Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Forbedret gjær ett-hybrid-skjermer å identifisere transkripsjon faktor Binding til menneskelig DNA-sekvenser

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en forbedret gjær ett-hybrid screening protokoll for å identifisere transkripsjonsfaktorer (TFs) som kan binde til et menneskelig DNA område av interesse. Denne metoden bruker en høy gjennomstrømming screening rørledningen som kan forhøre binding av > 1000 TFs i et enkelt eksperiment.

Abstract

Identifisere settene med transkripsjonsfaktorer (TFs) som regulerer hver menneskelig genet er en skremmende oppgave som krever integrere mange eksperimentelle og computational tilnærminger. En slik metode er gjær en-hybrid (Y1H) analysen, i hvilken interaksjoner mellom TFs og DNA områder er testet i miljøet gjær kjernen bruker reporter gener. Y1H analyser omfatter to komponenter: en 'DNA-agn' (f.eks., arrangører, enhancers, lyddempere, etc.) og en 'TF-byttedyr,"som kan bli vist for reporter genet aktivisering. Mest publiserte protokoller for å utføre Y1H skjermer er basert på transformere TF-byttedyr biblioteker eller matriser til DNA-agn gjær påkjenningen. Her beskriver vi en rørledning, kalt utvidet Y1H (eY1H) søk, hvor TF-DNA interaksjoner er avhørt av parring DNA-agn stammer med en plassert samling av TF-byttedyr stammer med en høy tetthet matrise (HDA) robot plattform som gjør at screening i en 1,536 kolonien format. Dette gir en dramatisk økning i ytelse (60 DNA-agn sekvenser mot > 1000 TFs tar to uker per forsker) og reproduserbarhet. Vi illustrerer ulike forventede resultater av tester menneskelig promoter sekvenser mot en rekke 1,086 menneskelige TFs, samt eksempler på problemer som kan oppstå under skjermer og feilsøke dem.

Introduction

Et sentralt problem innen biomedisinsk bestemmer mekanismer som hver menneskelig genet er regulert. Transkripsjon er første skritt i å kontrollere gene expression nivåer, og det er regulert av sett med transkripsjonsfaktorer (TFs) som er unike for hver genet. Gitt at mennesker kode > 1500 TFs1,2, identifisere det fullstendige sett av TFs som kontrollerer uttrykk for hver genet er fortsatt et åpent utfordring.

To typer metoder kan brukes til TF-DNA interaksjoner: TF-sentrert og DNA-sentrert3 (figur 1A). I TF-sentrert metoder, er en TF rundt undersøkt for bindingen genomisk DNA regioner eller bestemme sin DNA bindende spesifisitet. Disse metodene omfatter chromatin immunoprecipitation (ChIP) etterfulgt av høy gjennomstrømming sekvensering, protein bindende microarrays og SELEX4,5,6. I DNA-sentrert metoder, er en DNA sekvens av interesse analysert for å fastslå hvilke TFs som binder til DNA sekvensen. Den mest brukte av slike metoder er gjær en-hybrid (Y1H) analyser, i hvilken interaksjoner mellom TFs og DNA områder er testet i miljøet gjær kjernen bruker reporter gener7,8,9.

Y1H analyser omfatter to komponenter: en 'DNA-agn' (f.eks arrangører, enhancers, lyddempere, etc.) og en 'TF-byttedyr,"som kan bli vist for reporter genet aktivisering9,10 (figur 1B). DNA-agn er klonet oppstrøms av to reporter gener (LacZ og HIS3) og begge DNA-bait::reporter konstruksjoner er integrert i gjær genomet til å generere chromatinized 'DNA-agn stammer." TF-byttet, kodet i en plasmider som uttrykker en TF smeltet aktivisering domenet (AD) av gjær Gal4 TF, er introdusert i DNA-agn belastningen fiske for TF-DNA interaksjoner. Hvis TF-byttet binder til DNA-agn sekvensen, vil Annonsen i TF-byttet føre til aktivering av både reporter gener. Celler med en positiv vekselvirkningen kan derfor valgt for vekst på platene mangler histidin, i tillegg til å overvinne en konkurransedyktig inhibitor, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT), og visualisert som blå kolonier i nærvær av X-gal. Fordi potente gjær Gal4 AD brukes, Y1H analyser kan oppdage samhandlinger med transcriptional aktivator samt repressors. Gitt at TF-preys uttrykkes fra en sterk gjær promoter (ADH1), kan i tillegg interaksjoner oppdages for TFs som har lav endogene uttrykk nivåer som er vanskelig for å oppdage ved ChIP11,12.

Mest publiserte protokoller for å utføre Y1H analyser er basert på presenterer TF-preys i gjær DNA-agn påkjenningen av transformere gruppert TF-byttedyr biblioteker etterfulgt av valg og kolonien plukke sekvensering å identifisere samspill TF, eller ved transformere personlige kloner8,9. Dette er tidkrevende protokoller, begrense antall DNA-sekvenser som kan testes per forsker. En siste forbedring av Y1H analyser, kalt utvidet Y1H (eY1H), har dramatisk økt screening gjennomstrømningen ved hjelp av en høy tetthet matrise (HDA) robot plattform for å mate DNA-agn gjærstammer med en samling av gjær påkjenningen hver uttrykker en annen TF-byttedyr10,13 (figur 1 c). Disse skjermene ansette en 1536 kolonien format tillater å teste de fleste mennesker TFs i quadruplicate bruker bare tre plater. Videre, gitt at TF-DNA interaksjoner er testet på en parvis måte, dette gir sammenligne interaksjoner mellom DNA-agn (for eksempel to noncoding single nukleotid varianter) og mellom ulike TFs eller TF varianter11,12 ,14.

Bruker eY1H analyser, har vi vært største menneskelige og Caenorhabditis elegans DNA-sentrert TF-DNA interaksjoner nettverk hittil. Spesielt har vi identifisert 2.230 vekselsvirkningene mellom 246 menneskelige utviklingsmessige enhancers og 283 TFs12. Videre har vi ansatt eY1H analyser å avdekke endret TF binding til 109 single nukleotid noncoding varianter knyttet til genetiske sykdommer som utviklingsmessige misdannelse, kreft og nevrologiske lidelser. Nylig brukte vi eY1H til å avgrense et nettverk bestående av 21,714 vekselsvirkningene mellom 2576 C. elegans genet arrangører og 366 TFs11. Dette nettverket var å avdekke funksjonelle rolle dusinvis av C. elegans TFs.

Protokollene å generere DNA-agn flekker og evaluere nivåer av bakgrunnen reporter aktivitet har vært rapportert andre steder15,16,17. Her beskriver vi en eY1H rørledning som kan brukes til skjermen noen menneskelige genomisk DNA regionen mot en rekke 1,086 menneskelige TFs. Når en gjær DNA-agn belastning genereres og en TF-byttedyr matrise er oppdaget på de tilsvarende platene, kan hele protokollen utføres i to uker (tabell 1). Enda viktigere, kan protokollen være parallelized slik at en enkelt forsker kan skjermen 60 DNA-agn sekvenser samtidig. For å demonstrere protokollen, vist vi arrangørene av to cytokin gener CCL15 og IL17F. I tillegg, viser vi resultater fra mislykkede skjermer for å illustrere hvilke typer problemer som kan oppstå når eY1H analyser og feilsøke dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelser

  1. SC −U −H plater (150 mm Petri retter)
    Merk: Disse platene brukes for voksende DNA-agn gjær påkjenningen.
    1. Oppløse den frafallet blanding, gjær nitrogen base (YNB), adenine hemisulfate og ammonium sulfate i 920 mL vann, og pH til 5,9 med 5 M NaOH (ca 1 mL per liter medier, se tabell 2 for sammensetning). Hell i en 2 L kolbe og legge rør bar.
    2. I en andre 2 L bolle, Legg agar til 950 mL vann (ikke legge rør bar da det vil føre agar koke i autoclave).
    3. Autoclave for 40 min på 15 psi på en flytende syklus.
    4. Umiddelbart hell innholdet i første flasken, inkludert rør bar, agar inneholder kolbe. Legge til glukose, blande godt på en rør-plate, og avkjøles til 55 ° C i et vannbad.
    5. Legg til leucine og tryptofan til media. Bland godt på en røre plate og hell i 150 mm sterilt Petri retter (~ 80 mL per fat). Tørr for 3-5 dager ved romtemperatur, pakk i plastposer, og lagre ved romtemperatur for inntil 6 måneder.
  2. YAPD rektangulær plater
    Merk: Disse platene brukes for voksende plenen for DNA-agn belastningen og parring med TF matrise samling.
    1. Oppløse pulver (se tabell 3 for sammensetning), unntatt agar, i 950 mL vann i en 2 L bolle og legge rør bar.
    2. I en andre 2 L bolle, Legg agar til 950 mL vann (ikke legge rør bar da det vil føre agar koke i autoclave).
    3. Autoclave for 40 min på 15 psi på en flytende syklus.
    4. Umiddelbart hell innholdet i første flasken, inkludert rør bar, agar inneholder kolbe.
    5. Legge til glukose, blanding på en røre plate og kul til 55 ° C. Hell media i rektangulær plater (se Tabell for materiale; ~ 70 mL per plate) bruker en peristaltiske pumpe (5 mL/sekund) og en 6 mm rør. Tørr for 1 dag i romtemperatur, pakk i plastposer, og lagre i kalde rom for opptil 6 måneder.
      Merk: Selv om foreslåtte media volumet er 70 mL per plate, 50-80 mL per plate kan bli brukt. Tre kritiske problemer når helle plater er 1) at de utjevnes agar mediene har samme tykkelse hele platen (bruk en flatet bord eller en overflate plate helle ut og ikke helle i stabler av mer enn sju plater) 2) for å sikre fravær av bobler i agar media (bobler bør være dukket bruker en steril nål), og 3) tørking platene for bare én dag og innpakning platene i plastposer å unngå feil i låsing gjær.
  3. SC −Trp og Sc −U −Trp rektangulær plater
    Merk: Disse platene brukes for voksende TF matrise samlingen (Sc −Trp) og velge diploide gjær etter mating (Sc −U −Trp).
    1. Oppløse den frafallet blanding, YNB, adenine hemisulfate og ammonium sulfate i 920 mL vann, og pH til 5,9 med NaOH 5M (ca 1 mL per liter media) (se Tabell 4 sammensetning). Hell i en 2 L kolbe og legge rør bar.
    2. I en andre 2 L bolle, Legg agar til 950 mL vann (ikke legge rør bar da det vil føre agar koke i autoclave).
    3. Autoclave for 40 min på 15 psi på en flytende syklus.
    4. Umiddelbart hell innholdet i første flasken, inkludert rør bar, agar inneholder kolbe. Legge til glukose, bland godt på en rør-plate, og kule til 55 ° C.
    5. Legg til leucine, histidin og uracil (utelate uracil for Sc −U −Trp plater).
    6. Bland godt på en røre plate og hell i rektangulær plater (~ 70 mL per plate) bruker peristaltiske pumpe (5 mL/sekund) og 6 mm rør. Tørke 1 dag ved romtemperatur, bryte platene i plastposer og lagre i kalde rom for inntil 3 måneder.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal rektangulær plater
    Merk:     disse platene brukes som avlesning plater for eY1H analyser.
    1. Oppløse den frafallet blanding, YNB, adenine hemisulfate og ammonium sulfate i 850 mL vann (se tabell 5 for sammensetning). Gjør ikke pH. Hell i en 2 L kolbe og legge rør bar.
    2. I en andre 2 L bolle, Legg agar til 850 mL vann (ikke legge rør bar da det vil føre agar koke i autoclave).
    3. Autoclave for 40 min på 15 psi på en flytende syklus.
    4. Forberede 10 x BU salter (1L) ved å kombinere 900 mL vann, 70 g av Na2HPO4∙7H2O og 34,5 g av NaH2PO4∙H2O. blanding ved hjelp av en røre bar å oppløse pulver og justere pH 7.0 med 5 M NaOH. Legge til vann for å bringe til 1 L og autoclave.
    5. Forberede den X-gal-løsningen ved å legge til 3.5 g X-gal pulver en 50 mL plastrør som inneholder 42,5 mL dimethyl formamide. Legge til X-gal pulver dimethyl formamide å oppløse lettere (dette tar 30 min). Holde lagerløsning i mørket (bruk ugjennomsiktig 50 ml tube eller dekke i folie). Butikken på 20 ° C.
    6. Umiddelbart hell innholdet i første flasken, inkludert rør bar, agar inneholder kolbe. Legge til glukose og 10 x BU salter (se tabell 5 for sammensetning), bland godt på en rør-plate, og kjøle til 55 ° C.
    7. Legg til leucine, 3AT og X-gal (se tabell 5 for sammensetning).
    8. Bland godt på en røre plate og hell i rektangulær plater (~ 70 mL per plate) bruker en peristaltiske pumpe (5 mL/sekund) og en 6 mm rør. Tørr for 1 dag i romtemperatur, pakk i plastposer, og lagre på kalde rommet dekket i aluminiumsfolie (3AT og X-gal er lysfølsom) for opptil 1 måned.

