada gene permanece um desafio aberto.

Dois tipos de métodos podem ser usados para mapear interações TF-DNA: TF-centrado e centrada no DNA métodos3 (figura 1A). Em métodos TF-centrado, um TF de interesse é sondada para ligação para regiões de DNA genômicas ou para determinar a sua especificidade de ligação do DNA. Estes métodos incluem imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida por sequenciamento de alta produtividade, microarrays de ligação da proteína e SELEX4,5,6. Em métodos centrado no DNA, uma sequência de DNA de interesse é analisada para determinar o conjunto de TFs que ligam para a sequência do DNA. A mais amplamente aplicada de tais métodos é fermento um híbrido (Y1H) os ensaios, no quais as interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando o repórter genes7,8,9.

Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma 'DNA-isca' (por exemplo, promotores, melhoradores, silenciadores, etc) e um 'TF-presas,' que podem ser rastreada para repórter gene ativação9,10 (figura 1B). A isca de ADN clonada montante de repórter dois genes (LacZ e HIS3) e ambas as construções do DNA-bait::reporter estão integradas no genoma da levedura para gerar chromatinized 'linhagens de DNA-isca'. A TF-presa, codificada em um plasmídeo que expressa um TF fundido-se ao domínio de ativação (AD) da levedura Gal4 TF, é introduzida a estirpe de DNA-isca para pescar interações TF-DNA. Se o TF-rapina vincula-se à sequência de DNA-isca, o anúncio presente na rapina TF levará para a ativação de ambos os genes repórter. Como resultado, as células com uma interação positiva podem ser selecionadas para o crescimento em placas faltando histidina, bem como a superação de um inibidor competitivo, 3-Amino-1, 2,4-triazole (3-a) e visualizadas como colônias azuis na presença de X-gal. Porque o fermento potente Gal4 AD é usado, os ensaios de Y1H podem detectar interações envolvendo ativadores transcricionais, bem como repressores. Além disso, dado que TF-presas são expressos de um promotor forte de fermento (ADH1), interações podem ser detectadas mesmo para TFs com níveis de baixa expressão endógena, que são um desafio para detectar por ChIP11,12.

Mais protocolos publicados para a realização de ensaios de Y1H são baseados em introduzir as cepas de leveduras DNA-isca TF-presas, transformando-se em pool TF-rapina bibliotecas, seguidas por seleção, colônia escolhendo e sequenciamento para identificar o TF interagindo, ou por transformação individual clones8,9. Estes são protocolos demorados, limitando o número de sequências de DNA que podem ser testados por pesquisador. Uma recente melhoria dos ensaios de Y1H, chamado enhanced Y1H (eY1H), aumentou drasticamente a taxa de transferência de rastreio usando uma plataforma robótica de matriz (HDA) de alta densidade para acasalar cepas de leveduras DNA-isca com uma coleção de cepas de leveduras, cada uma expressando uma diferente TF-rapina10,13 (Figura 1). Estas telas empregam uma 1.536 colônia formato permitindo testar TFs mais humano em quadriplicado usando apenas três pratos. Além disso, dado que as interações TF-DNA são testadas de forma emparelhada, esta abordagem permite comparando interações entre DNA-iscas (como duas variantes de nucleotídeo único não-codificante) e entre diferente TFs ou variantes TF11,12 ,14.

Utilizando ensaios de eY1H, foram delineados os humanos maiores e Caenorhabditis elegans TF centrado no DNA-DNA interações redes até à data. Em particular, nós identificamos 2.230 interações entre 246 potenciadores do desenvolvimento humanos e 283 TFs12. Além disso, nós empregamos eY1H ensaios para descobrir a ligação de TF alterada para 109 variantes não-codificante de nucleotídeo único associados a doenças genéticas como a malformação do desenvolvimento, câncer e doenças neurológicas. Mais recentemente, nós costumávamos eY1H delinear uma rede composta por 21.714 interações entre 2.576 promotores de genes de c. elegans e 366 TFs11. Esta rede foi fundamental para desvendar o papel funcional de dezenas de c. elegans TFs.

Os protocolos para gerar manchas de DNA-isca e avaliar os níveis de atividade de repórter de fundo tem sido relatado em outro lugar15,16,17. Aqui, descrevemos um pipeline de eY1H que pode ser usado para qualquer região de DNA genômico humano contra uma matriz de 1.086 TFs humana de tela. Uma vez que uma estirpe de DNA-isca de levedura é gerada e uma matriz de TF-presa está manchado nas chapas de correspondente, o protocolo inteiro pode ser executado em duas semanas (tabela 1). Mais importante, o protocolo pode ser colocado em paralelo para que um único pesquisador pode tela 60 sequências de DNA-isca simultaneamente. Para demonstrar o protocolo, nós selecionados promotores do cytokine os genes CCL15 e IL17F. Além disso, mostramos resultados de falhadas telas para ilustrar os tipos de problemas que possam surgir durante a execução de ensaios de eY1H e como solucioná-los.

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Protocol

1. preparações

  1. Placas −H de −U de SC (pratos de Petri 150 mm)
    Nota: Estas placas serão usadas para o cultivo de cepas de leveduras a DNA-isca.
    1. Dissolva a mistura de abandono, base de nitrogênio levedura (YNB), adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 920 mL de água e pH para 5.9 com 5 M NaOH (aproximadamente 1 mL por litro de mídia; ver tabela 2 para composição). Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.
    2. Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).
    3. Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.
    4. Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão. Adicionar a glicose, misture bem em uma placa de agitação e esfriar a 55 ° C em banho-maria.
    5. Adicione a leucina e o triptofano para a mídia. Misture bem em um prato Misture e despeje em pratos de Petri estéril de 150 mm (~ 80 mL por prato). Seco por 3 – 5 dias à temperatura ambiente, embrulhe em sacos plásticos e armazenar em temperatura ambiente por até 6 meses.
  2. Placas retangulares de YAPD
    Nota: Estas placas serão usadas para o cultivo do gramado para a cepa de DNA-isca e para acasalamento com a coleção de matriz TF.
    1. Dissolver o pós (ver quadro 3 para composição), com exceção de ágar, em 950 mL de água em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.
    2. Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).
    3. Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.
    4. Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão.
    5. Adicionar a glicose, misture bem em uma placa de agitação e legal a 55 ° C. Despeje as placas retangulares de mídia (ver Tabela de materiais; ~ 70 mL por placa) usando uma bomba peristáltica (5 mL/seg.) e um tubo de 6 mm. Seca para 1 dia em temperatura ambiente, embrulhe em sacos plásticos e armazenar no quarto frio por até 6 meses.
      Nota: Embora o volume de mídia sugerida é 70 mL por placa, 50 – 80 mL por placa pode ser usado. As três questões críticas a considerar quando derramando placas são 1) que eles são redistribuídos para que os meios de ágar tem a mesma espessura em toda a placa (usar uma tabela nivelada ou superfície para placa derramar e não despeje em pilhas de mais de sete placas) 2) para garantir a ausência de bolhas no agar mídia (bolhas devem ser exibidas usando uma agulha esterilizada) e 3) as placas de secagem para apenas um dia e envolvendo as placas em sacos de plástico para evitar falhas na fixação de levedura.
  3. −Trp SC e Sc −U −Trp retangulares placas
    Nota: Estas placas serão usadas para a coleção de matriz TF (−Trp Sc) crescente e selecionar levedura diploide após o acasalamento (Sc −U −Trp).
    1. Dissolver a mistura de abandono, YNB, adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 920 mL de água e pH para 5.9 com NaOH 5m (cerca de 1 mL por litro de mídia) (ver tabela 4 para composição). Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.
    2. Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).
    3. Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.
    4. Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão. Adicionar a glicose, misture bem em uma placa de agitação e esfriar a 55 ° C.
    5. Adicione a leucina, histidina e uracil (omitir o uracil para as placas de −Trp −U de Sc).
    6. Misture bem em um prato Misture e despeje em placas retangulares (~ 70 mL por placa) usando uma bomba peristáltica (5 mL/seg) e tubulação de 6 mm. Secar por 1 dia em temperatura ambiente, embrulhe as placas em sacos plásticos e armazenar no quarto frio por até 3 meses.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + retangulares placas X-galão
    Nota:     estas placas serão usadas como placas de leitura para ensaios eY1H.
    1. Dissolver a mistura de abandono, YNB, adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 850 mL de água (ver tabela 5 para composição). Fazer não pH. Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.
    2. Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar a 850 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).
    3. Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.
    4. Prepare-se 10 x sais BU (1L) pela combinação de 900 mL de água, 70 g de Na2HPO4∙7H2O e 34,5 g de NaH2PO4∙H2O. Mix usando uma barra de agitar para dissolver o pó e ajustar o pH a 7,0 usando 5 M de NaOH. Adicione água a 1 L e autoclave.
    5. Prepare a solução de X-galão, adicionando 3,5 g de pó X-galão para um tubo de plástico de 50 mL contendo 42,5 mL de dimetil formamida. Adicionar o pó de X-galão de dimetil Formamida a dissolver mais facilmente (isso leva 30 min). Manter a solução no escuro (tubo opaco 50ml de uso ou cobertura na folha). Loja a-20 ° C.
    6. Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão. Adicionar a glicose e a 10x BU sais (ver tabela 5 para composição), misture bem em uma placa de agitação e esfriar a 55 ° C.
    7. Adicione a leucina, 3AT e X-gal (ver tabela 5 para composição).
    8. Misture bem em um prato Misture e despeje as placas retangulares (~ 70 mL por placa) usando uma bomba peristáltica (5 mL/seg.) e um tubo de 6 mm. Seca para 1 dia em temperatura ambiente, embrulhe em sacos plásticos e armazenar na sala fria, coberta de papel alumínio (3AT e X-gal são sensíveis à luz) até 1 mês.

2. mancha uma matriz TF

  1. Descongelar a matriz TF-presa
    1. Descongele as placas de estoque de glicerol de fermento com a matriz de TF-presa no gelo.
      Nota: TF-rapina matrizes podem ser gerados como publicado anteriormente10,12,13,18.
    2. Ressuspender o fermento utilizando uma pipeta de 12 canais dentro de 1 – 3 min antes da próxima etapa.
  2. Manchando o fermento em Sc −Trp placas retangulares
    1. No robô HDA (ver Tabela de materiais), selecione multi bem 96 placas como fonte, 96 placas de ágar como alvo e almofadas de 96 pino longo.
      Nota: PIN pads não são reutilizáveis e devem ser descartados.
    2. Selecione o programa Replicar muitos para fazer duas cópias por placa de 96 poços. Não use a reciclar ou revisitar as opções para evitar a contaminação de trás das populações de congelados.
    3. Selecione a opção para rodar em cima e para baixo na fonte de misturar o fermento.
    4. Saco da matriz manchada e incubar com agar acima a 30 ° C durante 2 a 3 dias.
  3. Gerando 384 matrizes de colônia em placas retangulares de Sc −Trp
    1. No robô, selecione 96 placas de ágar como fonte, 384 placa de ágar como alvo e 96 almofadas de pino curto.
    2. Selecione o programa matriz 1:4 . Desta forma, placas de quatro 96 colônia (cada um contendo um TF diferente) serão consolidadas na placa uma 384 colônia. Não use a reciclar ou revisitar as opções para evitar a contaminação entre diferentes placas.
    3. Saco as placas e incubar o matriz de 384-colônia malhada-agar para cima a 30 ° C por 2 dias.
  4. Geração de 1.536 matrizes de colônia em placas retangulares de Sc −Trp
    Nota: Isso resultará em matrizes contendo quatro colônias para cada TF-presas.
    1. No robô, selecione 384 placas de ágar como fonte, as placas de 1.536 ágar como alvo e 384 almofadas de pino curto.
    2. Selecione o programa de fonte única de ensaio de 1:4. O objetivo é copiar cada colônia em quatro colônias para obter quadruplicates. Usar a reciclagem e revisitar as opções como envolve copiar quatro vezes cada colônia.
    3. Saco as placas e incubar o matriz de 1536-colônia malhada-agar para cima a 30 ° C durante 3 dias.
  5. Amplificando a matriz de 1.536 colônia em placas retangulares de Sc −Trp
    1. No robô, selecione 1.536 placas de ágar como fonte, 1.536 placas de ágar como alvo e 1.536 almofadas de pino curto.
    2. Selecione o programa Replicar muitos para replicar cópias de 3 – 4. Usar a reciclagem e revisitar a opção, mas jogar fora a almofada, ao alternar para um prato diferente da matriz para evitar a contaminação cruzada.
    3. Saco as placas e incubar o matriz de 1536-colônia malhada-agar para 30 ° C por 3 dias para usar para acasalamento passos (veja abaixo). Depois disso, manter as placas em temperatura ambiente e copiar novamente depois de 7 dias para uma nova rodada de seleção.

3. eY1H tela

  1. Preparando os gramados de estirpe de DNA-isca para acasalamento
    1. Manchar o fermento cepas de DNA-isca em uma placa −H de −U de Sc e crescer por 3 dias a 30 ° C.
    2. Marcam o fermento em uma placa −H de −U Sc usando um palito de dente estéril de 15 cm, para que cada placa se encaixa diferentes cepas de 12 a 16. Incubar um dia a 30 ° C.
    3. Marcam o fermento em uma placa −H de −U Sc usando um palito de dente estéril de 15 cm, para que cada placa se encaixa 4 diferentes cepas. Incubar durante um dia a 30 ° C.
    4. Raspe o fermento usando um palito esterilizado, certificando-se não raspar qualquer agar e adicionar em um tubo 1,5 com 500 µ l de água estéril.
    5. Adicione contas de vidro estéril de 10 – 15 num prato retangular YAPD. Adicionar a suspensão de levedura na chapa e agitar cuidadosamente em todas as direções por 1min garantir que o fermento é espalhado através de toda a placa.
    6. Inverter a placa imediatamente e para que os grânulos de ir para a tampa. Retire e Recicle os grânulos.
    7. Saco as placas e incubar agar para baixo por 1 – 2 dias a 30 ° C. Então prossiga para a etapa de acasalamento.
  2. Acasalamento de levedura DNA-isca e cepas de matriz TF
    1. Transferi a matriz TF para uma chapa retangular de YAPD com o robô. Selecione a placa de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa Replicar muitos . Cada placa de matriz TF pode ser usada para transferir para placas YAPD 3-4 (dependendo do número de placas na matriz). As placas de matriz TF usadas para acasalamento devem ser 2-3 dias de idade, mas não mais como acasalamento podem ser ineficiente.
    2. Transferi o gramado de uma estirpe de DNA-isca para as placas YAPD, já que contém a matriz TF com o robô. Selecione a placa de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa Replicar muitos . Usar um offset aleatório na fonte com um raio de ~0.6 mm para evitar tomar levedura do mesmo lugar e misture no alvo para facilitar o contacto entre cepas de leveduras. Usar o gramado contendo as cepas de DNA-isca (seção 3.1), como fonte, e as placas YAPD que contém a matriz TF visto no passo 3.2.1 como alvo.
    3. Saco as placas e incubar agar para cima a 30 ° C para 1 dia.
  3. Seleção de levedura diploide
    1. Transferi o fermento acasalado das placas YAPD para chapas de −Trp −U de Sc com o robô. Selecione a placa de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa de replicar . Misture na origem e no destino.
    2. Saco as placas e incubar agar para cima a 30 ° C por 2 – 3 dias (incubação mais tempo leva a atividade de repórter de fundo elevado).
  4. Transferir para placas de leitura
    1. Transferi a levedura diploide das placas de −Trp −U de Sc para a leitura placas retangulares Sc −U −H −Trp + 3AT 5mm + 0,4 mM X-galão usando o robô. Selecione as placas de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa de replicar .
    2. Saco as placas e incubar agar para cima a 30 ° C por até 7 dias.
  5. Imagens de placas de leitura
    1. Para linhagens de DNA-isca com atividade de repórter de fundo elevado, tire fotos nos dias 2, 3 e 4. Caso contrário, tire fotos, nos dias 4 e 7. Interações positivas são identificadas pelo crescimento e azul cor das colônias fúngicas e podem ser determinadas manualmente, ou pode ser determinado usando software de análise de imagem.

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Representative Results

Três fatores principais devem ser considerados ao analisar resultados de ensaios de eY1H: a atividade de repórter de plano de fundo da estirpe DNA-isca, a força da atividade repórter correspondente a interações TF-DNA e o número de colônias positivas. A atividade de repórter de fundo (i.e., autoactivity) da estirpe DNA-isca refere-se ao crescimento global e cor das colônias na placa de leitura, mesmo na ausência de um TF-rapina fermento. Idealmente, as estirpes não-autoactive mostram uma fundo branco ou claro cor marrom, com colônias para interações positivas sendo maior e azul. Autoactive DNA-isca estirpes mostram crescimento de levedura na mídia falta histidina e uma cor azul na presença de X-galão para todas as colônias na placa, que provavelmente está relacionada com a ligação de ativadores transcricionais de levedura para a DNA-isca8. A força da atividade repórter correspondente para as interações de TF-DNA detectadas (ou seja, o tamanho da colônia) e intensidade de azul depende de muitos parâmetros tais como a afinidade, o nível de expressão do TF na levedura, o número de ligação a sites e distância para os promotores de levedura minimal localizados a montante dos genes repórter e a atividade de repórter de plano de fundo da estirpe DNA-isca. Por exemplo, uma força fraca podem ser facilmente detectada em uma isca de baixo fundo... mas pode ser difícil de detectar em um autoactive ou isca de fundo irregular. Também é importante observar que atividade de repórter níveis no fermento não necessariamente se correlacionam com a actividade regulamentar em células humanas, como a estrutura da cromatina, nucleossoma, posicionamento, e efeitos de distância são diferentes entre levedura e humana. Além disso, as interações em humanos são susceptíveis de ser influenciado pela ligação de outros TFs e cofactores ou podem ser mascaradas por funcionalmente redundante TFs8. Finalmente, as interações são consideradas positivas em ensaios de eY1H quando pelo menos dois dos quatro colônias mostrar expressão repórter acima dos níveis de plano de fundo. No entanto, temos observado que ~ 90% das interações identificadas resultado de todas as quatro colônias correspondentes a um TF sendo positivo10,12,19.

Para ilustrar o tipo de resultados que podem ser obtidos usando ensaios eY1H nós selecionados nas regiões do promotor (2KB montante dos sites de início da transcrição) dos genes CCL15 e IL17F, contra uma matriz de 1.086 TFs humano (Figura 2). O promotor de CCL15 é um exemplo de uma não-autoactive DNA-isca onde interações, mesmo fracos, pode ser facilmente detectada (Figura 2A). O promotor de IL17F é um exemplo de uma autoactive DNA-isca com atividade de repórter de fundo irregular, onde algumas interações podem ser detectadas enquanto para TFs vários é incerto se a atividade de repórter é maior do que o fundo (Figura 2B).

Problemas que podem ser encontrados durante a execução de ensaios de eY1H

Embora o rastreio eY1H protocolo é direta e robusto, vários problemas podem ser encontrados durante a tela:

1) colônias são muito pequenas e não conseguir transferência (Figura 3A): embora espera-se que fermento expressando TFs exógeno pode exibir crescimento lento, dado que a expressão do gene de levedura pode ser prejudicado, tipicamente ~ 95% das colônias de TF-rapina Exibir normal crescimento. Se mais de 10% das colônias não crescem, as causas mais frequentes são problemas com a mídia ou com a transferência de levedura. Crescimento suboptimal frequentemente está relacionado com um dos meios de comunicação componentes perdendo atividade (por exemplo, uracil, histidina ou leucina), que pode ser resolvida através da elaboração de mídia fresca com soluções estoque frescas. Alternativamente, este também pode estar relacionado a uma fixação de deslocamento que afeta a transferência da colônia. Nesse caso, verifique se que as 1.536 almofadas pino centro das colônias fúngicas nas placas de fonte.

2) não há crescimento de levedura em uma parte da placa (Figura 3B): esse problema geralmente está relacionado com uma falha na etapa de acasalamento se a almofada de 1.536 pin não fizer contato com a levedura no gramado da estirpe de DNA-isca, a matriz TF, ou na placa de acasalamento. Em quase todos os casos, isto é devido ao nível de meios agar desigual durante placa derramamento ou devido a excessiva secagem da placa.

3) não há interações detectaram (Figura 3 e D): esta questão é muitas vezes relacionada com qualquer não intencionais inactivating mutações nos genes repórter, em particular LacZ (Figura 3), ou autoactivity alta que mascaram as interações (Figura 3D). para solucionar esse problema, recomenda-se uma outra estirpe independentemente obtido correspondente com o mesmo DNA-isca de tela.

4) a placa apresenta manchas azuis aleatórias (Figura 3E): esta questão é muitas vezes relacionada com a contaminação bacteriana. Para resolver esse problema, marcam o fermento para obter colônias individuais e repita a tela.

O acima são os problemas mais frequentes encontrados durante a execução de ensaios de eY1H. Outros problemas surgirem, preparando novos meios de comunicação, confirmando que as configurações apropriadas para o robô da HDA foram usadas, e testar múltiplas variedades por DNA-isca provavelmente resolveria a maioria dos problemas.

Figure 1
Figura 1 : Esboço de telas de ensaio eY1H. (A) comparação entre métodos TF-centrado e centrada no DNA para identificar as interações proteína-ADN. (B) esquema de ensaios eY1H. Uma sequência de DNA de interesse (promotor potenciador, silenciador, etc) clonado montante do repórter HIS3 e LacZ genes é integrado no genoma da levedura. A tensão resultante do DNA-isca é acoplada a uma coleção de cepas de leveduras, abrigando TFs fundido-se ao domínio de ativação Gal4 (AD). Interações positivas são determinadas pela capacidade da levedura a crescer sem histidina e superação inibidor competitivo 3-AT e virar azuis na presença de X-gal. (C) Pipeline para telas de eY1H. Um gramado de uma levedura DNA-isca estirpe cultivada em uma placa YAPD é acoplado em uma placa YAPD para uma matriz de 1.536 colônia expressando TFs fundido a AD crescida em um prato de −Trp Sc. Depois de um dia, o fermento é transferido para um −Trp −U de Sc para selecionar para levedura diploide. Após uma incubação de 2-3 dias, o fermento é transferido para um Sc −U −H −Trp + 3AT + X-galão placa (leitura) para identificar as interações proteína-ADN. Cada interação é testada em quatro exemplares.  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Exemplos de placas de leitura eY1H. (A) interações envolvendo o promotor da CCL15, uma isca de não-autoactive. Atividade de repórter de fundo para esta isca é baixa (reduzido crescimento na ausência de histidina e ausência de cor azul para TFs não interagindo). (B) interações envolvendo o promotor da IL17F, uma isca de autoactive. Atividade de repórter de fundo para esta isca é alta (crescimento na ausência de histidina e fundo azul cor em toda a placa) e desigual, tornando-se um desafio para identificar as interações proteína-ADN. Forte, médio e interações fracas são quadrado em vermelho, laranja e amarelo, respectivamente. Os nomes HGNC do TFs interagindo são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Problemas em telas de eY1H. (A) TF-presa de matriz onde várias colônias conseguiram crescer. (B) leitura da placa onde colônias no canto inferior esquerdo falhou a transferência. (C) tensão de Non-autoactive DNA-isca que não exibir interações positivas. (D) altamente autoactive DNA-isca estirpe que não exibe interações positivas. (E) placa de leitura exibindo várias colônias azuis devido à contaminação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Manchar uma matriz TF
Dia 1 Mancha de levedura na placa de Sc – Trp em formato de colônia de 96 (2.1 e 2.2)
Dia 4 Gerar a matriz TF 384 colônia (2.3)
Dia 6 Gerar a matriz TF 1.536 colônia (2.4)
Dia 9 Amplificar a matriz TF 1.536 colônia (2.5)
Preparando os gramados de estirpe de DNA-isca para acasalamento
Dia 6 Manchar o fermento linhagens de DNA-isca (3.1.1)
Dia 9 Fermento de raia, 12-16 cepas por placa (3.1.2)
Dia 10 Fermento de raia, 4 estirpes por placa (3.1.3)
Dia 11 Preparar os gramados de DNA-isca (3.1.4 e 3.1.5)
Acasalamento de levedura DNA-isca e cepas de matriz TF
Dia 12 Acasalamento em placas de YAPD (3.2)
Seleção de levedura diploide
Dia 13 Seleção de levedura diploide em placas de Sc – U – Trp (3.3)
Transferir para placas de leitura
Dia 15 Transferência de levedura diploide para placas de leitura (3.4)
Imagens de placas de leitura
Dias 17-22 Aquisição de imagens de placas de leitura dependendo do plano de fundo (3.5)

Tabela 1: Matriz TFF.

REAGENTE QUANTIDADE (para 2 L)
Abandono mistura sintética menos histidina, leucina, triptofano e uracila, adenina, rica (2 g) sem o nitrogênio levedura base 2,6 g
Nitrogênio levedura base sem aminoácidos e sem sulfato de amônio (YNB) 3,4 g
Adenina hemisulfate dihidrato 160 mg
Sulfato de amônio 10 g
Ágar-ágar 35 g
Glicose (40%, p/v) em água estéril, 100 mL
Leucina (100 mM), estéril filtrada 16 mL
Triptofano (40mm), estéril filtrado 16 mL

Tabela 2: Reagente lista I.

REAGENTE QUANTIDADE (para 2 L)
Peptona 40 g
Extrato de levedura 20 g
Adenina hemisulfate dihidrato 0,32 g
Glicose (40%, p/v) em água estéril, 100 mL
Ágar-ágar 35 g

Tabela 3: Lista de reagente II.

REAGENTE QUANTIDADE (para 2 L)
Abandono de mistura sintética menos histidina, leucina, triptofano e uracila, adenina rico (2G) sem o nitrogênio levedura base 2,6 g
Nitrogênio levedura base sem aminoácidos e sem sulfato de amônio (YNB) 3,4 g
Adenina hemisulfate dihidrato 160 mg
Sulfato de amônio 10 g
Ágar-ágar 35 g
Glicose (40%, p/v) em água estéril, 100 mL
Leucina (100 mM), estéril filtrada 16 mL
Histidina (100 mM), estéril filtrada 16 mL
Uracilo (20mm), estéril filtrado (omitir para placas de Trp – Sc – U) 16 mL

Tabela 4: Reagente lista III.

REAGENTE QUANTIDADE (para 2 L)
Abandono de mistura sintética menos histidina, leucina, triptofano e uracila, adenina rico (2G) sem o nitrogênio levedura base 2,6 g
Nitrogênio levedura base sem aminoácidos e sem sulfato de amônio (YNB) 3,4 g
Adenina hemisulfate dihidrato 160 mg
Sulfato de amônio 10 g
Ágar-ágar 35 g
Glicose (40%, p/v) em água estéril, 100 mL
10 x BU sais 200 mL
Leucina (100 mM), estéril filtrada 16 mL
3AT (2m), filtrado estéril 5 mL
X-gal em DMF (80 mg/mL) 4 mL

Tabela 5: Lista de reagente IV.

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Discussion

A abordagem eY1H robótico acasalamento triagem descrita aqui grandemente aumenta o throughput para identificar o conjunto de TFs que se ligam a uma região de DNA de interesse, em comparação com o anterior rastreio de biblioteca ou triagem matriz abordagens baseadas na transformação. Além disso, as interações de TF-DNA detectadas pelo eY1H ensaios são altamente reprodutíveis como 90% das interações detectadas são positivos para todos os quatro colônias testado por TF, e 90% das interações reteste em uma tela independente do mesmo fermento DNA-isca tensão10 , 12 , 19. mais importante, interações TF-DNA detectadas pelo eY1H validar a uma taxa de 40%-70%, quando testado em humanos repórter ensaios12,20, em células humanas primárias (resultados não publicados) e em animais nocaute de c. elegans 11. esta é uma taxa de validação semelhantes às observadas em ChIP-seq dados21.

Embora interações identificadas por eY1H são altamente reprodutíveis quando reexaminar o mesmo fermento estirpe de DNA-isca, testando diferentes cepas de leveduras para o mesmo DNA-isca às vezes produz diferentes, embora se sobrepõem, conjuntos de interações TF-DNA. Isto é geralmente devido a diferenças na atividade de repórter de fundo entre cepas. Além disso, testes de fragmentos de uma sequência de DNA resulta na detecção de interações de TF-DNA mais do que testar a sequência completa, em particular quando fragmentos sobrepostos são testados. Isto pode estar relacionado com o ensaio, sendo mais eficiente na identificação de interações que aproximam-se os promotores mínima de repórter, e porque o teste sobreposição fragmentos reduz as chances de que um sítio de ligação pode ser obstruído por nucleosomes fermento. Assim, para projetos de pequena escala, é recomendável que sobreposição 0,5 – 1 kb de fragmentos de uma região reguladora são testados e que duas linhagens independentes são projectadas para cada sequência de DNA-isca8.

Existem várias etapas críticas no eY1H triagem protocolo para evitar alguns dos problemas apresentados na Figura 3. Em primeiro lugar, embora a maioria dos ingredientes de mídia são estáveis por vários meses (exceto 3AT e X-gal), falta de crescimento de colônia adequada provavelmente indica que pelo menos um dos ingredientes pode ter perdido a atividade e deve ser substituído. Em segundo lugar, é importante preparar as placas retangulares, para que o agar é nivelado e para que eles não seque por mais de um dia evitar o fracasso na fixação ao usar a plataforma robótica. Finalmente, é a chave para usar os programas de plataforma robótica conforme indicado no protocolo (revisitar, reciclar, mistura, etc.) para o fermento a ser transferido, efetivamente, para acasalamento para ser eficiente e para evitar a contaminação cruzada entre clones de levedura.

Os exemplos selecionados para ilustrar o uso de telas de eY1H correspondem aos promotores de genes humanos. No entanto, outras regiões reguladoras também podem ser testados incluindo enhancers e silenciadores. Por exemplo, usamos eY1H ensaios para avaliar a vinculação TF a potenciadores do desenvolvimento humanos e c. elegans primeiro intrões12,22. Além disso, dado que as interações são testadas de forma emparelhada, ensaios de eY1H podem ser usados para comparar as interações entre as variantes não-codificantes e entre variantes de sequência codificação TF. Por exemplo, usar eY1H ensaios identificamos alterado vinculação TF para 109 variantes não-codificante associados a doenças genéticas diferentes e também perfis de interações diferencial para TF 58 mutações missense12,14. Embora este protocolo centra-se na avaliação de vinculação de TF para regiões reguladoras humanas, regiões do DNA de outras espécies também podem ser testadas desde que um TF-presa está disponível, ou pode ser gerada. Com efeito, TF-rapina matrizes foram gerados para o c. elegans10 Drosophila melanogaster23, Mus musculus,24,25,de Arabidopsis thaliana26, e Zea mays 27. assim, com recursos cada vez mais disponíveis, ensaios de eY1H podem ser aplicados aos sistemas adicionais.

Embora eY1H ensaios têm sido fundamentais para identificar o repertório do TFs que ligam para diferentes regiões reguladoras na espécie humana e outro, não são livres de advertências8,11,12,19 ,20,25. Uma das limitações é que as interações são testadas no meio do núcleo fermento e, embora as DNA-iscas são chromatinized, a estrutura da cromatina em levedura pode não refletir a estrutura da cromatina na espécie de onde originou o DNA-isca e não refletirá as diferenças de tipo de célula observadas in vivo. Assim, interações identificadas pelos ensaios de eY1H devem ser validadas no repórter ou outros ensaios funcionais. De nota, nós e os outros têm encontrado interações TF-DNA detectadas pelo eY1H validar a uma taxa de 40%-70% em ensaios funcionais11,12,20,23. Outra limitação dos ensaios de eY1H é que ele não pode detectar interações envolvendo TFs que requerem modificações borne-translational ausente no fermento para ligar ao DNA, TFs que não são devidamente dobrado no fermento quando fundido ao anúncio e TFs que estão faltando da matriz 8. Além disso, no atual formato, eY1H ensaios não detectar interações envolvendo heterodimérica TFs, como cada colônia de levedura na matriz TF exprime uma única TF-presa. Assim, ainda mais melhorias no ensaio irão aumentar a amplitude do TFs que podem ser testados e ampliar os recursos de eY1H de ensaios para identificar novas interações TF-DNA

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [R35-GM128625 de J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

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References

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Fator de transcrição de um híbrido Y1H genética edição 144 levedura humanos eY1H de regulamento DNA gene
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Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

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