Summary

הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

Published: April 10, 2019
doi:

Summary

Enteroids מתגלים כמודל הרומן במחקר של מחלות אנושיות. הפרוטוקול מתאר כיצד לדמות מודל enteroid של האדם enterocolitis נפאסיאטיס באמצעות טיפול ליפופוליסכריד (LPS) enteroids שנוצר מרקמות neonatal. Enteroids שנאספו להדגים שינויים דלקתיים דומה לאלה לראות enterocolitis נפאסיאטיס אנושי.

Abstract

דלקת מעי נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית של יילוד תינוקות. זה מאופיין על ידי מספר שינויים pathophysiologic האפיתל מעיים אנושיים, המוביל אל הגברת חדירות המעי, ליקויי פיצוי, והגדילה מוות של תאים. למרות שיש רבים מודלים חייתיים של NEC, ייתכן בתגובה לפציעה והתערבויות טיפוליות משתנה מאוד בין המינים. יתר על כן, זה מאתגר מבחינה אתית ללמוד פתופסיולוגיה המחלה או הרומן סוכני טיפולית ישירות בנושאים אנושיים, במיוחד לילדים. לכן רצוי מאוד לפתח מודל הרומן של NEC באמצעות רקמה אנושית. Enteroids הם organoids תלת-ממדי שמקורם בתאי אפיתל המעי. הם אידיאליים עבור חקר אינטראקציות מורכבות הפיזיולוגיות, איתות התא ואת ההגנה פתוגן-פונדקאי. כתב יד זה נתאר פרוטוקול enteroids האנושי הזה תרבויות לאחר בידוד תאי גזע מעיים של חולים שעברו כריתה מעי. התאים קריפטה מתורבתים בתקשורת המכיל חומרים המעודדים בידול לתוך הילידים סוגי תאים שונים של האפיתל במעי האדם. תאים אלה גדלים תערובת סינתטית, סילוק של חלבונים לשמש לפיגום, מחקה קרום המרתף הסלולר במיוחד. כתוצאה מכך, enteroids לפתח קוטביות הפסגה-basolateral. ניהול משותף של ליפופוליסכריד (LPS) בתקשורת גורם לתגובה דלקתית enteroids, המוביל היסטולוגית, גנטית, וכן שינויים בביטוי חלבונים דומים לאלה לראות ב- NEC אנושי. מודל ניסיוני של NEC באמצעות רקמה אנושית עשוי לספק פלטפורמה יותר מדויק עבור תרופות וטיפול בדיקות לפני בניסויים בבני אדם, כאשר אנו שואפים לזהות תרופה למחלה זו.

Introduction

Enteroids האנושי הם אקסית vivo מערכת תרבות תלת-ממדי שנוצר מתאי גזע מבודד כוכים מעיים של דגימות רקמה אנושית מעיים. מודל זה פורצת היה חלוץ מאת הנס Clevers et al. בשנת 2007, בעקבות הגילוי של Lgr5 + תאי גזע-כוכים של המעי הדק עכברים1. העבודה שלהם הונחו היסודות להקמת אקסית vivo תרבות אפיתל המעי סוגי תאים מרובים, זה יכול להיות passaged ללא שינויים משמעותיים גנטית או הפיזיולוגיות2. מאז התגלית, enteroids שימשו כמודל הרומן ללמוד פיזיולוגיה עיכול נורמלי, הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים כגון מחלות מעי דלקתיות, אינטראקציות פתוגן-פונדקאי רפואה רגנרטיבית2.

השימוש של enteroids בתור אקסית vivo מודל לחקר פתופסיולוגיה מעיים יש כמה יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות. מספר עשורים, היו בשימוש בבעלי חיים וקווים מונצחים תא נגזר סרטן המעי ללמוד פיזיולוגיה מעיים3,4,5. תרבויות תא בודד אינם מייצגים את הגיוון של סוגי תאים נוכח נורמלי אפיתל המעי, ובכך חסר לתא צולבות לדבר וספציפיות קטע-ביטוי חלבון, איתות, מחלה הנגרמת הפתוגן6. בתאי גזע enteroids להתמיין סרן סוגי תאים אפיתל כגון enterocytes, Paneth תאים, תאי גביע, תאים enteroendocrine עוד3. הם מפגינים קוטביות, לבצע פונקציות תחבורה אפיתל, וגם מאפשרים קטע המעי ירידה לפרטים6. מאז enteroids ניתן לסכם מספר סוגי תא אפיתל המעי האנושי, הם מסוגלים להתגבר על מגבלה זו מוכרת של מערכות מבוססות תאי סרטן. לאורך זמן, נגזרות של שורות תאים הם subcloned ולהתפתח שהפגינו גיוון רב יותר חלבון בלוקליזציה וביטוי3. להיפך, enteroids יכול להיות passaged ללא שינויים משמעותיים גנטית או הפיזיולוגיות2. אמנם קיימים מודלים רבים של NEC, ייתכן בתגובה לפציעה והתערבויות טיפוליות משתנה מאוד בין המינים. בשל מגבלות אלו, שמקורם בבעלי חיים הרפוי להיכשל 90% מהזמן כאשר נבדק בניסויים האנושי בגלל ההבדלים רעילות או יעילות3. Enteroids לשמש מודלים קליניים מבטיח כי ניתן להתגבר על ליקויים אלה, המוביל אל הבנה טובה יותר של מורכבות פתופסיולוגיה מעיים, לכן, ועוד חידושים טיפולית מוצלחת וחסכונית. יש גם ראיות האחרונות הגיל של רקמת כי enteroid מופק נשאר חשוב מבחינה ביולוגית7. זהו פרט חשוב במיוחד עבור המודל שלנו מאז enteroids נוצרות מרקמות neonatal, ובכך שומר על רלוונטיות הפיזיולוגיות לחולים עם NEC.

השירות של enteroids בתור מודלים של מחלות אנושיות ממשיכה להתרחב, בתקווה למצוא מרפא לתנאים חמורה ו נרחבת. דלקת מעי נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית מעיים של neonates מאופיין נמק המעי וגורם לעתים קרובות לחירור של המעי קיר, הרעלת דם, מוות8. בשל פתופיזיולוגיה multifactorial ומורכבת של NEC, המכניזם המדויק של המחלה יש לא עדיין היה מלא מבואר; עם זאת, הגברת חדירות המעי היה בבירור מעורב תהליך המחלה8. נתון כי המחקר של NEC וסוכנים טיפולית פוטנציאל הוא מאתגר מבחינה אתית של ניסויים, במיוחד לילדים, רצוי מאוד לנצל את מודל enteroid רלוונטי מבחינה ביולוגית של NEC באמצעות רקמה אנושית neonatal. עד כה, enteroids יש תפקיד מוגבל במחקר של NEC. פרוטוקול זה מתאר את השימוש enteroids נגזר דגימות רקמה אנושית מעיים כמו רומן ex-vivo מודל לחקר נמקית.

Protocol

לאישור הדירקטוריון סקירה מוסדיים הושג (IRB #2013-15152) עבור אוסף של דגימות רקמה של חולים שעברו כריתה מעי אן ו רוברט ה’ לוריא לילדים החולים שיקגו, שיקגו, אילינוי. כל הפרוטוקולים בוצעו בהתאם הלאומית ולמוסדות הנחיות ותקנות לרווחת האדם. הסכמת ההורים הודיע בכתב היה נדרש וקיבלתי לפני איסוף הדגימה בכל ?…

Representative Results

מיד לאחר ציפוי, מופיעים כוכים מעיים טריים מבודד מוטות מוארך. בתוך שעות, יקבל enteroid בעל מראה עגול (איור 1). במשך מספר ימים, enteroids יתחיל ויוצרים כדורים כפי שניתן לראות באיור 1ב’. ניצני צריך להתרחש בין 5-10 ימים (איור 1</st…

Discussion

רומן זה ex-vivo enteroid מעיים אנושיים המודל משמש שיטה שימושית לצורך המחקר של תפקוד מכשול מעי נמקית (NEC). שיטות עיבוד enteroid המובאת כאן הוסבו מעבודה קודמת של ד”ר מיסטי טוב, מייקל Helmrath, ג’ייסון ורטהיים10,11,12.

הפרטים סביב כל אוסף רקמה והתז?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון של המוסד לביטוח לאומי של סוכרת, העיכול, גרנט מחלת הכליה (K08DK106450) ופרס ג’יי Grosfeld של האגודה האמריקאית כירורגי בילדים כדי C.J.H.

Materials

4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

View Video