En roman menneskelige epitelial Enteroid Model af nekrotiserende Enterocolitis
Summary
Enteroids dukker op som en roman model i studiet af menneskers sygdom. Protokollen beskriver hvordan man simulere en enteroid model af menneskelige nekrotiserende enterocolitis ved hjælp af LPS (LPS) behandling af enteroids genereret fra neonatal væv. Indsamlede enteroids vise inflammatoriske forandringer beslægtet med dem, der ses i menneskelige nekrotiserende enterocolitis.
Abstract
Nekrotiserende enterocolitis er (NEC) en ødelæggende sygdom hos nyfødte spædbørn. Det er kendetegnet ved flere patofysiologiske forandringer i den menneskelige intestinale epitel, fører til øget intestinal permeabilitet, nedsat tilbagelevering og øget celledød. Selvom der er adskillige dyremodeller for NEC, kan svar til skade og terapeutiske indgreb være meget varierende mellem arter. Derudover er det etisk udfordrende at studere sygdom Patofysiologi eller roman terapeutiske agenter direkte i forsøgspersoner, især børn. Derfor er det ønskeligt at udvikle en ny model af NEC ved hjælp af menneskelige væv. Enteroids er 3-dimensionel organoids stammer fra tarm epitel celler. De er ideelle til studiet af kompleks fysiologisk interaktioner, celle signalering og vært-patogen forsvar. I dette manuskript beskrive vi en protokol at kulturer menneskelige enteroids efter isolere intestinal stamceller fra patienter i tarm resektion. Krypten celler er kulturperler i medier indeholdende vækstfaktorer, der fremmer differentiering af de forskellige celle typer indfødte af den menneskelige intestinale epitel. Disse celler dyrkes i en syntetisk, kollagen blanding af proteiner, der tjener som et stillads, efterligne den ekstra-cellulære basalmembranen. Som følge heraf udvikle enteroids apikale basolateral polaritet. Fælles administration af LPS (LPS) i medier forårsager en inflammatorisk reaktion i enteroids, fører til Histologisk, genetiske og protein udtryk ændringer ligner dem set i menneskelige NEC. En eksperimentel model af NEC ved hjælp af menneskelige væv kan give en mere nøjagtig platform for narkotika og behandling prøveudtagning før forsøg på mennesker, som vi stræber efter at finde en kur mod denne sygdom.
Introduction
Menneskets enteroids er en ex vivo 3-dimensionelle kultur system genereret fra stamceller isoleret fra tarm Krypter af menneskelige intestinal vævsprøver. Denne banebrydende model var banebrydende ved Hans Clevers et al. i 2007 efter opdagelsen af Lgr5 + stamceller på Krypter af tyndtarmen i mus1. Deres arbejde lagde fundamentet for etablering af en ex vivo intestinale epitel kultur af flere celletyper, der kunne være passaged uden betydelige genetiske eller fysiologiske ændringer2. Siden denne opdagelse, er enteroids blevet brugt som en ny model til at studere normal mave fysiologi og Patofysiologi af tarm sygdomme som inflammatorisk tarmsygdom, vært-patogen interaktioner og regenerativ medicin2.
Brugen af enteroids som en ex vivo model for studiet af intestinal Patofysiologi har flere fordele sammenlignet med alternative teknikker. For de sidste mange årtier, blevet dyremodeller og udødeliggjort tarm kræft-afledte cellelinjer brugt til at studere intestinal fysiologi3,4,5. Encellede kulturer repræsenterer ikke forskellige celletyper findes i normal tarm epitel, dermed mangler celle til celle cross-talk og segment-specificitet i protein udtryk, signalering og patogen-induceret sygdom6. Stamceller i enteroids differentiere i store epitelcelle typer såsom enterocytes, Paneth cellerne, goblet celler, enteroendocrine celler og mere3. De udviser polaritet, udføre epithelial transport funktioner og mulighed for intestinal segment specificitet6. Da enteroids kan sammenfatte de flere celletyper af menneskelige intestinale epitel, er de i stand til at overvinde denne anerkendte begrænsning af kræft celle-baserede systemer. Over tid, derivater af cellelinjer er subcloned og udvikle sig til at udvise større mangfoldighed i protein udtryk og lokalisering3. Tværtimod, kan enteroids være passaged uden betydelige genetiske eller fysiologiske ændringer2. Selv om adskillige dyremodeller for NEC findes, kan svar til skade og terapeutiske indgreb være meget varierende mellem arter. Som følge af disse begrænsninger, therapeutics udledes fra dyremodeller mislykkes 90% af tiden når testet i menneskelige forsøg på grund af forskelle i toksicitet eller virkning3. Enteroids tjene som lovende prækliniske modeller, der kan afhjælpe disse mangler, hvilket fører til en bedre forståelse af komplekse intestinal Patofysiologi og derfor, mere vellykket og omkostningseffektivt terapeutiske nyskabelser. Der er også de seneste beviser på, at alder af væv, der en enteroid genereres fra forbliver biologisk vigtige7. Dette er en specielt vigtig detalje for vores model da enteroids er genereret fra neonatal væv, dermed bevare fysiologisk relevans for patienter med NEC.
Nytte af enteroids som modeller for humane sygdomme fortsætter med at udvide, i håb om at finde kur alvorlige og udbredte betingelser. Nekrotiserende enterocolitis (NEC) er en ødelæggende tarm sygdom hos nyfødte karakteriseret ved tarm nekrose og ofte fører til perforering af tarmvæggen, sepsis og død8. På grund af den komplekse og multifaktoriel Patofysiologi af NEC, har den nøjagtige mekanisme af sygdommen ikke endnu blevet fuldt belyst; imidlertid har øget intestinal permeabilitet klart været impliceret i sygdom proces8. Da studiet af NEC og potentielle terapeutiske agenter er etisk udfordrende på mennesker, især børn, er det ønskeligt at udnytte en biologisk relevante enteroid model af NEC ved hjælp af menneskelige neonatal væv. Hidtil har enteroids en begrænset rolle i studiet af NEC. Denne protokol beskriver brugen af enteroids stammer fra menneskelige intestinal vævsprøver som en roman ex vivo model for studiet af nekrotiserende enterocolitis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne roman ex vivo menneskelige tarm enteroid model fungerer som en nyttig metode til undersøgelse af intestinal barriere dysfunktion i nekrotiserende enterocolitis (NEC). Enteroid forarbejdningsmetoderne præsenteres her var tilpasset fra den tidligere arbejde af Drs. Misty Good, Michael Helmrath og Jason Wertheim10,11,12.
Detaljer omkring hele væv samling og timing crypt isolationsniveauet er vig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det nationale institut sundhed Institut for Diabetes og Digestive og nyre sygdom Grant (K08DK106450) og Jay Grosfeld Award fra den amerikanske Pediatric kirurgisk forening til C.J.H.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
- Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
- Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
- Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).
