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Genetics

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 > 1000 TFs 단일 실험에서.

Abstract

각 인간의 유전자를 조절 하는 전사 인자 (TFs)의 집합을 확인 하는 것은 수많은 실험과 전산 접근을 통합 발굴 작업입니다. 하나 이러한 방법은 효 모 한 하이브리드 (Y1H) 분석 결과, TFs와 DNA 사이 어떤 상호 작용 지역 리포터 유전자를 사용 하 여 효 모 핵의 환경에서 테스트 합니다. 두 가지 구성 요소를 포함 하는 Y1H 분석 실험:는 ' DNA-미끼 ' (예., 발기인, 증강, 달 았 죠, 등)와 ' TF-먹이,' 취재 원 유전자 활성화에 대 한 상영 될 수 있는. Y1H 스크린을 수행 하기 위한 가장 게시 프로토콜 DNA 미끼 효 모 종자로 TF 먹이 라이브러리 또는 배열 변환 기반으로 합니다. 여기, 우리는 파이프라인 기술, 향상 된 Y1H 이라고 (eY1H) 분석 실험, TF DNA 상호 작용 고밀도 어레이 사용 하 여 TF 먹이 긴장의 기준점과 컬렉션으로 DNA 미끼 긴장 짝짓기에 의해 심문 하는 1536에서 심사를 허용 (HDA) 로봇 플랫폼 식민지 형식입니다. 이로써 처리량의 극적인 증가 (60 DNA 미끼 시퀀스에 대 한 > 1000 TFs 연구원 당 2 주 소요) 및 재현성. 우리는 스크린 및 그들을 해결 하는 방법 하는 동안 발생할 수 있는 문제의 예제로 서 1,086 인간의 TFs의 배열에 대 한 인간의 발기인 시퀀스를 테스트 하 여 예상된 결과의 종류를 설명 합니다.

Introduction

생물 의학 분야에서 주요 문제는 각 인간의 유전자는 규제 메커니즘을 결정 하 고. 전사 유전자 식 수준을 제어 하는 첫 번째 단계 이며 고유한 각 유전자 녹음 방송 요인 (TFs)의 세트에 의해 통제 된다. 그 인 간에 대 한 인코딩 > 1500 TFs1,2, 각 유전자의 표현을 제어 하는 TFs의 완전 한 세트를 식별 오픈 도전 남아 있다.

두 가지 유형의 방법 TF DNA 상호 작용 지도를 사용할 수 있습니다: TF를 중심으로 하 고 DNA를 중심으로 방법3 (그림 1A). TF를 중심으로 방법에 관심의 TF genomic DNA 영역 또는 그것의 DNA 의무적인 특이성을 결정 하는 바인딩에 대 한 조사입니다. 이 방법은 높은 처리량 시퀀싱, 단백질 바인딩 microarrays 그리고 SELEX4,,56다음 chromatin immunoprecipitation (칩)를 포함 합니다. DNA 중심 방법에 관심사의 DNA 순서 DNA 시퀀스에 바인딩할 TFs의 세트를 결정 하기 위해 시험 되 다. 이러한 방법 중 가장 널리 적용 되는 효 모 한 하이브리드 (Y1H) 분석 실험, TFs와 DNA 사이 어떤 상호 작용 지역 리포터 유전자7,,89를 사용 하 여 효 모 핵의 환경에서 테스트.

두 가지 구성 요소를 포함 하는 Y1H 분석 실험:는 ' DNA-미끼 ' (예를 들면, 발기인, 증강, 달 았 죠, 등)와 ' TF-먹이,' 취재 원 유전자 활성화9,10 (그림 1B)에 상영 될 수 있는. DNA-미끼를 업스트림 복제 두 기자의 유전자 (LacZ HIS3)와 두 DNA bait::reporter 구조는 chromatinized 'DNA-미끼 긴장'을 생성 하는 효 모 게놈으로 통합 TF-먹이, TF Gal4 TF, 효 모의 활성화 도메인 (AD) 융합을 표현 하는 플라스 미드에 인코딩된 TF DNA 상호 작용에 대 한 물고기 미끼 DNA 스트레인에 소개 된다. TF-먹이 미끼 DNA 시퀀스에 바인딩하는 경우 TF 먹이 광고 두 리포터 유전자의 활성화로 끌 것입니다. 결과적으로 긍정적인 상호 작용으로 세포 성장 판 히스티딘, 부족으로 극복 하 고 경쟁력 있는 억제제, 3-아미노-1,2,4-triazole (3-AT)에 대해 선택 하 고 X-여자의 블루 식민지로 시각 수 수 있습니다. 때문에 강력한 효 모 Gal4 광고 사용, Y1H 분석 transcriptional 활성 제 뿐만 아니라 repressors를 포함 하는 상호 작용을 검색할 수 있습니다. 더하여, TF 먹이 강한 효 모 발기인 (ADH1)에서 표현, 그 상호 작용 수치가 낮은 생 식, 도전 칩11,12로 감지 하는 TFs에도 감지할 수 있습니다.

Y1H 분석 실험을 수행 하기 위한 가장 게시 프로토콜 다음 선택, 식민지, 및 상호 작용 TF를 식별 하는 시퀀스 또는 풀링된 TF 먹이 라이브러리를 변환 하 여 효 모 DNA 미끼 종자에 TF-먹이 도입 기반 개별 변형 복제8,9. 이들은 시간이 걸리는 프로토콜, 연구원 당 테스트할 수 있는 DNA 시퀀스의 수를 제한 합니다. Y1H 분석 실험, 이라는의 최근 개선 향상 Y1H (eY1H), 극적으로 각각 표현 하는 다른 효 모 종자의 컬렉션으로 효 모 DNA 미끼 종자 짝 고밀도 배열 (HDA) 로봇 플랫폼을 사용 하 여 심사 처리량을 증가 했다 TF-먹이10,13 (그림 1C). 이 화면만 세 접시를 사용 하 여 quadruplicate에서 가장 인간의 TFs를 테스트 수 있도록 1,536 식민지 형식을 사용 합니다. 또한, TF DNA 상호 작용 없음을 방식 테스트는이 이렇게 상호 작용 (예: 2 개의 noncoding 단일 뉴클레오티드 이체) DNA 미끼 및 다른 TFs 비교에 대 한 허용 또는 TF 변종11,12 ,14.

EY1H 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 구분 된 큰 인간, 꼬마 선 충 DNA를 중심으로 TF-DNA 상호 작용 네트워크 최신. 특히, 우리는 246 인간의 발달 강화 및 283 TFs12사이의 2230 상호 작용을 확인 했습니다. 또한, 우리 eY1H 분석 실험 변경된 TF 바인딩을 109 단일 뉴클레오티드 noncoding 변종 발달 기형, 암, 신경 질환 등 유전 질병와 관련 된 폭로를 고용 했다. 더 최근에, 사용 eY1H을 2576 C. 선 충 유전자 발기인 및 366 TFs11사이 21,714 상호 작용으로 구성 된 네트워크를 나타냅니다. 이 네트워크는 수십 선 충 C. TFs의 기능 역할을 밝히기 위해 쓸모 있었다.

DNA-미끼 얼룩을 생성 하 고 배경 기자 활동의 수준을 평가 프로토콜 되었습니다 다른15,,1617보고. 여기는 1,086 인간의 TFs의 배열에 대 한 모든 인간 게놈 DNA 영역을 화면에 사용할 수 있는 eY1H 파이프라인에 설명 합니다. 효 모 DNA 미끼 변형 생성 되 고 TF 먹이 배열의 해당 접시에 발견, 일단 전체 프로토콜 2 주 (표 1)에서 수행할 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 프로토콜 단일 연구원 60 DNA 미끼 시퀀스를 동시에 화면 수 있도록 병렬화 할 수 있습니다. 프로토콜을 설명 하기 위해 우리는 CCL15와 IL17F 두 cytokine 유전자의 발기인 상영. 또한, 우리는 종류의 eY1H 분석 실험 및 그들을 해결 하는 방법을 수행할 때 발생할 수 있는 문제를 설명 하기 위해 실패 한 화면에서 결과 보여줍니다.