2. se en TF matrise

  1. Tiner TF-byttedyr matrisen
    1. Tine gjær glyserol lager plater med TF-byttedyr utvalg på is.
      Merk: TF-byttedyr matriser kan genereres som tidligere publisert10,12,13,18.
    2. Resuspend gjær bruker en 12-kanals pipette innen 1 – 3 min før neste trinn.
  2. Småblødninger gjær i Sc −Trp rektangulær plater
    1. I HDA roboten (se Tabell for materiale), Velg flere bra 96 plater som kilde, 96 agar plater som mål og 96 lang pin pads.
      Merk: PIN pads er ikke gjenbrukbare og bør forkastes.
    2. Velg Gjenskape mange programmet gi to eksemplarer per 96-brønns plate. Ikke bruk gjenvinne eller tilbake for å unngå tilbake forurensning av frosne aksjer.
    3. Velg alternativet å virvle opp og ned i kilden å blande gjær.
    4. Bag flekkete matrisen og ruge agar side opp på 30 ° C i 2-3 dager.
  3. Generere 384 kolonien matriser i Sc −Trp rektangulær plater
    1. I robot, velger du 96 agar plater som kilde, 384 agar plate som mål og 96 kort pin pads.
    2. Velg 1:4 matrise programmet. På denne måten skal fire 96 kolonien plater (hver inneholder en annen TF) konsolideres i én 384 kolonien plate. Ikke bruk gjenvinne eller tilbake for å unngå forurensning mellom ulike plater.
    3. Bag platene og ruge flekkete 384-kolonien matrise agar-side opp på 30 ° C i 2 dager.
  4. Generere 1536 kolonien matriser i Sc −Trp rektangulær plater
    Merk: Dette vil resultere i matriser som inneholder fire koloniene for hver TF-byttedyr.
    1. I robot, velger du 384 agar plater som kilde, 1536 agar platene som mål og 384 kort pin pads.
    2. Merk 1:4 analysen enkelt kildeprogrammet. Målet er å kopiere hver koloni til fire kolonier å få quadruplicates. Bruk gjenvinne og besøker alternativer som det innebærer kopiere fire ganger hver koloni.
    3. Bag platene og ruge flekkete 1536-kolonien matrise agar-side opp på 30 ° C i 3 dager.
  5. Forsterke 1536 kolonien matrisen i Sc −Trp rektangulær plater
    1. I robot, velger du 1536 agar plater som kilde, 1536 agar plater som mål og 1536 kort pin pads.
    2. Velg Gjenskape mange programmet å gjenskape 3-4 Kopier. Bruk gjenvinne og besøker alternativet, men kaste ut puten når du bytter til en annen plate i matrisen å unngå kryss-kontaminering.
    3. Bag platene og ruge flekkete 1536-kolonien matrise agar-side opp på 30 ° C for 3 dager å bruke for parring trinn (se nedenfor). Etter det, holde platene i romtemperatur og kopi igjen etter 7 dager for en ny runde med screening.

