Enteroids ontstaan als een nieuwe model in de studie van ziekten bij de mens. Het protocol wordt beschreven hoe een enteroid model van menselijke necrotizing enterocolitis met behulp van lipopolysaccharide (LPS) behandeling van enteroids gegenereerd op basis van neonatale weefsel te simuleren. Verzamelde enteroids tonen ontstekingsreactie verwant aan degenen gezien in menselijke necrotizing enterocolitis.
Necrotiserende enterocolitis is (NEC) een verwoestende ziekte van pasgeboren zuigelingen. Het wordt gekenmerkt door meerdere pathofysiologische veranderingen in de menselijke darm epitheel, leiden tot verhoogde intestinale permeabiliteit, verminderde teruggave en toegenomen celdood. Hoewel er talrijke diermodellen van NEC, is er mogelijk reactie op letsel en therapeutische interventies zeer variabel tussen soorten. Bovendien is het ethisch uitdagend om te studeren pathofysiologie van de ziekte of nieuwe therapeutische middelen rechtstreeks in menselijke proefpersonen, met name kinderen. Daarom is het wenselijk om een nieuw model van NEC met behulp van menselijke weefsels te ontwikkelen. Enteroids zijn 3-dimensionale organoids afgeleid van intestinale epitheliale cellen. Ze zijn ideaal voor de studie van complexe fysiologische interacties, cel signalering en verdediging van de gastheer-pathogeen. In dit manuscript beschrijven we een protocol dat culturen menselijke enteroids na isoleren van intestinale stamcellen van patiënten die een resectie van de darm. De crypte cellen worden gekweekt in medium met groeifactoren die differentiatie in de verschillende cel typen inwoner van de menselijke intestinaal epitheel aanmoedigen. Deze cellen worden gekweekt in een synthetische, collagene mix van proteïnen toe die als een steiger dienen, het nabootsen van de extra-cellulaire kelder-membraan. Dientengevolge, ontwikkelen enteroids apicale-basolaterale polariteit. Co beheer van lipopolysaccharide (LPS) in media veroorzaakt een ontstekingsreactie in de enteroids, leiden tot histologische, genetische en eiwit expressie veranderingen vergelijkbaar zijn met die in de menselijke NEC gezien. Een experimenteel model van NEC met behulp van menselijk weefsel kan bieden een nauwkeuriger platform voor drugs- en behandeling testen voorafgaand aan de menselijke proeven, als we streven naar een remedie voor deze ziekte te identificeren.
Menselijke enteroids zijn een ex vivo 3-dimensionale cultuur systeem gegenereerd op basis van stamcellen van intestinale crypten van menselijke intestinale weefselsteekproeven geïsoleerd. Dit baanbrekende model was baanbrekend werk verricht door Hans Clevers et al. in 2007 na de ontdekking van Lgr5 + stamcellen in de crypten van de dunne darm in muizen1. Hun werk legden de basis voor de vaststelling van een ex vivo intestinale epitheliale cultuur van meerdere celtypen die zonder belangrijke genetische of fysiologische veranderingen2kan worden gepasseerd. Sinds deze ontdekking, hebben enteroids gebruikt als een nieuwe model normale spijsvertering fysiologie, en de pathofysiologie van intestinale ziekten zoals ontstekingsdarmziekte, gastheer-pathogeen interacties en regeneratieve geneeskunde2te gaan studeren.
Het gebruik van enteroids als een ex vivo model voor de studie van intestinale pathofysiologie heeft diverse voordelen ten opzichte van alternatieve technieken. Voor de afgelopen decennia, zijn diermodellen en vereeuwigd intestinale kanker-afgeleide cellijnen gebruikt om te studeren van intestinale fysiologie3,4,5. Eencellige culturen vertegenwoordigen niet de diversiteit van de soorten cellen aanwezig zijn in normale intestinale epitheel, waardoor het ontbreken van cel naar cel cross-talk en segment-specificiteit in eiwit expressie, signalering en pathogene agens veroorzaakte ziekte6. Stamcellen in enteroids onderscheiden in de grote soorten van de epitheliale cellen zoals enterocyten, Paneth cellen, goblet cellen, enteroendocrine cellen en meer3. Ze vertonen polariteit, epitheliale vervoer functies vervullen, en zorgen voor intestinale segment specificiteit6. Sinds enteroids het meerdere celtypen van menselijke intestinaal epitheel recapituleren kan, kunnen zij overwinnen deze erkende beperking van kanker cel-gebaseerde systemen. Na verloop van tijd derivaten van cellijnen zijn subcloned en evolueren tot grotere diversiteit in eiwit expressie en localisatie3vertonen. Integendeel, kan enteroids worden gepasseerd zonder belangrijke genetische of fysiologische veranderingen2. Hoewel talrijke diermodellen voor NEC bestaat, is er wellicht antwoord op letsel en therapeutische interventies zeer variabel tussen soorten. Als gevolg van deze beperkingen, mislukken therapeutics afgeleid van diermodellen 90% van de tijd wanneer het wordt getest in menselijke proeven als gevolg van verschillen in toxiciteit of werkzaamheid3. Enteroids dienen als veelbelovende preklinische modellen die kunnen overwinnen deze tekortkomingen, wat leidt tot een beter begrip van de complexe intestinale pathofysiologie en daarom meer succesvolle en kosteneffectieve therapeutische innovaties. Er zijn ook recente aanwijzingen dat de leeftijd van het weefsel dat een enteroid wordt gegenereerd uit biologisch belangrijke7blijft. Dit is een zeer belangrijk detail voor ons model omdat enteroids zijn gegenereerd op basis van neonatale weefsel, waardoor het behoud van fysiologische relevantie aan patiënten met NEC.
Het nut van enteroids als modellen van aandoeningen bij de mens blijft uitbreiden, in de hoop vinden Vulkaniseert tot ernstige en pervasieve voorwaarden. Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een verwoestende intestinale ziekte van pasgeborenen gekenmerkt door intestinale necrose en leidt vaak tot perforatie van de wand van de darm, bloedvergiftiging en dood8. Als gevolg van de complexe en multifactoriële pathofysiologie van NEC, heeft het exacte mechanisme van de ziekte niet nog is volledig toegelicht; verhoogde intestinale permeabiliteit heeft echter duidelijk betrokken bij de ziekte proces8. Aangezien dat de studie van NEC en potentiële therapeutische agenten is ethisch uitdagend bij menselijke proefpersonen, met name kinderen, het is bijzonder wenselijk gebruik te maken van een biologisch relevante enteroid model van NEC met behulp van menselijke neonatale weefsel. Enteroids hebben tot nu toe een beperkte rol in de studie van NEC. Dit protocol beschrijft het gebruik van enteroids die zijn afgeleid van menselijke intestinale weefselsteekproeven als een roman ex vivo model voor de studie van necrotiserende enterocolitis.
Deze roman ex vivo menselijke intestinale enteroid model fungeert als een handige methode voor de studie van de intestinale barrière dysfunctie in necrotiserende enterocolitis (NEC). De enteroid verwerkingsmethoden hier gepresenteerd werden aangepast uit de vorige werk van Drs. Misty Good, Michael Helmrath en Jason Wertheim10,11,12.
Details rond de gehele weefsel collectie en timing van de crypte iso…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het nationale Instituut van gezondheid Instituut van Diabetes en spijsverterings en nier ziekte Grant (K08DK106450) en de Jay Grosfeld Award van de American Pediatric chirurgische Association aan C.J.H.
4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
[leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |