Summary

Роман человеческого эпителиального Enteroid модель развития некротизирующего энтероколита

Published: April 10, 2019
doi:

Summary

Enteroids появляются как модель роман в исследовании болезней человека. Протокол описывает как имитировать модель enteroid человека некротизирующего энтероколита, используя липополисахарида (LPS) лечение enteroids, созданный из новорожденных ткани. Собранные enteroids демонстрируют воспалительные изменения наподобие тех, которые видели в человека некротизирующего энтероколита.

Abstract

Некротизирующего энтероколита (НЭК) разрушительное заболевание новорожденных. Он характеризуется несколькими патофизиологические изменения в человека кишечного эпителия, приводит к увеличению проницаемости кишечника, нарушениями реституции и возросла клеточной смерти. Хотя существует множество животных моделей NEC, ответ на травмы и терапевтические мероприятия может быть сильно варьирует между видами. Кроме того это этически сложный для изучения патофизиологии болезни или роман терапевтических агентов непосредственно в человеке, особенно детей. Таким образом весьма желательно разработать модель Роман NEC с использованием тканей человека. Enteroids, 3-мерной organoids, производный от клеток кишечного эпителия. Они идеально подходят для изучения сложных физиологических взаимодействий, сигнализации ячейки и хост Возбудитель обороне. В этой рукописи мы описываем протокол этого человека enteroids культур после изоляции кишечных стволовые клетки от пациентов, перенесших резекция кишечника. Склеп клетки культивировали в СМИ, содержит факторы роста, которые поощряют дифференцировку в различных родной типы клеток человека кишечного эпителия. Эти клетки выращивают в смесь синтетических, коллагеновых белков, которые служат в качестве лески, подражая внеклеточных базальной мембраны. В результате enteroids развивать апикальной базолатеральной полярности. Совместное управление липополисахарида (LPS) в средствах массовой информации вызывает воспалительной реакции в enteroids, ведущих к гистологических, генетические и белка выражение изменения, аналогичные тем, которые видели в человека NEC. Экспериментальная модель NEC с использованием тканей человека может предоставить более точные платформу для наркотиков и лечения тестирования до испытания на человеке, как мы стремимся определить лекарство от этой болезни.

Introduction

Человеческого enteroids являются ex vivo система 3-мерного культуры генерируется из стволовых клеток, изолированных от кишечных склепы образцов человеческой ткани кишечника. Эта модель наземного разорвать был впервые, Hans Clevers et al. в 2007 году после обнаружения Lgr5 + стволовых клеток в склепы тонкой кишки у мышей1. Их работа заложила основу для установления ex vivo кишечного эпителия культуры несколько типов клеток, которые могут быть пассированной без значительных генетических и физиологических изменений2. После этого открытия enteroids использовались как Роман модель для изучения нормальной физиологии пищеварения и патофизиологии кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника, хост возбудитель взаимодействия и регенеративной медицины2.

Использование в enteroids как ex vivo модель для изучения кишечных патофизиологии имеет ряд преимуществ перед альтернативные методы. За последние несколько десятилетий Животные модели и увековечен кишечного рака производные клеточных линий использовались для изучения физиологии кишечника3,4,5. Сингл клеточных культур не отражают разнообразие типов клеток в нормальной кишечного эпителия, тем самым не хватает в ячейке кросс talk и сегмент специфичность белков, сигнализации и индуцированных возбудителя болезни6. Стволовые клетки в enteroids дифференцироваться в основных типов эпителиальных клеток, таких как enterocytes, Paneth клетки, бокаловидных клеток, клеток enteroendocrine и более3. Они проявляют полярности, эпителиальные транспортных функций и позволяют для кишечных сегмент специфика6. Поскольку enteroids можно повторить несколько типов клеток кишечного эпителия человека, они могут преодолеть это ограничение признанных систем на основе клеток рака. Со временем производные клеточных линий subcloned и развиваться, чтобы выставлять большее разнообразие в выражение и локализация протеина3. Напротив enteroids может быть пассированной без значительных генетических и физиологических изменений2. Хотя существует множество животных моделей для NEC, ответ на травмы и терапевтические мероприятия может быть сильно варьирует между видами. В результате этих ограничений, терапевтов, полученных от животных моделей неудачу 90% времени при тестировании в человеческих испытаний из-за различий в токсичности или эффективность3. Enteroids служат в качестве перспективных доклинических моделей, которые можно преодолеть эти недостатки, ведущих к лучшему пониманию сложных кишечных патофизиологии и, следовательно, более успешным и экономически эффективных терапевтических инноваций. Существует также недавние свидетельства того, что возраст ткани, создаваемый enteroid остается биологически важных7. Это особенно важная деталь для нашей модели, так как enteroids генерируются из новорожденных ткани, тем самым сохраняя физиологическое значение для пациентов с НВК.

Утилита enteroids как модели заболеваний человека продолжает расширяться, в надежде найти лекарства от серьезных и широко распространенных условий. Некротизирующего энтероколита (НЭК) является разрушительной кишечных заболеваний новорожденных характеризуется кишечных некроза и часто приводит к перфорации кишечника стены, сепсис и смерти8. Из-за сложных и многофакторных патофизиологии NEC точный механизм заболевания не еще не выяснен полностью; Однако повышение проницаемости кишечной ясно было вовлечено в процесс болезни8. Учитывая, что изучение NEC и потенциальных терапевтических агентов является этически сложный в человеке, особенно детей, это крайне желательно использовать биологически соответствующих enteroid модель NEC с использованием тканей человека новорожденных. До настоящего времени enteroids имеют ограниченную роль в изучении NEC. Этот протокол описывает использование enteroids, производный от образцов человеческой ткани кишечника как Роман ex vivo модель для изучения некротизирующего энтероколита.

Protocol

Одобрение Советом институциональный обзор был получен (СИБ #2013-15152) для сбора образцов ткани от пациентов, перенесших резекция кишечника на Энн и Роберт H. Лурье Детская Больница Чикаго, Чикаго, Иллинойс. Все протоколы были исполнены в соответствии с институциональных и национальных рук?…

Representative Results

Сразу же после покрытия, свежевыделенных кишечные крипты появляются как удлиненные стержней. В течение часов enteroid будет принимать круглый вид(рисунок 1). В течение следующих нескольких дней enteroids начнет формирование сфер, как показано на <strong cl…

Discussion

Этот роман ex vivo человека кишечные enteroid модель служит полезным методом для изучения дисфункции кишечника барьер в некротизирующего энтероколита (НЭК). Представленные здесь методы обработки enteroid были адаптированы из предыдущей работы Drs. Misty добра, Майкл Helmrath и Джейсон Wertheim10

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальный институт здравоохранения Институт диабета и пищеварительной и Грант болезни почек (K08DK106450) и Джей Гросфельд премию от Американской ассоциации детской хирургической C.J.H.

Materials

4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

View Video