3. eY1H-skjermen

  1. Forbereder DNA-agn belastning plener mating
    1. Spot gjær DNA-agn stammer på en Sc −U −H plate og vokse i 3 dager på 30 ° C.
    2. Strek gjær i en 15 cm Sc −U −H tallerken med en bakteriefri tannpirker, slik at hver plate passer 12-16 ulike stammer. Inkuber en dag på 30 ° C.
    3. Strek gjær i en 15 cm Sc −U −H tallerken med en bakteriefri tannpirker, slik at hver plate passer 4 ulike stammer. Inkuber for en dag på 30 ° C.
    4. Skrape gjær bruker en steril tannpirker, og pass på ikke å skrape alle agar og legge inn en 1,5 rør med 500 µL av sterilt vann.
    5. Legge til 10-15 sterilt glassperler på en YAPD rektangulære tallerken. Legge gjær suspensjon på platen og rist godt i alle retninger for 1 min å sikre gjær spres gjennom alle platen.
    6. Invertere plate umiddelbart og trykk slik at perlene gå til lokket. Fjerne og gjenvinne perler.
    7. Pose platene og ruge agar side ned for 1-2 dager på 30 ° C. Deretter videre til parring trinn.
  2. Mating av gjær DNA-agn og TF matrise stammer
    1. Overføre TF matrisen til en firkantet plate YAPD robot. Velg 1536 agar platen som kilde og mål og 1536 kort pin-tastaturet. Velg Gjenskape mange programmet. Hver TF matrise plate kan brukes til å overføre til 3-4 YAPD plater (hvor mange plater i matrisen). TF matrise platene brukes for parring må være 2-3 dager gammel, men ikke mer som parring kan være ineffektiv.
    2. Overføre plenen DNA-agn belastning til YAPD platene allerede inneholder TF matrisen robot. Velg 1536 agar platen som kilde og mål og 1536 kort pin-tastaturet. Velg Gjenskape mange programmet. Bruker en tilfeldig forskyvning i kilden med en radius på ~0.6 mm for å unngå å ta gjær fra samme sted, og bland på målet å lette kontakt mellom gjær påkjenningen. Bruk plenen med DNA-agn stammer (inndelingen 3.1) som kilde, og YAPD platene som inneholder TF matrisen oppdaget i trinn 3.2.1 som mål.
    3. Bag platene og ruge agar side opp på 30 ° C for en dag.
  3. Utvalg av diploide gjær
    1. Overføre parret gjær fra YAPD platene til Sc −U −Trp plater med roboten. Velg 1536 agar platen som kilde og mål og 1536 kort pin-tastaturet. Velg gjenskape programmet. Bland kilde og mål.
    2. Bag platene og ruge agar side opp på 30 ° C i 2-3 dager (lengre inkubasjon fører til høye reporter aktivitet).
  4. Overføre til avlesning plater
    1. Overføre diploide gjær fra Sc −U −Trp platene avlesning rektangulær plater Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0.4 mM X-gal med roboten. Velg 1536 agar platene som kilde og mål og 1536 kort pin-tastaturet. Velg gjenskape programmet.
    2. Bag platene og ruge agar side opp på 30 ° C i opptil 7 dager.
  5. Imaging avlesning plater
    1. For DNA-agn stammer med høye reporter aktivitet, ta bilder på dager 2, 3 og 4. Ellers tar bilder dager 4 og 7. Positive interaksjoner identifiseres av vekst og blå fargen på gjær koloniene og kan bestemmes manuelt, eller det kan fastslås ved hjelp av analyseprogramvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre hovedfaktorer bør vurderes når analysere resultatene fra eY1H analyser: bakgrunn reporter aktiviteten til DNA-agn belastningen, styrke reporter aktiviteten tilsvarer TF-DNA interaksjoner, og antall positive kolonier. Bakgrunn reporter aktiviteten (dvs. autoactivity) av DNA-agn belastningen refererer til den generelle vekst og fargen på gjær koloniene i avlesning plate, selv i fravær av en TF-byttedyr. Ideelt sett ikke-autoactive stammer Vis en bakgrunn hvit eller lys brun farge, med kolonier for positive interaksjoner blir større og blå. Autoactive DNA-agn stammer vise gjær vekst i media mangler histidin og blått i nærvær av X-gal for alle kolonier på plate, som sannsynligvis gjelder binding av gjær transcriptional aktivator til DNA-agn8. Styrken på reporter aktiviteten tilsvarer TF-DNA samhandlingene oppdaget (dvs. størrelse av kolonien) og intensitet av blå avhenger av mange parametere som affinitet, hvilket TF uttrykk i gjær, antall bindende områder og avstand til den gjær minimal arrangørene ligger over reporter gener og bakgrunn reporter aktiviteten til DNA-agn belastningen. For eksempel en svak kjernekraft lett kan oppdages i en lav bakgrunn agn men kan være vanskelig å oppdage i en autoactive eller ujevn bakgrunn agn. Det er også viktig for å merke seg at reporter aktivitet nivåer i gjær ikke nødvendigvis samsvarer med regulatoriske aktiviteten i menneskelige celler, som chromatin strukturen, nucleosome posisjonering, og avstanden effekter er forskjellig mellom gjær og menneskelig. Videre interaksjoner i human er trolig bli påvirket ved binding av andre TFs og kofaktorer eller kan bli maskert av funksjonelt redundante TFs8. Endelig er interaksjoner vurdert positivt i eY1H analyser når minst to av de fire koloniene viser reporter uttrykk over bakgrunnen nivå. Vi har imidlertid observert at ~ 90% av interaksjoner identifisert resultatet fra alle fire koloniene tilsvarer en TF blir positive10,12,19.

For å illustrere typen resultater som kan oppnås med eY1H analyser vi vist promoter regionene (2 kb oppstrøms av transkripsjon start nettsteder) CCL15 og IL17F gener, mot en rekke 1,086 menneskelige TFs (figur 2). CCL15 er et eksempel på en ikke-autoactive DNA-agn hvor samspill, selv svake, kan lett oppdaget (figur 2A). IL17F er et eksempel på en autoactive DNA-agn med ujevne bakgrunn reporter aktivitet, der noen interaksjoner kan oppdages for flere TFs er det usikkert om reporter aktiviteten er høyere enn bakgrunn (figur 2B).

Problemer som kan oppstå når du utfører eY1H analyser

Selv om screening eY1H protokollen er rett fram og robust, flere problemer kan være påtruffet under skjermen:

1) koloniene er for liten og ikke overføring (figur 3A): selv om det er forventet at noen gjær uttrykke eksogene TFs kan vise langsom vekst gitt at gjær genuttrykk kan være dysregulated, vanligvis ~ 95% TF-byttedyr kolonier vise normal vekst. Hvis mer enn 10% av koloniene ikke vokser, er de vanligste årsakene problemer med media eller gjær overføring. Suboptimal vekst er ofte knyttet til en av media komponentene å miste aktivitet (f.eks uracil, histidin eller leucine), som kan løses ved å forberede frisk media med fersk lager løsninger. Alternativt kan dette også være relatert til en feste forskyvning som påvirker kolonien overføring. I dette tilfellet kontrollerer du at 1536 pads pin midten av gjær koloniene i kilde platene.

2) ingen gjær vekst i en del av platen (figur 3B): problemet er vanligvis knyttet med en svikt i parring trinn hvis 1536 pin-tastaturet kan ikke opprette kontakt med gjær i DNA-agn belastning plenen, TF array, eller parring platen. I nesten alle tilfeller, er dette på grunn av ujevn agar media nivå under plate helle eller overdreven tørking av platen.

3) ingen interaksjoner oppdaget (Figur 3 c og D): problemet er ofte knyttet til enten utilsiktede inactivating mutasjoner i reporter genene, i bestemte LacZ (Figur 3 c), eller høy autoactivity som maske samhandlinger (figur 3D). Hvis du vil feilsøke dette problemet, anbefales det å skjermen en uavhengig innhentet belastning tilsvarer den samme DNA-agn.

4) plate presenterer tilfeldige blå flekker (figur 3E): problemet er ofte knyttet til bakteriell forurensning. For å løse dette problemet, strek gjær for å få personlige kolonier og gjentar skjermen.

Ovennevnte er de vanligste problemene når du utfører eY1H analyser. Andre problemer skal oppstår, forbereder nye medier, bekrefter at riktige innstillinger for HDA robot ble brukt, og teste flere stammer per DNA-agn ville sikkert oppklare de fleste problemer.

Figure 1
Figur 1 : Omrisset av eY1H analysen skjermer. (A) sammenligning mellom TF-sentrert og DNA-sentrert metoder for å identifisere protein-DNA interaksjoner. (B) skjematisk av eY1H analyser. En DNA sekvens av interesse (arrangøren, enhancer, lyddemper, etc.) klonet oppstrøms av reporteren HIS3 og LacZ gener er integrert i gjær genomet. Resulterende DNA-agn belastningen er koblet til en samling av gjær påkjenningen skjuler TFs smeltet Gal4 aktivisering domenet (AD). Positive interaksjoner bestemmes av gjær og evnen til å vokse uten histidin og overvinne konkurransedyktig hemmer 3-AT og blå i nærvær av X-gal. (C) rørledning for eY1H skjermer. En plen av en gjær DNA-agn belastning vokst i en YAPD plate er koblet i en YAPD plate til en 1536 kolonien rekke uttrykke TFs smeltet annonsen dyrket på en Sc −Trp plate. Etter en dag, er gjær overført til en Sc −U −Trp til å velge for diploide gjær. Etter en 2-3 dagers inkubasjon er gjær overført til en Sc −U −H −Trp + 3AT + X-gal plate (avlesning plate) til å identifisere protein-DNA interaksjoner. Hver interaksjon er testet i quadruplicate.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Eksempler på eY1H avlesning plater. (A) samhandlinger med arrangøren av CCL15, en ikke-autoactive agn. Bakgrunn reporter aktivitet for denne agn er lav (redusert vekst i fravær av histidin og fravær av blått for ikke-samspill TFs). (B) samhandlinger med arrangøren av IL17F, en autoactive agn. Bakgrunn reporter aktivitet for denne agn er høy (vekst i fravær av histidin og bakgrunnen blå farge hele platen) og ujevn, noe som gjør det utfordrende for å identifisere protein-DNA interaksjoner. Sterke, middels og svake interaksjoner er kvadrat i rødt, oransje og gul, henholdsvis. HGNC navnene på samspill TFs vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Problemer i eY1H skjermer. (A) TF-byttedyr matrise der flere kolonier mislyktes å vokse. (B) avlesning plate der koloniene i nedre venstre hjørne kunne overføre. (C) ikke-autoactive DNA-agn stamme som ikke viser positive interaksjoner. (D) svært autoactive DNA-agn stamme som ikke viser positive interaksjoner. (E) avlesning platen viser flere blå kolonier på grunn av forurensning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Spotting en TF matrise
Dag 1 Spot gjær i Sc-Trp plate i 96 kolonien format (2.1 og 2.2)
Dag 4 Generere 384 kolonien TF matrise (2,3)
Dag 6 Generere 1536 kolonien TF matrise (2,4)
Dag 9 Forsterke 1536 kolonien TF matrise (2.5)
Forbereder DNA-agn belastning plener mating
Dag 6 Spot gjær DNA-agn stammer (3.1.1)
Dag 9 Strek gjær, 12-16 stammer per plate (3.1.2)
Dag 10 Strek gjær, 4 stammer per plate (3.1.3)
Dag 11 Forberede DNA-agn plener (3.1.4 og 3.1.5)
Mating av gjær DNA-agn og TF matrise stammer
Dag 12 Parring i YAPD plater (3,2)
Utvalg av diploide gjær
Dag 13 Utvalg av diploide gjær i Sc-U-Trp platene (3.3)
Overføre til avlesning plater
Dag 15 Overføre diploide gjær til avlesning plater (3.4)
Imaging avlesning plater
Dager 17-22 Image vinningen av avlesning plater avhengig av bakgrunn (3,5)

