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Immunology and Infection

Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante

doi: 10.3791/59194 Published: April 10, 2019

Summary

Enteroids sont en train de devenir un nouveau modèle dans l’étude des maladies humaines. Le protocole décrit comment simuler un modèle enteroid de l’entérocolite nécrosante humain utilisant lipopolysaccharide (LPS) traitement d’enteroids produit du tissu néonatal. Enteroids recueillis montrent des modifications inflammatoires semblables à ceux vus dans l’entérocolite nécrosante humaine.

Abstract

L’entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie dévastatrice chez le nouveau-né. Il se caractérise par plusieurs altérations physiopathologiques de l’épithélium intestinal humain, conduisant à une augmentation de la perméabilité intestinale, avec facultés affaiblies de restitution et a augmenté la mort cellulaire. Bien qu’il existe de nombreux modèles animaux de l’entérocolite Nécrosante, réponse à des blessures et des interventions thérapeutiques peut-être être très variable entre les espèces. En outre, il est éthiquement difficile d’étudier la physiopathologie de la maladie ou de nouveaux agents thérapeutiques directement sur des sujets humains, en particulier les enfants. Par conséquent, il est hautement souhaitable d’élaborer un nouveau modèle de NEC à l’aide de tissus humains. Enteroids y a 3 dimensions organoïdes dérivées de cellules épithéliales intestinales. Elles sont idéales pour l’étude des interactions physiologiques complexes, la signalisation cellulaire et de la défense de l’hôte-pathogène. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole cette enteroids humaine de cultures après isoler des cellules souches intestinales des patients devant subir une résection de l’intestin. Les cellules des cryptes sont cultivées dans des milieux contenant des facteurs de croissance favorisant la différenciation dans le natif de types différentes cellules de l’épithélium intestinal humain. Ces cellules sont cultivés dans un mélange synthétique, collagène de protéines qui servent comme un échafaudage, imitant la membrane basale extra-cellulaires. Ainsi, enteroids développer apicale-basolatérale polarité. L’administration concomitante du lipopolysaccharide (LPS) dans les médias provoque une réaction inflammatoire dans l’enteroids, menant à histologique, génétiques et altérations d’expression de protéines similaires à celles observées chez les humain NEC. Un modèle expérimental de NEC à l’aide de tissus humains peut fournir une plateforme plus précise pour les médicaments et traitements tests avant les essais chez l’homme, nous nous efforçons d’identifier un remède pour cette maladie.

Introduction

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Enteroids humains sont un ex vivo système de culture 3 dimensions généré à partir de cellules souches isolées de cryptes intestinales des échantillons de tissu intestinal humain. Ce modèle révolutionnaire a été lancé par Hans Clevers et coll. en 2007 suite à la découverte de Lgr5 + des cellules souches dans les cryptes de l’intestin grêle dans la souris1. Leur travail a jeté les bases pour l’établissement d’un ex vivo la culture épithéliale intestinale de plusieurs types de cellules qui pourraient être repiquées sans modifications génétiques ou physiologiques importantes2. Depuis cette découverte, enteroids ont servi comme un nouveau modèle pour étudier la physiologie digestive normale et la physiopathologie des maladies intestinales telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, interactions hôte-pathogène et la médecine régénérative,2.

L’utilisation d’enteroids comme un ex vivo de modèle pour l’étude de la physiopathologie intestinale présente plusieurs avantages sur les autres techniques. Pour les dernières décennies, les modèles animaux et lignées cellulaires dérivées de cancer intestinal immortalisées ont servi à étudier la physiologie intestinale3,4,5. Single-cell cultures ne représentent pas la diversité des types de cellules présents dans l’épithélium intestinal normal, manquant ainsi une cellule à la diaphonie et segment-spécificité dans l’expression de la protéine, la signalisation et la maladie induite par l’agent pathogène6. Enteroids les cellules souches se différencient en les principaux types de cellules épithéliales comme les entérocytes, cellules de Paneth, cellules caliciformes, cellules entéroendocrines et plus3. Ils présentent la polarité, assure les fonctions de transport épithélial et permettant un segment intestinal spécificité6. Étant donné qu’enteroids peut récapituler les multiples types de cellules de l’épithélium intestinal humain, ils sont capables de surmonter cette limitation reconnue des systèmes basés sur les cellules de cancer. Au fil du temps, dérivés de lignées cellulaires sont sous-cloné et d’évoluent pour exposer une plus grande diversité d’expression et la localisation protéine3. Au contraire, les enteroids peuvent être repiquées sans modifications génétiques ou physiologiques importantes2. Bien qu’il existent de nombreux modèles animaux pour NEC, réponse à des blessures et des interventions thérapeutiques peut-être être très variable entre les espèces. En raison de ces limitations, produits thérapeutiques dérivés de modèles animaux ne parviennent pas à 90 % du temps lorsqu’il est testé dans des essais humains en raison de différences dans la toxicité ou l’efficacité3. Enteroids servir de modèles précliniques prometteurs qui peuvent surmonter ces insuffisances, conduisant à une meilleure compréhension de la physiopathologie intestinale complexe et donc plus efficace et rentables des innovations thérapeutiques. Il y a aussi des éléments de preuve récente que l’âge des tissus qui ont un enteroid est généré reste biologiquement importants7. Il s’agit d’un détail particulièrement important pour notre modèle puisque les enteroids sont générés à partir du tissu néonatal, ainsi maintenir la pertinence physiologique aux patients avec NEC.

L’utilité d’enteroids comme modèles de maladies humaines continue à se développer, dans l’espoir de trouver des remèdes aux conditions graves et profondes. L’entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie dévastatrice intestinale des nouveaux-nés que se caractérise par une nécrose intestinale et fréquemment conduit à la perforation de la paroi intestinale, septicémie et mort8. En raison de la physiopathologie complexe et multifactorielle de l’entérocolite Nécrosante, le mécanisme exact de la maladie n'a pas encore été complètement élucidé ; Cependant, une augmentation de la perméabilité intestinale a été clairement impliquée dans le processus de la maladie8. Étant donné que l’étude de NEC et agents thérapeutiques potentiels est éthiquement difficile sur des sujets humains, en particulier les enfants, il est hautement souhaitable d’utiliser un modèle d’enteroid biologiquement pertinente de NEC à l’aide de tissus humains néonatale. Jusqu’ici, les enteroids ont un rôle limité dans l’étude de l’entérocolite Nécrosante. Ce protocole décrit l’utilisation d’enteroids provenant d’échantillons de tissu intestinal humain comme un roman ex vivo de modèle pour l’étude de l’entérocolite nécrosante.

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Protocol

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Approbation du Conseil d’examen de l’établissement a été obtenue (CISR #2013-15152) pour la collecte d’échantillons de tissus de patients devant subir une résection de l’intestin à Ann et Robert H. Lurie Children Hospital de Chicago, Chicago, Illinois. Tous les protocoles ont été effectuées conformément aux lignes directrices nationales et institutionnelles et règlements pour le bien-être de l’humanité. Consentement parental éclairé écrit était requise et obtenu avant le prélèvement des échantillons dans tous les cas.

1. préparation du réactif

  1. Préparer la solution mère de milieux de Culture pour la collection de tissus entiers : 1 L de Dulbecco modifié Eagle (DMEM), 110 mL de fœtale Bovine sérique (FBS), 11 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %) et 1,1 mL d’insuline stérilisée par filtration (concentration finale de 0,1 %). Stocker la solution-mère à 4 ° C.
  2. Préparer la chélation tampon #1 : 30 mL de milieu de Culture (comme décrit au point 1.1), 600 µL de 0,5 M d’acide Tétraacétique (EDTA) (concentration finale 10 mM), 300 µL de gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL d’amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %). Stocker la solution-mère à 4 ° C.
  3. Préparer la chélation tampon #2 : 30 mL de milieu de Culture (comme décrit au point 1.1), 300 µL de 0,5 M EDTA (concentration finale de 5mM), 300 µL de gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL d’amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %). Stocker la solution-mère à 4 ° C.
  4. Préparer les milieux de Minigut humaine : 41,4 mL de DMEM/F-12, 5 mL de FBS (derniers 10 %), 500 µL de pénicilline-streptomycine (concentration finale 1 %), 500 µL de L-glutamine (concentration finale 1 %), 500 µL de gentamicine (concentration finale 1 %), 100 µL de l’amphotéricine B (final concentration 0,2 %), 500 µL de 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonique (HEPES) (concentration finale 10 mM), supplément de 500 µL de 100 x N-2 et 1 mL de 50 x B-27 supplément moins de vitamine A pour un volume total de 50 mL. Solution stock de la boutique à-20 ° C.
  5. Préparer les humains Minigut Media Complete : 10 mL d’humain Minigut Media (préparée en 1.4), 10 µL de 100 µg/mL Wnt3a (concentration finale 100 ng/mL), 10 µL de 100 µg/mL caboche (concentration finale 100 ng/mL), 10 µL de 1 mg/mL R-Spondin (concentration finale 1 µg/mL) , 10 µL de 500 µg/mL de facteur de croissance épidermique (EGF) (concentration finale 50 ng/mL), 10 µL de 1 M N-acétylcystéine (concentration finale de 1 mM), 10 µL de 10 mM Y-27632 (concentration finale 10 µM), 10 µL de 500 µM A-83 (concentration finale 500 nM), 10 µL de 10 mM (final SB202190 concentration de 10 µM), 100 µL de 1 M Nicotinamide (concentration finale 10 mM) et 1 µL de 100 µM [leu] 15-gastrine 1 (concentration finale 10 nM). Volume total 10 mL. Stocker la solution-mère à 4 ° C.
    Remarque : Des solutions doivent être utilisées sous 48 h.

2. crypte Isolation et le placage du tissu entier

  1. Au moment de la collecte dans la suite du dispositif, placer l’échantillon de tissu intestinal petit humain dans de Dulbecco froid Phosphate Buffered Saline (SPD). Laver l’échantillon au SPD froid jusqu’au clair de selles et de sang. Stocker l’échantillon à 4 ° C dans un milieu RPMI 1640 jusqu’au moment de l’isolement de la crypte.
    Remarque : Les tissus ne peuvent être stockés plus de 24h.
    1. S’assurer que l’échantillon est clair de selles et de sang. À l’aide de ciseaux de dissection délicate, enlever tout excès graisses ou chirurgicales agrafes etc.. Peser l’échantillon.
      Remarque : Viser une pièce environ 0,75 à 2,5 g.
  2. Couper l’échantillon en morceaux de 0,5 cm et placer dans 30 mL de tampon de chélation #1 (tel qu’établi à l’étape 1.2).
    1. Agiter à basse vitesse pendant 15 min à 4 ° C.
    2. Tissu filtrer sur un tamis de cellule 100 µm et jeter les traversent.
  3. Ajouter le tissu à 30 mL de tampon de chélation #2 (tel qu’établi à l’étape 1.3).
    1. Agiter à basse vitesse pendant 15 min à 4 ° C.
    2. Filtre tissu à travers un tamis de cellule de 100 µm et jeter les traversent.
  4. Décongelez les 500 mL de matrice de la membrane basale sur la glace pour une utilisation à l’étape 2.8.
  5. Ajouter des tissus à 10 mL de DMEM froid dans un tube conique de 50 mL et agiter vigoureusement à la main pendant 10 s.
    1. Filtrer à travers un tamis de cellule de 100 µm et recueillir le débit à travers (étiquette #1). Maintenir le tube #1 sur la glace.
    2. Ajouter des tissus pour un autre 10 mL de DMEM froid dans un tube conique séparé 50 mL et agiter vigoureusement à la main pendant 10 s.
    3. Filtrer à travers un tamis de cellule de 100 µm et recueillir les flux à travers (label #2).
    4. Répéter deux fois jusqu'à ce qu’il y a quatre tubes coniques avec accréditives (tubes étiquetés #1-4).
  6. Filtre tube #1 solution à travers un 100µm cellule crépine et transfert traversent dans tube conique 15 mL (étiquette #1). Répétez de #2 à 4.
    1. Centrifuger 15 mL tubes #1-4 à 200 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  7. Dans la hotte à flux laminaire, retirez le surnageant de tubes #1-4 et jetez-le. Ne pas perturber le nuage des tissus immédiatement au-dessus de la pastille, même si cela signifie laisser certains surnageant.
    1. Mélanger ensemble en pipettant également, lentement, le culot avec les restes du surnageant dans les tubes #1-4.
    2. Transférer le mélange des tubes #1-4 dans un tube conique unique de 2 mL.
    3. Centrifuger le tube conique à 200 x g pendant 20 min à 4 ° C.
  8. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 500 µL de matrice de la membrane basale.
    Remarque :
    garder la matrice de la membrane basale sur glace en tout temps et travailler rapidement pour les prochaines étapes. Ce produit polymérise très rapidement à la température ambiante.
    1. Appliquer 50 µL de spécimen/basement membrane matrice suspension au centre d’un puits dans une plaque 24 puits. Elle devra figurer en forme de dôme.
      Remarque : Utilisation de pointes de pipette réfrigérés favorise transfert plus lisse de la suspension, réduisant au minimum la polymérisation.
    2. Répéter 9 fois pour remplir 10 puits de totales.
  9. Placer la plaque 24 puits à 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pendant 30 min permettre la polymérisation.
  10. Ajouter 500 µL de Human Minigut Media complet (tel qu’établi à l’étape 1.5) dans chaque puits. Remplacer tous les 2 jours.
  11. Recueillir des enteroids après 5-10 jours, quand le bourgeonnement est visualisé. Voir les étapes 4 et 5 pour obtenir des instructions de la collection.

3 induction of Experimental NEC

  1. Ajouter 10 µL de 5 mg/mL de lipopolysaccharides (LPS) à 500 µL de Human Minigut Media complet (tel qu’établi à l’étape 1.5) dans chaque puits au jour 0. Remplacer tous les 2 jours jusqu'à la collection.

4. préparation pour l’enrobage de paraffine

  1. Retirez délicatement les médias.
    1. Ajouter 1 mL de PBS et pipetez doucement haut et bas pour dissoudre la matrice de la membrane basale avec soin ne pas pour lyser les enteroids.
    2. Centrifuger PBS/enteroid mélange à < 300 x g pendant 5 min à pellet et supprimer les PBS.
  2. Ajoutez 4 % paraformaldéhyde à difficulté à température ambiante pendant 1 h.
  3. Centrifuger à < 300 x g pendant 5 min pour pellet, puis supprimer les PBS.
    1. Laver délicatement avec 1 mL de PBS et centrifuger à < 300 x g pendant 5 min pour pellet, puis supprimer les PBS.
    2. Répétez l’étape 4.3.1.
  4. Faire fondre un volume suffisant du tissu traitement gel (environ 300 µL) en plaçant la quantité désirée dans un tube conique et le réchauffement dans un incubateur bain sec à 65 ° C pendant 3 à 10 min jusqu'à ce que liquide.
    1. Ajouter le tissu traitement gel au culot et mélanger doucement.
    2. Sur un lamelle couvre-objet, placez un petit anneau de clonage.
    3. Pipeter le tissu mélange de gel et enteroid de traitement dans un anneau de clonage monté sur un lamelle couvre-objet.
  5. Laisser le tissu mélange de gel et enteroid à se solidifier à 4 ° C pendant 1 h de traitement.
    1. Submerger la bague de clonage avec mélange solidifié dans l’éthanol à 70 % en préparation pour l’enrobage de paraffine.

5. Enteroid Collection d’ARN et de protéine d’Extraction

  1. Retirez doucement humaine Minigut Media complet de chaque puits.
  2. Ajouter 1 mL de PBS et pipetez doucement haut et bas pour dissoudre la matrice de la membrane basale. Veillez à ne pas dissocier l’enteroids.
    1. Placer PBS/enteroid mélange dans un tube conique stérile de 2 mL.
    2. Centrifuger à < 300 x g pendant 5 min granuler.
    3. Retirez délicatement le PBS, en prenant soin de ne pas pour enlever l’enteroids.
  3. Répétez l’étape série 5.2 deux fois plus.
  4. Congeler à-80 ° C jusqu’au moment de la protéine ou extraction de l’ARN.
  5. Effectuer le gène expression protéique isolement et de l’enteroids en utilisant bien établie qRT-PCR et les techniques Western Blotting.

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Representative Results

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Immédiatement après l’ensemencement, les cryptes intestinales fraîchement isolés apparaissent sous forme de tiges allongées. Dans les heures, l’enteroid aura une apparence ronde (Figure 1a). Au cours des prochains jours, l’enteroids va commencer formant des sphères comme on le voit dans la Figure 1b. En herbe doit avoir lieu entre 5-10 jours (Figure 1c) et enteroid collection devrait avoir lieu à ce moment-là.

L’enteroids croissante exposera également la polarité, contenant un lumen centralisé, une frontière apicale et un domaine basolatéral (Figure 2). Enteroids montrent également l’intégrité structurale, représentée par un cytosquelette d’actine robuste (Figure 3). Après plusieurs jours de culture, les enteroids LPS traités apoptose plus d’expérience et auront un rendement plus faible que le groupe de contrôle (Figure 4). Comme on le voit dans NEC humaine et modèles murins de NEC9, une augmentation de l’expression des récepteurs Toll-like 4 (TLR4) a été trouvée dans enteroids LPS traités par rapport aux témoins (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : Culture de la crypte et formation humaine enteroid du tissu entier. (un) jour 0 crypte culture avec aspect rond et plat. (b) jour 4 enteroids avec formation de sphéroïde. enteroids (c), 7 jours par bourgeonnement (flèche noire). Barreaux de l’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 2
Figure 2 : Aspect histologique d’un enteroid. Haemotoxylin et les taches d’éosine. L’enteroid affiche un lumen centralisé et polarité, avec un nom de domaine apical et basolatérale des expositions. Le haemotoxylin (violet) représente le noyau, tandis que l’éosine (rose) représente les composants cytosoliques. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Cytosquelette d’actine Enteroid. Réagissant à balayage d’un enteroids. L’enteroid affiche l’intégrité structurale, comme en témoigne le cytosquelette d’actine proéminent (magenta). Les noyaux colorés au DAPI (bleu), échelle bar = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Traitement de LPS diminue, rendement de la culture humaine enteroid. Jour 5 enteroids en culture, issue du même échantillon de tissus entiers. (un) Enteroids traités avec des milieux de culture de contrôle. Afficher une croissance vigoureuse. (b) Enteroids traités au LPS dans les milieux de culture. Seuls quelques survivants enteroids. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Expression TLR4 augmenté dans experimental NEC enteroids. (un) qRT-PCR a montré augmenté d’expression de l’ARNm de TLR4 en enteroids exposées aux LPS (p = 0,03). (b) analyse par Western blot montrant a augmenté l’expression de TLR4 en expérimentation humaine enteroid NEC (p = 0,02). Tache occidentale représentante représentée. Les valeurs sont moyens ± SEM de 3 échantillons par groupe. * p < 0,05 par test t de Student. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Ce roman ex vivo enteroid intestinal humain modèle sert d’une méthode utile pour l’étude du dysfonctionnement de la barrière intestinale dans l’entérocolite nécrosante (NEC). Les méthodes de traitement enteroid présentées ici ont été adaptés des travaux précédent du DRS Misty Good, Michael Helmrath et Jason Wertheim10,11,12.

Détails qui entoure l’ensemble prélèvement tissulaire et le calendrier de l’isolement de la crypte sont des étapes cruciales dans le présent protocole. Tissus doivent être prélevés immédiatement au moment de la résection du dispositif et traitées pour l’isolement de la crypte, dès que le tissu arrive dans le laboratoire. Nous avons sélectionné des tissus de patients de moins de 3 mois pour ce modèle. Traitement différé peut se produire dans les 24 heures après le prélèvement de tissus entiers si nécessaire. En outre, la qualité de l’échantillon de tissus humains affecte grandement le rendement de l’isolement de la crypte. Intestin grêle sain sans pathologie sous-jacente et de plus jeunes patients (< 2 mois d’âge) ont donné les meilleurs résultats. En outre, les tissus prélevés doivent être choisis dans la zone plus saine, généralement aux extrémités distales du spécimen réséqué. À l’aide d’un gros morceau d’intestin n’améliore pas l’isolement de la crypte avec les volumes de la solution décrite dans le protocole ci-dessus. Intestinal segmente environ 1-2 cm de long, pesant de 0,75 à 2,5 g sont optimales. L’induction de NEC expérimentale par l’exposition LPS s’inspire des modèles de culture et animal cellulaires bien établies. Le travail de Hackam et coll. ont montré le rôle essentiel des TLR4 (récepteur de LPS) en NEC développement9,13,14,15. Activation des LPS de TLR4 stimule les cytokines proinflammatoires, une réduction de l’intégrité de la barrière et l’activation des leucocytes sous-épithéliale qui caractérisent les événements de signalisation impliqués dans NEC humaine. TLR4 est considéré comme une molécule-clé dans la promotion de l’inflammation7 et animaux que manque fonctionnel TLR4 sont ont démontré de protection contre le développement de NEC15. Les taux circulants de LPS sont élevées chez les patients avec NEC et élevé dans les selles et plasma de modèles animaux de NEC. LPS induit une inflammation intestinale chez l’animal qui ressemble à NEC humaine, qui met en évidence l’importance de l’inflammation dans cette voie. Mise en miroir de la culture cellulaire établie et les modèles animaux de NEC, nous croyons que l’induction de NEC expérimentale par administration de LPS dans la culture enteroid est un outil utile ex vivo modèle néonatale humain pour l’étude de l’entérocolite Nécrosante. Conformément aux précédents rapports sur d’autres modèles établis, notre enteroids de NEC expérimentale a démontré une expression accrue de TLR4 par rapport aux témoins.

Le protocole d’induction de NEC expérimentale par l’exposition LPS a subi plusieurs modifications importantes et des améliorations. Au départ, enteroids ont été cultivées pendant 5 jours, puis inoculé LPS pendant 24 h et recueillies par la suite. Le protocole recommande maintenant l’inoculation LPS au jour 0, avec une exposition continuelle à chaque changement de milieux de culture jusqu'à la collection. En outre, la posologie de LPS a été optimisée. Après avoir effectué une courbe dose et l’essai de plusieurs différentes concentrations de LPS, 5 mg/mL a été sélectionné. Expérimentation avec inoculation LPS directement dans le mélange de matrice/enteroid membrane basale au moment de l’électrodéposition a également été mis à l’essai ; Cependant, c’était lourd et n’a pas amélioré les résultats.

Il y a des limites qui devraient être abordées comme l’utilisation du modèle enteroid humain évolue. Depuis la découverte en 2007, plusieurs protocoles différents ont été utilisés pour mettre en place et de la culture enteroids. Les nombreux facteurs de croissance nécessaires pour enteroid entretien et différenciation manque normalisation, qui peut affecter la reproductibilité. En outre, la culture enteroid n’a pas de forces mécaniques qui affectent l’épithélium intestinal humain dans des conditions physiologiques. Pression du péristaltisme et du flux Luminale peut influencer expression génique et protéique, ce qui n’est pas comptabilisée dans ce modèle. Ce modèle manque également les nerfs, les cellules immunitaires, microbiome, vascularisation et mésenchyme qui sont présents dans l’épithélium intestinal humain.

Exposition au LPS dans ce modèle enteroid intestinal humain provoque une réaction inflammatoire conduisant à histologique, génétique et altérations d’expression de protéines similaires à celles trouvent dans NEC humaine. Il existe plusieurs modèles animaux actuels de l’entérocolite Nécrosante, réponse aux blessures intestinales et des interventions thérapeutiques varie considérablement entre les espèces. Puisqu’il est éthiquement difficile d’étudier la physiopathologie de la maladie ou pour tester de nouveaux agents thérapeutiques directement chez l’homme, en particulier les nourrissons, il est extrêmement important de continuer à cultiver ce roman ex vivo modèle de NEC à l’aide de tissus humains. Enteroids humaines se prêtent à la modification génétique et peut être fondamentales dans le développement de thérapies pour nombreuses maladies de l’intestin humain16. Orientations futures devraient viser à la culture humaine enteroids sur un échafaud perméable dans une chambre de perfusion avec apicale et flux basolatérale pour reproduire l’architecture in vivo crypte-villosités ainsi que physiologique forces comme le péristaltisme et flux Luminale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health Institute, de diabète et Digestive et rénale maladie Grant (K08DK106450), le Jay Grosfeld le prix de l’Association américaine de chirurgie pédiatrique de C.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
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Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante
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Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).More

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

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