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Protocol

1입니다. 준비

  1. Sc −U −H 플레이트 (150 mm 페 트리 접시)
    참고: 이 접시는 성장 DNA 미끼 효 모 종자에 대 한 사용 됩니다.
    1. 드롭 아웃 믹스, 효 모 질소 기지 (YNB), 아데닌 hemisulfate와 물, 그리고 pH 5 M NaOH (약 미디어의 리터 당 1 mL, 구성에 대 한 표 2 참조)와 5.9의 920 mL에 황산 암모늄을 디졸브. 2 L 플라스 크에 부 어와 볶음 바 추가.
    2. 두 번째 2 L 플라스 크에 950 mL의 물에는 agar 추가 (추가 하지 않으면 저 어 바는 압력솥에 끓여 한 천 발생할 것입니다).
    3. 고압 액체 사이클에 15 psi에서 40 분.
    4. 즉시 플라스 크를 포함 한 천으로 저 어 바를 포함 하 여 첫 번째 플라스 크의 내용을 붓는 다. 포도 당, 추가 잘 저 어 접시에 섞어 고 물 욕조에 55 ° C에 냉각.
    5. 언론에는 신 고는 트립토판을 추가 합니다. 잘 저 어 접시에 혼합 하 고 150 m m 멸 균 페 트리 접시 (접시 당 ~ 80 mL)에 부 어. 실 온에서 3-5 일 동안 건조, 비닐 봉투에서 포장 하 고 최대 6 개월 동안 상 온에서 저장.
  2. YAPD 직사각형 플레이트
    참고: 이 접시는 DNA 미끼 스트레인 및 TF 배열 컬렉션 짝짓기 잔디 성장에 대 한 사용 됩니다.
    1. 분말 (구성 표 3 참조), 한 천, 제외 2 L 플라스 크에 물 950 mL에 녹이 고 저 어 바 추가.
    2. 두 번째 2 L 플라스 크에 950 mL의 물에는 agar 추가 (추가 하지 않으면 저 어 바는 압력솥에 끓여 한 천 발생할 것입니다).
    3. 고압 액체 사이클에 15 psi에서 40 분.
    4. 즉시 플라스 크를 포함 한 천으로 저 어 바를 포함 하 여 첫 번째 플라스 크의 내용을 붓는 다.
    5. 포도 당, 추가 믹스 잘 저 어 접시와 멋진 55 ° c 직사각형 접시에 미디어를 붓고 ( 재료의 표를참조; 접시 당 ~ 70 mL) 연동 펌프 (5 mL/sec)와 6 mm 튜브를 사용 하 여. 실 온에서 1 일 건조 비닐 봉지에 포장 하 고 최대 6 개월까지 콜드 룸에 있는 저장.
      참고: 비록 제안 된 미디어 볼륨은 접시 당 70 mL, 접시 당 50-80 mL 사용할 수 있습니다. 고려 때 붓는 접시 1에 3 개의 중요 한 문제) 그들은 한 미디어는 접시에 걸쳐 동일한 두께 파괴는 (격판덮개 쏟아져 대 한 수준별된 테이블 또는 표면 사용 하 고 이상 7 접시의 부 어 하지 않습니다) 2)는 agar에 거품의 부재를 보장 하기 위해 미디어 (거품 해야 될 팝 무 균 바늘을 사용 하 여), 및 3)만 하루 동안 접시를 건조 하 고 번호판을 고정 하는 효 모에 실패를 피하기 위해 비닐 봉지에 포장.
  3. Sc −Trp 및 Sc −U −Trp 직사각형 플레이트
    참고: 이 접시는 TF 배열 컬렉션 (Sc −Trp) 성장 (Sc −U −Trp) 짝짓기 후 2 중 누 룩을 선택 하 고 사용 됩니다.
    1. 드롭 아웃 믹스, YNB, 아데닌 hemisulfate, 그리고 물, 그리고 5.9 NaOH 5 M (미디어의 리터 당 약 1 mL)와 pH의 920 mL에 황산 암모늄 분해 (구성 표 4 참조). 2 L 플라스 크에 부 어와 볶음 바 추가.
    2. 두 번째 2 L 플라스 크에 950 mL의 물에는 agar 추가 (추가 하지 않으면 저 어 바는 압력솥에 끓여 한 천 발생할 것입니다).
    3. 고압 액체 사이클에 15 psi에서 40 분.
    4. 즉시 플라스 크를 포함 한 천으로 저 어 바를 포함 하 여 첫 번째 플라스 크의 내용을 붓는 다. 포도 당, 추가 잘 저 어 접시에, 혼합 하 고 55 ° c에 냉각
    5. 추가 신, 히스티딘, uracil (Sc −U −Trp 격판덮개 uracil 생략).
    6. 잘 저 어 접시에 혼합 및 직사각형 플레이트 (접시 당 ~ 70 mL)에 부 어 연동 펌프 (5 mL/sec)와 6 m m 튜브를 사용 하 여. 건조 한 실내 온도에 1 일, 비닐 봉투, 접시 포장 및 최대 3 개월까지 콜드 룸에 있는 저장.
  4. Sc −U −H −Trp + 3AT + X gal 직사각형 플레이트
    참고:     이 번호판 eY1H 분석 실험에 대 한 판독 판으로 사용 됩니다.
    1. 드롭 아웃 믹스, YNB, 아데닌 hemisulfate, 및 물의 850 mL에 황산 암모늄 분해 (구성 표 5 참조). 전화 하지 마십시오. 2 L 플라스 크에 부 어와 볶음 바 추가.
    2. 두 번째 2 L 플라스 크에 850 mL의 물에는 agar 추가 (추가 하지 않으면 저 어 바는 압력솥에 끓여 한 천 발생할 것입니다).
    3. 고압 액체 사이클에 15 psi에서 40 분.
    4. 물 900 mL, 나2HPO4∙7H2O, 70 g, NaH2포4∙H2볶음 막대를 사용 하 여 분말을 녹이 고 5 M NaOH를 사용 하 여 7.0에 pH를 조정 하는 오 믹스의 34.5 g 결합 하 여 배 부 소금 (1 리터)를 준비 합니다. 물을 1 리터와 오토 클레이 브를 추가 합니다.
    5. 포함 하는 디 메 틸 formamide의 42.5 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 X-여자 분말의 3.5 g를 추가 하 여 gal X 솔루션을 준비 합니다. 더 쉽게 분해 하 디 메 틸 formamide X 여자 분말 추가 (이 분 소요). (사용 불투명 50 ml 튜브 또는 호 일에 커버) 어둠 속에서 재고 솔루션을 유지. -20 ° c.에 게
    6. 즉시 플라스 크를 포함 한 천으로 저 어 바를 포함 하 여 첫 번째 플라스 크의 내용을 붓는 다. 포도 당 추가 10 부 소금 (조성 표 5 참조), 배 잘 저 어 접시에, 혼합 그리고 55 ° c에 냉각
    7. 신, 3AT, 및 X-여자 (구성에 대 한 표 5 를 참조)를 추가 합니다.
    8. 잘 저 어 접시에 혼합 및 직사각형 플레이트 (접시 당 ~ 70 mL)에 부 어 연동 펌프 (5 mL/sec)와 6 mm 튜브를 사용 하 여. 실 온에서 1 일 건조, 비닐 봉투에서 포장 및 알루미늄 호 일에 덮여 추운 방에 저장 (3AT 및 X-여자는 빛에 민감한) 최대 1 개월.

2. 안보 TF 배열

  1. TF-먹이 배열 녹고
    1. 얼음에 TF 먹이 배열 효 모 글리세롤 주식 접시 녹여
      참고: 이전에 게시10,12,,1318TF 먹이 어레이 생성할 수 있습니다.
    2. 다음 단계는 전에 1-3 분 이내 12 채널 피 펫을 사용 하 여 효 모 resuspend
  2. 직사각형 플레이트 Sc −Trp에 누 룩을 보 이나
    1. HDA 로봇에서 소스, 대상, 그리고 96 긴 핀 패드 96 한 천 배지 ( 재료의 표참조) 선택 다 잘 96 접시.
      참고: 핀 패드는 재사용 하지 않으며 무시 해야 합니다.
    2. 96 잘 접시 당 두 개의 복사본을 만들기 위해 많은 복제 프로그램을 선택 합니다. 사용 하는 재활용 하거나 냉동 주식 다시 오염을 방지 하는 옵션을 다시 마십시오.
    3. 누 룩을 섞어 소스에 아래로 소용돌이를 옵션을 선택 합니다.
    4. 가방 발견된 배열 하 고 2-3 일 동안 30 ° C에서 최대 천-사이드를 품 어.
  3. 사우스 캐롤라이나 −Trp 직사각형 접시에 384 식민지 배열 생성
    1. 로봇에서 소스, 대상, 384 천 배지 및 96 짧은 핀 패드 96 한 천 배지를 선택 합니다.
    2. 1:4 배열 프로그램을 선택 합니다. 이 방법에서는, 4 96 식민지 접시 (각 포함 하는 다른 TF) 한 384 식민지 접시로 통합 됩니다. 재활용을 사용 하 여 또는 다른 판 사이의 오염을 방지 하는 옵션을 다시 방문 하지.
    3. 판 가방 하 고 2 일 동안 30 ° C에서 최대 발견된 384-식민지 배열 한 사이드를 품 어.
  4. 사우스 캐롤라이나 −Trp 직사각형 플레이트에서 1,536 식민지 배열 생성
    참고: 이 각 TF 먹이 대 한 4 개의 식민지를 포함 하는 배열 발생 합니다.
    1. 로봇에서 소스, 대상,으로 1,536 한 천 배지 및 384 짧은 핀 패드 384 한 천 배지를 선택 합니다.
    2. 1:4 분석 결과 단일 소스 프로그램을 선택 합니다. 목표는 quadruplicates를 4 개의 식민지 각 식민지를 복사 하는 것입니다. 재활용을 사용 하 고 그것은 복사 4 번 각 식민지 수반으로 옵션을 다시.
    3. 판 가방 하 고 3 일 동안 30 ° C에서 최대 발견된 1536-식민지 배열 한 사이드를 품 어.
  5. 사우스 캐롤라이나 −Trp 직사각형 접시에 1,536 식민지 배열 증폭
    1. 로봇에서 소스, 대상,으로 1,536 한 천 배지 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다.
    2. 3-4 부 복제 복제 많은 프로그램을 선택 합니다. 재활용을 사용 하 여 옵션을 다시 하지만 교차 오염을 피하기 위하여 배열의 다른 접시에 전환할 때 패드에 밖으로 던져.
    3. 판 가방 하 고 짝짓기 단계 (아래 참조) 사용 하 여 3 일 동안 30 ° C에서 최대 발견된 1536-식민지 배열 한 측을 품 어. 그 후, 심사의 새로운 라운드에 대 한 일 후에 다시 사용 실내 온도 복사에서 번호판을 유지.

3. eY1H 화면

  1. DNA-미끼 스트레인 잔디 짝짓기에 대 한 준비
    1. 효 모 DNA 미끼 긴장 Sc −U −H 접시에 고 30 ° c.에 3 일 동안 성장
    2. 각 접시 12-16 다른 긴장에 맞도록 15 cm 살 균 이쑤시개를 사용 하 여 Sc −U −H 플레이트에 누 룩을 행진. 1 일 30 ° c.에 품 어
    3. 각 접시에 맞도록 4 가지 변종이 Sc −U −H 플레이트 메 마른이 쑤 시 게를 사용 하 여 15 cm에 누 룩을 행진. 30 ° c.에 1 일 동안 품 어
    4. 효 모 살 균 이쑤시개, 어떤 agar를 긁 고 살 균 물의 500 µ L 1.5 튜브에 추가 하지 않도록 만들기를 사용 하 여 다쳤어요.
    5. 10-15 불 임 유리 구슬 YAPD 사각형 접시에 추가 합니다. 접시에 효 모 현 탁 액을 추가 하 고 누 룩 모든 격판덮개를 통해 서 전염 됩니다 보장 하기 위해 1 분에 대 한 모든 방향에서 철저 하 게 흔들어.
    6. 접시를 즉시 반전 하 고 뚜껑에 비즈가 되도록 누릅니다. 제거 하 고 구슬을 재활용.
    7. 판 가방 및 30 ° c.에 1-2 일 동안 아래로 천 쪽을 품 어 다음 짝짓기 단계를 진행 합니다.
  2. 효 모 DNA 미끼 및 TF 배열 긴장의 짝짓기
    1. 로봇으로 TF 배열 YAPD 직사각형 접시에 전송. 소스 및 대상 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다. 많은 복제 프로그램을 선택 합니다. 각 TF 배열 판 (배열에 있는 접시의 수)에 따라 3-4 YAPD 번호판을 사용할 수 있습니다. 짝짓기에 사용 되는 TF 배열 접시 2-3 일 하지만 짝짓기로 더 효율적일 수 있습니다.
    2. 이미 로봇 TF 배열을 포함 하는 YAPD 번호판 DNA 미끼 스트레인의 잔디를 전송 합니다. 소스 및 대상 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다. 많은 복제 프로그램을 선택 합니다. ~0.6 밀리미터의 반경으로 소스에서 임의 오프셋을 사용 하 여 같은 자리에서 효를 복용 하지 않도록 하 고 효 모 종자 사이 접촉을 촉진 하기 위하여 목표에 혼합. DNA 미끼 긴장 (3.1 단원)를 포함 하는 소스로, 잔디를 사용 하 고 TF 배열을 포함 하는 YAPD 접시 단계 대상으로 3.2.1에서에서 발견.
    3. 판 가방 하 고 1 일 30 ° C에서 최대 천-사이드를 품 어.
  3. 선택 2 중 효
    1. 로봇으로 YAPD 격판덮개에서 Sc −U −Trp 플레이트 성관계 누 룩을 전송. 소스 및 대상 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다. 복제 프로그램을 선택 합니다. 대상 및 소스에 섞는다.
    2. 판 가방 하 고 (더 이상 외피 리드 높은 배경 기자 활동) 2-3 일 동안 30 ° C에서 최대 천-사이드를 품 어.
  4. 판독 판 전송
    1. 전송 2 중 효 모 Sc −U −Trp 판에서 판독 직사각형 접시 Sc −U −H −Trp + 5mm 3AT + 0.4 m m X-여자 로봇을 사용 하 여. 소스 및 대상 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다. 복제 프로그램을 선택 합니다.
    2. 판 가방 하 고 최대 7 일 동안 30 ° C에서 최대 천-사이드를 품 어.
  5. 판독 판 영상
    1. DNA-미끼 긴장 높은 배경 기자 활동, 2, 3, 4 일에 사진을 걸릴. 그렇지 않으면, 4 및 7 일에서 사진을 찍을. 긍정적인 상호 작용 효 모 식민지의 성장 및 파랑 색으로 식별 하 고 수동으로 결정 될 수 있다, 또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 확인할 수 있습니다.

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Representative Results

때 eY1H 분석 실험에서 결과 분석 세 가지 주요 요소를 고려 한다: DNA-미끼 긴장의 배경 기자 활동, TF DNA 상호 작용, 및 긍정적인 식민지의 수에 해당 하는 기자 활동의 강도. DNA-미끼 긴장의 배경 기자 활동 (즉, autoactivity) 전반적인 성장 및 판독 접시 TF 먹이의 부재에도 효 모 식민지의 색상을 말합니다. 이상적으로, 비 autoactive 긴장 표시 배경 흰색 또는 밝은 갈색 색상, 긍정적인 상호 작용에 대 한 식민지 되는 크고 푸른. Autoactive DNA-미끼 종자 미디어 히스티딘과 DNA 미끼8효 모 transcriptional 활성의 바인딩 관련 가능성이 있는 접시에 있는 모든 식민지에 대 한 X-여자의 파란색에에서 효 모 성장을 보여줍니다. 기자 활동 감지 TF DNA 상호 작용에 해당 (즉, 식민지의 크기) 및 파란색의 강도 강도 선호도, 효 모에 TF 식 수준, 바인딩 사이트 및 거리의 수 많은 매개 변수에 따라 달라 집니다. 효 모 최소한의 발기인에 있는 취재 원 유전자와 DNA 미끼 긴장의 배경 기자 활동의 업스트림. 예를 들어 약한 상호 작용을 낮은 배경 미끼에 쉽게 검출 될 수 있지만 autoactive 또는 고르지 못한 배경 미끼에 감지 하기 어려울 수 있습니다. 기자 활동을 주의 하는 효 모에 수준 할 하지 반드시 연관 chromatin 구조로 인간 세포에서 규제 활동 nucleosome 위치, 및 거리 효과 효 모 사이 다른 중요 하 고 인간 이기도 합니다. 또한, 인간의 상호 작용 다른 TFs와 cofactors의 바인딩에 의해 영향을 받을 가능성이 또는 기능적으로 중복 TFs8마스크 될 수 있습니다. 마지막으로, 경우 4 식민지의 적어도 2 배경 수준 이상의 기자 식 상호 작용 eY1H 분석 실험에서 긍정적인 간주 됩니다. 그러나, 우리는 상호 작용의 ~ 90%에 해당 되 고 긍정적인10,,1219TF 하 모든 4 개의 식민지에서 결과 확인 관찰.

EY1H 분석 실험을 사용 하 여 얻을 수 있는 결과의 종류를 설명 하기 위해 우리가 1,086 인간의 TFs (그림 2)의 배열에 대 한 CCL15와 IL17F 유전자의 발기인 지구 (2 kb 상류 녹음 방송 시작 위치의) 상영. CCL15 발기인은 예 상호 작용도 비 autoactive DNA-미끼의 약한 것 들, 쉽게 수 감지 (그림 2A). IL17F 발기인 여러 TFs에 대 한 불확실 하다 기자 활동 인지 배경 (그림 2B) 보다 높은 반면 일부 상호 작용을 감지 수 있는 고르지 못한 배경 기자 활동, autoactive DNA-미끼의 예입니다.

EY1H 분석 실험을 수행할 때 발생할 수 있는 문제

비록 심사 eY1H 프로토콜은 스트레이트-앞으로 하 고 강력한, 화면 동안 여러 가지 문제를 발생할 수 있습니다:

1) 식민지는 너무 작은 전송 (그림 3A): 효 모 유전자 발현 dysregulated 수 있습니다 그 외 인 TFs 표현 몇 가지 효 모를 느린 성장을 표시 될 수 있습니다 예상 된다, 비록 일반적으로 TF 먹이 식민지의 ~ 95% 표시 정상 성장입니다. 식민지의 10% 이상 성장 실패, 가장 빈번한 원인은 미디어 또는 효 모 전송 문제. 차선의 성장 자주 지는 신선한 재고 솔루션 신선한 미디어를 준비 하 여 해결 될 수 있는 활동 (예를들면, uracil, 히스티딘, 또는 신), 미디어 구성 요소 중 하나에 관련 되어 있습니다. 또는,이 식민지 전송에 영향을 미치는 고정 오프셋에 관련도 있습니다. 이 경우에, 1,536 패드 소스 접시에 효 모 식민지의 중심 핀을 확인 합니다.

(그림 3B) 판의 부분에 2) 효 모 성장: 1,536 핀 패드를 만드는 데 실패 하는 경우이 문제는 일반적으로 짝짓기 단계에서 실패와 관련 된 DNA-미끼 스트레인 잔디밭, TF 배열 또는 짝짓기 접시에 효 모와 접촉. 거의 모든 경우에이 플레이트 붓는 동안 고르지 agar 미디어 수준 또는 인해 과도 한 건조는 격판덮개의.

3) 아무 상호 작용 (그림 3C 와 D) 감지: 리포터 유전자의 특정 LacZ (그림 3C), 중 의도 하지 않은 inactivating 돌연변이 또는 상호 작용 (그림 마스크 높은 autoactivity이이 문제 관련 자주는 3D).이 문제를 해결 하려면 것이 좋습니다 다른 독립적으로 얻은 스트레인 같은 DNA 미끼에 해당 화면을.

4) 접시 선물 무작위 푸른 반점 (그림 3E):이 문제는 종종 세균 오염에 관련 된. 이 문제를 해결 하려면 개별 식민지를 누 룩을 행진 하 고 화면을 반복 합니다.

위의 eY1H 분석 실험을 수행할 때 발생 하는 가장 빈번한 문제는. 해야 다른 문제가 발생, 새로운 미디어 준비, HDA 로봇에 대 한 적절 한 설정을 사용 되었다, 및 DNA 미끼 당 여러 긴장 테스트 가능성이 대부분 문제를 해결할 것을 확인 합니다.

Figure 1
그림 1 : EY1H 분석 결과 화면 개요. (A) 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하기 위해 TF를 중심으로 하 고 DNA를 중심으로 방법 사이 비교. EY1H 분석 실험의 (B) 회로도. (발기인, 증강, 소음 기, 등) 관심사의 DNA 순서 복제 상류 HIS3 LacZ 기자의 유전자 효 모 게놈으로 통합 됩니다. 은닉 TFs Gal4 활성화 도메인 (AD)에 융합 하는 효 모 종자의 컬렉션에 결과 DNA 미끼 스트레인 성관계. 긍정적인 상호 작용 3-AT, 히스티딘과 경쟁 억제 물 극복 없이 성장 하는 누 룩의 능력에 의해 결정 됩니다 하 고 X-여자의 푸른색. EY1H 스크린 (C) 파이프라인. 효 모 DNA 미끼 스트레인 YAPD 접시에 성장 잔디 TFs Sc −Trp 접시에 성장 하는 광고를 융합을 표현 하는 1,536 식민지 배열에 YAPD 격판덮개에 성관계. 어느 날, 후 누 룩 2 중 효 모에 대 한 선택 하려면 Sc −U −Trp로 전송 됩니다. 2-3 일 부 화 후 누 룩 Sc −U −H −Trp + 3AT + X gal 플레이트 (판독 판) 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하기 위해 전송 됩니다. 각 상호 작용은 quadruplicate에서 테스트 됩니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : EY1H 판독 접시의 예. (A) 상호 작용 CCL15, 비 autoactive 미끼의 발기인을 포함. 이 미끼에 대 한 배경 기자 활동은 낮은 (비 작용 TFs 히스티딘 및 블루 색상의 부재의 부재에서 성장 감소). (B) IL17F, autoactive 미끼의 발기인과 관련 된 상호 작용. 이 미끼에 대 한 배경 기자 활동은 높은 (히스티딘 및 배경 부재에서 성장의 블루 컬러 접시에 걸쳐) 및 고르지 못한, 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 도전 그것을 만들기. 강한, 매체, 및 약한 상호 작용은 제곱에 빨간색, 오렌지색과 노란색, 각각. 상호 작용 TFs의 HGNC 이름이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : EY1H 화면에서 문제. (A) TF-먹이 배열 어디 여러 식민지 성장 하지 못했습니다. (B) 판독 접시 식민지 왼쪽된 하단 모서리에 전송에 실패 했습니다. (C) 비-autoactive DNA-미끼 스트레인 긍정적인 상호 작용을 표시 하지 않습니다. (D) 높은 autoactive DNA 미끼 스트레인 긍정적인 상호 작용을 표시 하지 않습니다. (E) 판독 판 오염으로 인해 여러 블루 식민지를 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

안보 TF 배열
주 1 사우스 캐롤라이나-Trp 접시 96 식민지 형식 (2.1 및 2.2)에 효 자리
4 일 384 식민지 TF 배열 (2.3)을 생성
주 6 1,536 식민지 TF 배열 (2.4)를 생성
하루 9 증폭 1,536 식민지 TF 배열 (2.5)
DNA-미끼 스트레인 잔디 짝짓기에 대 한 준비
주 6 효 모 DNA 미끼 긴장 (3.1.1) 자리
하루 9 조 흔 효 모, 플레이트 (3.1.2) 당 12-16 긴장
10 일 조 흔 효 모, 플레이트 (3.1.3) 당 4 변종
하루 11 DNA-미끼 잔디 (3.1.4 및 3.1.5) 준비
효 모 DNA 미끼 및 TF 배열 긴장의 짝짓기
주 12 YAPD 플레이트 (3.2)에서 짝짓기
선택 2 중 효
하루 13 사우스 캐롤라이나-U-Trp 접시 (3.3)에 2 중 효 선택
판독 판 전송
하루 15 판독 판 (3.4) 전송 2 중 효 모
판독 판 영상
17-22 일 배경 (3.5)에 따라 판독 접시의 이미지 수집

표 1: TFF 배열입니다.

시 약 (2 리터)에 대 한 수량
드롭 아웃 믹스 히스티딘, 신, 트립토판과 uracil, 아데닌, 풍부한 마이너스 합성 (2 세대) 효 모 질소 기준 없이 2.6 g
효 모 질소 기본 아미노산과 황산 암모늄 (YNB) 없이 3.4 g
아데닌 hemisulfate이 수화물 160 mg
황산 암모늄 10 g
한 천 35 g
포도 당 (40%, w/v) 물, 살 균에 100 mL
신 (100 m m), 살 균 필터링 16 mL
트립토판 (40 m m), 살 균 필터링 16 mL

표 2: 시 약 목록 나.

시 약 (2 리터)에 대 한 수량
펩 40 g
효 모 추출 물 20 g
아데닌 hemisulfate이 수화물 0.32 g
포도 당 (40%, w/v) 물, 살 균에 100 mL
한 천 35 g

표 3: 시 약 목록 II.

시 약 (2 리터)에 대 한 수량
드롭 아웃 믹스 마이너스 히스티딘, 신, 트립토판, uracil 아데닌 리치 (2 세대) 효 모 질소 기준 없이 합성 2.6 g
효 모 질소 기본 아미노산과 황산 암모늄 (YNB) 없이 3.4 g
아데닌 hemisulfate이 수화물 160 mg
황산 암모늄 10 g
한 천 35 g
포도 당 (40%, w/v) 물, 살 균에 100 mL
신 (100 m m), 살 균 필터링 16 mL
히스티딘 (100 m m), 살 균 필터링 16 mL
Uracil (20 m m), 살 균 필터링 (사우스 캐롤라이나-U-Trp 번호판에 대 한 생략) 16 mL

표 4: 시 약 목록 III.

시 약 (2 리터)에 대 한 수량
드롭 아웃 믹스 마이너스 히스티딘, 신, 트립토판, uracil 아데닌 리치 (2 세대) 효 모 질소 기준 없이 합성 2.6 g
효 모 질소 기본 아미노산과 황산 암모늄 (YNB) 없이 3.4 g
아데닌 hemisulfate이 수화물 160 mg
황산 암모늄 10 g
한 천 35 g
포도 당 (40%, w/v) 물, 살 균에 100 mL
부 염 x 10 200 mL
신 (100 m m), 살 균 필터링 16 mL
3AT (2 M), 살 균 필터링 5 mL
DMF에 X-여자 (80 mg/mL) 4 mL

표 5: 시 약 목록 4.

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Discussion

로봇 eY1H 짝짓기 심사 방법은 크게 여기에 설명 된 이전 라이브러리 심사에 비해 관심의 기준점과 심사 방식 변화에 따라 DNA 영역에 바인딩되는 TFs의 집합을 식별 하려면 처리량을 증가 시킵니다. 또한, TF DNA 상호 작용 상호 작용의 90%가 감지 당 TF, 모든 4 개의 식민지에 대 한 긍정적인 테스트 및 상호 작용의 90%는 동일한 DNA 미끼 효 모 스트레인10 의 독립적인 화면에서 다시 테스트 분석 실험은 높은 재현 eY1H에 의해 감지 , 12 , 19. 더 중요 한 것은, eY1H에 의해 감지 TF DNA 상호 작용 인간 기자 분석12,20, 기본 인간 세포 (게시 되지 않은 결과), 그리고 선 충 C. 녹아웃 동물 테스트 했을 때 40%-70% 속도로 확인 11. 이것은 유사한 유효성 검사 속도 칩 seq 데이터21에 대 한 관찰을.

EY1H로 식별 하는 상호 작용 높은 재현할 수 있지만 동일한 효 모 DNA 미끼 스트레인을 재검사 하는 때 다른 효 모 종자 같은 테스트 DNA 미끼 가끔 생산 다른, 비록 중복, TF DNA 상호 작용의 세트. 이것은 일반적으로 긴장 배경 기자 활동 차이 때문입니다. 또한, DNA 시퀀스의 파편을 테스트 겹치는 조각 테스트 때 특히 전체 시퀀스를 테스트 보다 더 많은 TF DNA 상호 작용의 검색 결과입니다. 이 더 효율적 기자 최소한의 발기인, 가까운 상호 작용을 식별 하는 분석 결과와 관련이 있을 수 있습니다 그리고 조각 바인딩 사이트 될 수 있는 기회 감소 중복 테스트 때문에 효 모 nucleosomes에 의해 가려진. 따라서, 작은 규모의 프로젝트에 대 한 것이 좋습니다 그 겹치는 0.5-1 kb 조각 규제 지역의 테스트와 두 개의 독립적인 긴장 각 DNA 미끼 시퀀스8에 대 한 검사는.

몇 가지 중요 한 단계는 eY1H에서 상영을 그림 3에서 제시 하는 문제 중 일부를 피하기 위해 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 대부분 미디어 재료 (3AT 및 제외 X gal) 몇 달 동안 안정 있지만, 적절 한 식민지 성장 가능성의 부족이 나타냅니다 적어도 하나는 재료의 활동을 잃 었 수 있습니다 대체 되어야 한다. 둘째, 그것은 agar 뻗 었 고 고정 로봇 플랫폼을 사용 하는 경우에 오류가 발생 하지 않도록 1 일 이상 건조 하지 않는 사각형 접시를 준비 하는 것이 중요. 마지막으로, 짝짓기, 그리고 효 모 클론 사이 상호 오염 방지를 효과적으로 전송 로봇 플랫폼 프로그램을 누 룩에 대 한 프로토콜 (되짚어, 재활용, 혼합, 등)에 표시 된 대로 사용 하는 키입니다.

우리는 eY1H 스크린의 사용을 설명 하기 위해 선택 하는 예제는 인간의 유전자 발기인에 해당 합니다. 그러나, 다른 규제 영역도 테스트할 수 있습니다 강화 등 달 았 죠. 예를 들어 우리는 익숙해 eY1H 분석 실험 평가 TF 바인딩 인간의 발달 강화 및 선 충 C. 첫 introns12,22. 또한, 상호 작용 없음을 방식 테스트는 eY1H 분석 실험 비교 TF 코딩 시퀀스 변종 및 비 코딩 변종 사이의 상호 작용을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 우리가 식별 하는 eY1H 분석 실험을 사용 하 여 다른 유전자 질환, 및 또한 차동 상호 작용 프로필 58 TF missense 돌연변이12,14와 관련 된 109 noncoding 변종 TF 바인딩을 변경. 이 프로토콜은 인간의 규제 지역 TF 바인딩 평가에 중점을, 다른 종에서 DNA 지역 TF 먹이 사용할 수 되거나 생성 될 수 있습니다 또한 테스트할 수 있습니다. C. 선 충10, 초파리 melanogaster23, 생쥐24, 애기 thaliana25,26, TF 먹이 배열 생성 된 사실, 그리고 지 시 메이 스 27. 따라서, 점점 사용 가능한 리소스와 eY1H 분석 실험에 적용할 수 있습니다 추가 시스템.

EY1H 분석 인간과 다른 종에서 다른 규제 영역에 바인딩되는 TFs의 레 퍼 토리를 식별 하는 수단이 되어, 비록 그들은 주의8,11,,1219 의 무료 20,25. 한계 중 하나는 상호 작용은 효 모 핵의 환경에서 테스트 및 DNA-미끼 chromatinized는, 비록 효 모에 염색 질 구조 DNA-미끼 유래에서 종에 염색 질 구조를 반영 하지 않을 수 있습니다, 셀 유형 차이 vivo에서 관찰을 반영 하지 않습니다. 따라서, 상호 작용 eY1H 분석 실험에 의해 확인 된 기자 또는 다른 기능 분석 실험에서 확인 해야 합니다. 참고, 우리와 다른 사람의 TF DNA 상호 작용 eY1H에 의해 감지 기능 분석11,12,,2023에 40%-70% 속도로 확인 나타났습니다. EY1H 분석 실험의 또 다른 한계는 그것이 DNA, 효 모, 광고를 융합 하는 경우에 제대로 접혀 있지 않습니다 TFs와 TFs 배열에서 누락 된 바인딩할 효 모에 결 석 포스트 번역 상 수정 해야 하는 TFs를 포함 하는 상호 작용을 검색할 수 없습니다. 8. 더하여, 현재 형식에서 eY1H 분석 실험을 검색 하지 않습니다 heterodimeric TFs를 포함 하는 상호 작용 TF 배열에 있는 각 효 모 식민지 표현 단일 TF 먹이. 따라서, 추가 개선 분석 결과에서 시험 될 수 있다 소설 TF DNA 상호 작용을 식별 하는 eY1H 분석 실험의 기능을 확장 하는 TFs의 폭을 증가할 것 이다

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작품은 건강의 국가 학회 [R35-GM128625 J.I.F.B.]에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

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References

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Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

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