Tabell 1: TFF matrise.

REAGENS Antall (for 2 L)
Frafallet blanding syntetiske minus histidin leucine tryptofan og uracil, adenine, rike (2 g) uten gjær nitrogen base 2.6 g
Gjær nitrogen base uten aminosyrer og uten ammonium sulfate (YNB) 3.4 g
Adenine hemisulfate dihydrate 160 mg
Ammonium sulfate 10 g
Agar 35 g
Glukose (40%, w/v) i vann, sterile 100 mL
Leucine (100 mM), sterile filtrert 16 mL
Tryptofan (40 mM), sterile filtrert 16 mL

Tabell 2: Reagens liste jeg.

REAGENS Antall (for 2 L)
Pepton 40 g
Gjærekstrakt 20 g
Adenine hemisulfate dihydrate 0.32 g
Glukose (40%, w/v) i vann, sterile 100 mL
Agar 35 g

Tabell 3: Reagenslisten II.

REAGENS Antall (for 2 L)
Frafallet blanding syntetiske minus histidin, leucine, tryptofan og uracil, adenine rike (2 g) uten gjær nitrogen base 2.6 g
Gjær nitrogen base uten aminosyrer og uten ammonium sulfate (YNB) 3.4 g
Adenine hemisulfate dihydrate 160 mg
Ammonium sulfate 10 g
Agar 35 g
Glukose (40%, w/v) i vann, sterile 100 mL
Leucine (100 mM), sterile filtrert 16 mL
Histidin (100 mM), sterile filtrert 16 mL
Uracil (20 mM), sterile filtrert (utelate for Sc-U-Trp platene) 16 mL

Tabell 4: Reagenslisten III.

REAGENS Antall (for 2 L)
Frafallet blanding syntetiske minus histidin, leucine, tryptofan og uracil, adenine rike (2 g) uten gjær nitrogen base 2.6 g
Gjær nitrogen base uten aminosyrer og uten ammonium sulfate (YNB) 3.4 g
Adenine hemisulfate dihydrate 160 mg
Ammonium sulfate 10 g
Agar 35 g
Glukose (40%, w/v) i vann, sterile 100 mL
10 x BU salter 200 mL
Leucine (100 mM), sterile filtrert 16 mL
3AT (2 M), sterile filtrert 5 mL
X-gal (80 mg/mL) i DMF 4 mL

Tabell 5: Reagenslisten IV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Robot eY1H parring screening tilnærming beskrevet her sterkt øker for å identifisere settet med TFs som binder til et DNA område av interesse, sammenlignet med tidligere biblioteket screening eller plassert screening tilnærminger basert på transformasjon. Videre, de TF-DNA interaksjonene oppdaget av eY1H analyser er svært reproduserbare som 90% av interaksjoner oppdaget er positivt for alle fire kolonier testet per TF og 90% av interaksjoner Omtest i en uavhengig skjerm av samme gjær DNA-agn belastning10 , 12 , 19. viktigere TF-DNA interaksjoner oppdaget av eY1H validere frekvensen 40%-70% når testet i menneskelig reporter analyser12,20i primære menneskeceller (upubliserte resultater) og i C. elegans knockout dyr 11. Dette er validering takt som observert for ChIP-seq data21.

Selv om interaksjoner identifisert av eY1H er svært reproduserbar når retesting samme gjær DNA-agn belastning, produserer teste ulike gjærstammer for samme DNA-agn noen ganger forskjellige, selv om overlappende, sett av TF-DNA interaksjoner. Dette er vanligvis på grunn av forskjeller i bakgrunnen reporter aktivitet mellom stammer. I tillegg testing fragmenter av en DNA sekvens resulterer i oppdagelsen av flere TF-DNA samhandling enn teste hele sekvensen, spesielt når overlappende fragmenter er testet. Dette skyldes med analysen blir mer effektiv identifisere interaksjoner som er nær den reporter minimal arrangørene, og fordi testing overlappende fragmenter reduserer sjansen for at en bindende nettsted kan være okkludert av gjær nucleosomes. Således, for små prosjekter, anbefales det at overlappende 0,5-1 kb fragmenter av et regulatorisk område er testet og som to uavhengige stammer er vist for hver DNA-agn sekvens8.

Det er flere viktige skritt i eY1H screening protokoll for å unngå noen av problemene presenteres i Figur 3. Først, selv om de fleste media ingrediensene er stabil i flere måneder (unntatt 3AT og X-gal), mangel på skikkelig kolonien vekst sannsynlig angir at minst en av ingrediensene kan ha tapt aktivitet og bør byttes. Det andre, er det viktig å forberede rektangulær plater slik at agar er jevnet og slik at de ikke tørr for mer enn en dag å unngå svikt i låsing ved robot plattformen. Til slutt, er det viktig å bruke robot plattform programmer som angitt i protokollen (tilbake, resirkulering, miksing, etc.) for gjær skal overføres effektivt, for parring å være effektiv, og å unngå kryss-kontaminering mellom gjær kloner.

Eksemplene vi valgte for å illustrere bruken av eY1H skjermer tilsvarer menneskelige genet arrangører. Men kan andre regulerende regioner også testes inkludert enhancers og lyddempere. For eksempel har vi brukt eY1H analyser evaluere TF binding til menneskelig utviklingsmessige enhancers og C. elegans første introns12,22. Gitt at interaksjoner er testet på en parvis måte, kan i tillegg eY1H analyser brukes til å sammenligne interaksjoner mellom ikke-koding varianter, og mellom TF koding sekvens varianter. For eksempel endret bruker eY1H analyser vi identifisert TF binding til 109 noncoding varianter forbundet med ulike genetiske sykdommer og differensial interaksjoner profiler for 58 TF eks. missense mutasjoner12,14. Selv om denne protokollen fokuserer på å vurdere TF binding til menneskelig regulatoriske regioner, kan DNA regioner fra andre arter også testes forutsatt at en TF-byttedyr er tilgjengelig eller kan genereres. Faktisk TF-byttedyr matriser er generert for C. elegans10, Drosophila melanogaster23, Mus musculus24, Arabidopsis thaliana25,26, og Zea mays 27. dermed med stadig mer tilgjengelige ressurser, eY1H analyser kan brukes på andre systemer.

Selv om eY1H analyser har vært medvirkende til å identifisere repertoar på TFs som binder til regulatoriske regioner i menneskelige og andre arter, er de ikke gratis advarsler8,11,12,19 ,20,25. En av begrensningene er at interaksjoner er testet i miljøet gjær kjernen, og selv om DNA-agn er chromatinized, chromatin strukturen i gjær ikke gjenspeiler chromatin strukturen i arter fra hvor DNA-agn opprinnelse og ikke gjenspeiler celle forskjeller observert i vivo. Dermed må interaksjoner identifisert av eY1H analyser valideres i reporter eller andre funksjonelle analyser. Merk, vi og andre har funnet TF-DNA interaksjoner oppdaget av eY1H validere frekvensen 40%-70% i funksjonelle analyser11,12,20,23. En annen begrensning eY1H analyser er at det ikke finner samhandlinger med TFs som krever post-translasjonell modifikasjoner fraværende i gjær å binde til DNA og TFs som ikke er riktig brettet i gjær da smeltet for annonsen TFs som mangler matrisen 8. I tillegg i gjeldende format, eY1H analyser ikke oppdager samhandlinger med heterodimeric TFs, som hver gjær koloni i TF matrisen uttrykker en enkelt TF-byttedyr. Dermed vil ytterligere forbedringer i analysen øke bredden i TFs som kan testes og utvide egenskapene til eY1H analyser for å identifisere romanen TF-DNA interaksjoner

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R35-GM128625 å J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Tags

Genetikk problemet 144 gjær ett-hybrid Y1H transkripsjon faktor menneske gene regulering DNA eY1H
Forbedret gjær ett-hybrid-skjermer å identifisere transkripsjon faktor Binding til menneskelig DNA-sekvenser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter