Роман человеческого эпителиального Enteroid модель развития некротизирующего энтероколита
Summary
Enteroids появляются как модель роман в исследовании болезней человека. Протокол описывает как имитировать модель enteroid человека некротизирующего энтероколита, используя липополисахарида (LPS) лечение enteroids, созданный из новорожденных ткани. Собранные enteroids демонстрируют воспалительные изменения наподобие тех, которые видели в человека некротизирующего энтероколита.
Abstract
Некротизирующего энтероколита (НЭК) разрушительное заболевание новорожденных. Он характеризуется несколькими патофизиологические изменения в человека кишечного эпителия, приводит к увеличению проницаемости кишечника, нарушениями реституции и возросла клеточной смерти. Хотя существует множество животных моделей NEC, ответ на травмы и терапевтические мероприятия может быть сильно варьирует между видами. Кроме того это этически сложный для изучения патофизиологии болезни или роман терапевтических агентов непосредственно в человеке, особенно детей. Таким образом весьма желательно разработать модель Роман NEC с использованием тканей человека. Enteroids, 3-мерной organoids, производный от клеток кишечного эпителия. Они идеально подходят для изучения сложных физиологических взаимодействий, сигнализации ячейки и хост Возбудитель обороне. В этой рукописи мы описываем протокол этого человека enteroids культур после изоляции кишечных стволовые клетки от пациентов, перенесших резекция кишечника. Склеп клетки культивировали в СМИ, содержит факторы роста, которые поощряют дифференцировку в различных родной типы клеток человека кишечного эпителия. Эти клетки выращивают в смесь синтетических, коллагеновых белков, которые служат в качестве лески, подражая внеклеточных базальной мембраны. В результате enteroids развивать апикальной базолатеральной полярности. Совместное управление липополисахарида (LPS) в средствах массовой информации вызывает воспалительной реакции в enteroids, ведущих к гистологических, генетические и белка выражение изменения, аналогичные тем, которые видели в человека NEC. Экспериментальная модель NEC с использованием тканей человека может предоставить более точные платформу для наркотиков и лечения тестирования до испытания на человеке, как мы стремимся определить лекарство от этой болезни.
Introduction
Человеческого enteroids являются ex vivo система 3-мерного культуры генерируется из стволовых клеток, изолированных от кишечных склепы образцов человеческой ткани кишечника. Эта модель наземного разорвать был впервые, Hans Clevers et al. в 2007 году после обнаружения Lgr5 + стволовых клеток в склепы тонкой кишки у мышей1. Их работа заложила основу для установления ex vivo кишечного эпителия культуры несколько типов клеток, которые могут быть пассированной без значительных генетических и физиологических изменений2. После этого открытия enteroids использовались как Роман модель для изучения нормальной физиологии пищеварения и патофизиологии кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника, хост возбудитель взаимодействия и регенеративной медицины2.
Использование в enteroids как ex vivo модель для изучения кишечных патофизиологии имеет ряд преимуществ перед альтернативные методы. За последние несколько десятилетий Животные модели и увековечен кишечного рака производные клеточных линий использовались для изучения физиологии кишечника3,4,5. Сингл клеточных культур не отражают разнообразие типов клеток в нормальной кишечного эпителия, тем самым не хватает в ячейке кросс talk и сегмент специфичность белков, сигнализации и индуцированных возбудителя болезни6. Стволовые клетки в enteroids дифференцироваться в основных типов эпителиальных клеток, таких как enterocytes, Paneth клетки, бокаловидных клеток, клеток enteroendocrine и более3. Они проявляют полярности, эпителиальные транспортных функций и позволяют для кишечных сегмент специфика6. Поскольку enteroids можно повторить несколько типов клеток кишечного эпителия человека, они могут преодолеть это ограничение признанных систем на основе клеток рака. Со временем производные клеточных линий subcloned и развиваться, чтобы выставлять большее разнообразие в выражение и локализация протеина3. Напротив enteroids может быть пассированной без значительных генетических и физиологических изменений2. Хотя существует множество животных моделей для NEC, ответ на травмы и терапевтические мероприятия может быть сильно варьирует между видами. В результате этих ограничений, терапевтов, полученных от животных моделей неудачу 90% времени при тестировании в человеческих испытаний из-за различий в токсичности или эффективность3. Enteroids служат в качестве перспективных доклинических моделей, которые можно преодолеть эти недостатки, ведущих к лучшему пониманию сложных кишечных патофизиологии и, следовательно, более успешным и экономически эффективных терапевтических инноваций. Существует также недавние свидетельства того, что возраст ткани, создаваемый enteroid остается биологически важных7. Это особенно важная деталь для нашей модели, так как enteroids генерируются из новорожденных ткани, тем самым сохраняя физиологическое значение для пациентов с НВК.
Утилита enteroids как модели заболеваний человека продолжает расширяться, в надежде найти лекарства от серьезных и широко распространенных условий. Некротизирующего энтероколита (НЭК) является разрушительной кишечных заболеваний новорожденных характеризуется кишечных некроза и часто приводит к перфорации кишечника стены, сепсис и смерти8. Из-за сложных и многофакторных патофизиологии NEC точный механизм заболевания не еще не выяснен полностью; Однако повышение проницаемости кишечной ясно было вовлечено в процесс болезни8. Учитывая, что изучение NEC и потенциальных терапевтических агентов является этически сложный в человеке, особенно детей, это крайне желательно использовать биологически соответствующих enteroid модель NEC с использованием тканей человека новорожденных. До настоящего времени enteroids имеют ограниченную роль в изучении NEC. Этот протокол описывает использование enteroids, производный от образцов человеческой ткани кишечника как Роман ex vivo модель для изучения некротизирующего энтероколита.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот роман ex vivo человека кишечные enteroid модель служит полезным методом для изучения дисфункции кишечника барьер в некротизирующего энтероколита (НЭК). Представленные здесь методы обработки enteroid были адаптированы из предыдущей работы Drs. Misty добра, Майкл Helmrath и Джейсон Wertheim10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальный институт здравоохранения Институт диабета и пищеварительной и Грант болезни почек (K08DK106450) и Джей Гросфельд премию от Американской ассоциации детской хирургической C.J.H.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
- Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
- Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
- Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).
