Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

doi: 10.3791/59194 Published: April 10, 2019

Summary

Enteroids מתגלים כמודל הרומן במחקר של מחלות אנושיות. הפרוטוקול מתאר כיצד לדמות מודל enteroid של האדם enterocolitis נפאסיאטיס באמצעות טיפול ליפופוליסכריד (LPS) enteroids שנוצר מרקמות neonatal. Enteroids שנאספו להדגים שינויים דלקתיים דומה לאלה לראות enterocolitis נפאסיאטיס אנושי.

Abstract

דלקת מעי נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית של יילוד תינוקות. זה מאופיין על ידי מספר שינויים pathophysiologic האפיתל מעיים אנושיים, המוביל אל הגברת חדירות המעי, ליקויי פיצוי, והגדילה מוות של תאים. למרות שיש רבים מודלים חייתיים של NEC, ייתכן בתגובה לפציעה והתערבויות טיפוליות משתנה מאוד בין המינים. יתר על כן, זה מאתגר מבחינה אתית ללמוד פתופסיולוגיה המחלה או הרומן סוכני טיפולית ישירות בנושאים אנושיים, במיוחד לילדים. לכן רצוי מאוד לפתח מודל הרומן של NEC באמצעות רקמה אנושית. Enteroids הם organoids תלת-ממדי שמקורם בתאי אפיתל המעי. הם אידיאליים עבור חקר אינטראקציות מורכבות הפיזיולוגיות, איתות התא ואת ההגנה פתוגן-פונדקאי. כתב יד זה נתאר פרוטוקול enteroids האנושי הזה תרבויות לאחר בידוד תאי גזע מעיים של חולים שעברו כריתה מעי. התאים קריפטה מתורבתים בתקשורת המכיל חומרים המעודדים בידול לתוך הילידים סוגי תאים שונים של האפיתל במעי האדם. תאים אלה גדלים תערובת סינתטית, סילוק של חלבונים לשמש לפיגום, מחקה קרום המרתף הסלולר במיוחד. כתוצאה מכך, enteroids לפתח קוטביות הפסגה-basolateral. ניהול משותף של ליפופוליסכריד (LPS) בתקשורת גורם לתגובה דלקתית enteroids, המוביל היסטולוגית, גנטית, וכן שינויים בביטוי חלבונים דומים לאלה לראות ב- NEC אנושי. מודל ניסיוני של NEC באמצעות רקמה אנושית עשוי לספק פלטפורמה יותר מדויק עבור תרופות וטיפול בדיקות לפני בניסויים בבני אדם, כאשר אנו שואפים לזהות תרופה למחלה זו.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Enteroids האנושי הם אקסית vivo מערכת תרבות תלת-ממדי שנוצר מתאי גזע מבודד כוכים מעיים של דגימות רקמה אנושית מעיים. מודל זה פורצת היה חלוץ מאת הנס Clevers et al. בשנת 2007, בעקבות הגילוי של Lgr5 + תאי גזע-כוכים של המעי הדק עכברים1. העבודה שלהם הונחו היסודות להקמת אקסית vivo תרבות אפיתל המעי סוגי תאים מרובים, זה יכול להיות passaged ללא שינויים משמעותיים גנטית או הפיזיולוגיות2. מאז התגלית, enteroids שימשו כמודל הרומן ללמוד פיזיולוגיה עיכול נורמלי, הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים כגון מחלות מעי דלקתיות, אינטראקציות פתוגן-פונדקאי רפואה רגנרטיבית2.

השימוש של enteroids בתור אקסית vivo מודל לחקר פתופסיולוגיה מעיים יש כמה יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות. מספר עשורים, היו בשימוש בבעלי חיים וקווים מונצחים תא נגזר סרטן המעי ללמוד פיזיולוגיה מעיים3,4,5. תרבויות תא בודד אינם מייצגים את הגיוון של סוגי תאים נוכח נורמלי אפיתל המעי, ובכך חסר לתא צולבות לדבר וספציפיות קטע-ביטוי חלבון, איתות, מחלה הנגרמת הפתוגן6. בתאי גזע enteroids להתמיין סרן סוגי תאים אפיתל כגון enterocytes, Paneth תאים, תאי גביע, תאים enteroendocrine עוד3. הם מפגינים קוטביות, לבצע פונקציות תחבורה אפיתל, וגם מאפשרים קטע המעי ירידה לפרטים6. מאז enteroids ניתן לסכם מספר סוגי תא אפיתל המעי האנושי, הם מסוגלים להתגבר על מגבלה זו מוכרת של מערכות מבוססות תאי סרטן. לאורך זמן, נגזרות של שורות תאים הם subcloned ולהתפתח שהפגינו גיוון רב יותר חלבון בלוקליזציה וביטוי3. להיפך, enteroids יכול להיות passaged ללא שינויים משמעותיים גנטית או הפיזיולוגיות2. אמנם קיימים מודלים רבים של NEC, ייתכן בתגובה לפציעה והתערבויות טיפוליות משתנה מאוד בין המינים. בשל מגבלות אלו, שמקורם בבעלי חיים הרפוי להיכשל 90% מהזמן כאשר נבדק בניסויים האנושי בגלל ההבדלים רעילות או יעילות3. Enteroids לשמש מודלים קליניים מבטיח כי ניתן להתגבר על ליקויים אלה, המוביל אל הבנה טובה יותר של מורכבות פתופסיולוגיה מעיים, לכן, ועוד חידושים טיפולית מוצלחת וחסכונית. יש גם ראיות האחרונות הגיל של רקמת כי enteroid מופק נשאר חשוב מבחינה ביולוגית7. זהו פרט חשוב במיוחד עבור המודל שלנו מאז enteroids נוצרות מרקמות neonatal, ובכך שומר על רלוונטיות הפיזיולוגיות לחולים עם NEC.

השירות של enteroids בתור מודלים של מחלות אנושיות ממשיכה להתרחב, בתקווה למצוא מרפא לתנאים חמורה ו נרחבת. דלקת מעי נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית מעיים של neonates מאופיין נמק המעי וגורם לעתים קרובות לחירור של המעי קיר, הרעלת דם, מוות8. בשל פתופיזיולוגיה multifactorial ומורכבת של NEC, המכניזם המדויק של המחלה יש לא עדיין היה מלא מבואר; עם זאת, הגברת חדירות המעי היה בבירור מעורב תהליך המחלה8. נתון כי המחקר של NEC וסוכנים טיפולית פוטנציאל הוא מאתגר מבחינה אתית של ניסויים, במיוחד לילדים, רצוי מאוד לנצל את מודל enteroid רלוונטי מבחינה ביולוגית של NEC באמצעות רקמה אנושית neonatal. עד כה, enteroids יש תפקיד מוגבל במחקר של NEC. פרוטוקול זה מתאר את השימוש enteroids נגזר דגימות רקמה אנושית מעיים כמו רומן ex-vivo מודל לחקר נמקית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לאישור הדירקטוריון סקירה מוסדיים הושג (IRB #2013-15152) עבור אוסף של דגימות רקמה של חולים שעברו כריתה מעי אן ו רוברט ה' לוריא לילדים החולים שיקגו, שיקגו, אילינוי. כל הפרוטוקולים בוצעו בהתאם הלאומית ולמוסדות הנחיות ותקנות לרווחת האדם. הסכמת ההורים הודיע בכתב היה נדרש וקיבלתי לפני איסוף הדגימה בכל המקרים.

1. מגיב הכנה

  1. להכין פתרון מלאי תרבות המדיה עבור אוסף כל רקמה: 1 ליטר של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), 110 מ של העובר שור סרום (FBS), 11 מ של פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%) ו- mL 1.1 של אינסולין מחוטא-מסנן (הריכוז הסופי 0.1%.) פתרון מלאי החנות ב 4 º C.
  2. הכנת מאגר Chelating #1: 30 מ של תרבות התקשורת (כפי שמתואר 1.1), 600 µL של 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (הריכוז הסופי 10 מ מ), 300 µL של גנטמיצין (ריכוז סופי 1%) 60 µL של המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%). פתרון מלאי החנות ב 4 º C.
  3. הכנת מאגר Chelating #2: 30 מ של תרבות התקשורת (כפי שמתואר 1.1), µL 300 של 0.5 M EDTA (ריכוז סופי 5 מ מ), µL 300 של גנטמיצין (ריכוז סופי 1%) 60 µL של המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%). פתרון מלאי החנות ב 4 º C.
  4. להכין מדיה Minigut האנושית: 41.4 מ של DMEM/F-12, 5 מ של FBS (האחרון 10%), µL 500 של פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), µL 500 של L-גלוטמין (ריכוז סופי 1%), µL 500 של גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), 100 µL של המפוטריצין (סופי ריכוז 0.2%), 500 µL של 1 מ' N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic חומצה (HEPES) (הריכוז הסופי 10 מ מ), תוספת של 500 µL של 100 x N-2, B-27 תוספת 1 מ"ל של 50 x פחות ויטמין A עבור הנפח הכולל של 50 מ ל. פתרון מלאי החנות ב-20 ° C.
  5. הכנת האדם השלם מדיה Minigut: 10 מ של האדם Minigut מדיה (מוכן ב- 1.4), 10 µL של 100 µg/mL Wnt3a (ריכוז סופי 100 ng/mL), 10 µL של µg/mL 100 הראש (ריכוז סופי 100 ng/mL), 10 µL של 1 מ"ג/מ"ל R-Spondin (ריכוז סופי 1 µg/mL) , 10 µL של µg/mL 500 עוריות פקטורי גדילה (EGF) (ריכוז סופי 50 ng/mL), µL 10 1 M N-אצילוסיסטין (ריכוז סופי 1 מ מ), 10 µL 10 מ מ Y-27632 (ריכוז סופי 10 מיקרומטר), 10 µL של מיקרומטר 500 A-83 (ריכוז סופי 500 ננומטר), 10 µL 10 מ מ SB202190 (סוף ריכוז 10 מיקרומטר), 100 µL של 1 מ' Nicotinamide (הריכוז הסופי 10 מ מ) ו- µL 1 של מיקרומטר [leu] 100 15-גסטרין 1 (הריכוז הסופי 10 ננומטר). נפח כולל 10 מ"ל. פתרון מלאי החנות ב 4 º C.
    הערה: פתרונות יש להשתמש בתוך 48 שעות.

2. קריפטה בידוד, ציפוי מרקמות כל

  1. בזמנו של אוסף בסוויטת פעיל, מקם את דגימת רקמה אנושית קטנה מעיים תוך קר Dulbecco של פוספט Buffered מלוחים (DPBS). לשטוף את הדגימה תוך קר DPBS עד ברור של צואה ודם. לאחסן הדגימה ב 4 ° C RPMI 1640 בינוני עד מוכן לבידוד הקריפטה.
    הערה: רקמות אפשרות לאחסן יותר מ 24 שעות.
    1. ודא כי הדגימה נקי של צואה ודם. באמצעות מספריים ויבתר עדין, להסיר את כל עודפי שומן או ניתוח קטעי/סיכות ועוד. שוקלים את הדגימה.
      הערה: המטרה עבור פיסת כ 0.75-2.5 g.
  2. לחתוך את הדגימה לחתיכות 0.5 ס מ ומניחים ב30 מ"ל של Chelating מאגר #1 (כפי להכין בשלב 1.2).
    1. לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות ב 4 º C.
    2. לסנן רקמות דרך 100 מיקרומטר תא מסננת ולמחוק את הזרימה.
  3. הוסף את הרקמה 30 מ של Chelating מאגר #2 (כמו להכין בשלב 1.3).
    1. לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות ב 4 º C.
    2. לסנן רקמות דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולמחוק את הזרימה.
  4. הפשרת 500 מ"ל של קרום המרתף מטריקס על הקרח לשימוש בשלב 2.8.
  5. להוסיף רקמה 10 מ"ל של DMEM קר צינור חרוטי 50 מ ל ומנערים נמרצות על ידי יד 10 s.
    1. לסנן דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולאסוף הזרימה (תווית #1). לשמור על צינור #1 על קרח.
    2. להוסיף רקמה אחרת 10 מ"ל של DMEM קר צינור חרוטי נפרד 50 מ ל ומנערים נמרצות בידי 10 s.
    3. לסנן דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולאסוף הזרימה (תווית #2).
    4. חזור על שתי פעמים נוספות עד ישנם ארבעה צינורות חרוט עם הזרימה (שכותרתו צינורות #1-4).
  6. מסנן צינור #1 פתרון באמצעות מיקרומטר 100 תא מסננת והעברת זרם דרך לתוך צינור חרוטי 15מל (תווית #1). חזור על #2-4.
    1. צנטריפוגה 15 מ"ל צינורות #1-4 ב 200 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
  7. בשכונה זרימה שכבתית, הסר את תגובת שיקוע של צינורות #1-4 וזורקים. להימנע מהפרעה הענן של רקמת מיד מעל בגדר, גם אם זה אומר להשאיר את תגובת שיקוע קצת מאחור.
    1. מאת pipetting לאט, מערבבים יחד את גלולה עם ה99 supernatant צינורות #1-4.
    2. להעביר את התערובת משפופרות #1-4 לתוך שפופרת חרוט mL 2 יחידה אחת.
    3. Centrifuge צינור חרוטי ב x 200 גרם במשך 20 דקות ב 4 º C.
  8. הסר את תגובת שיקוע ולאחר מחדש להשעות את צניפה ב 500 µL של מטריקס קרום המרתף.
    הערה:
    לשמור המטריקס קרום המרתף על קרח בכל עת ולעבוד במהירות על השלבים הבאים. מוצר זה polymerizes מהר מאוד בטמפרטורת החדר.
    1. החל µL 50 של הדגימה/מרתף ממברנה מטריקס השעיה למרכז באר צלחת 24-. טוב. זה אמור להופיע בצורת כיפה.
      הערה: השימוש פיפטה צוננת טיפים מסייע בהעברת חלקה של ההשעיה, מזעור הפילמור.
    2. חזור על 9 פעמים כדי למלא בארות סה כ 10.
  9. מקם את הצלחת 24-ובכן 37 ° C, 5% CO2 החממה במשך 30 דקות לאפשר הפילמור.
  10. להוסיף 500 µL של האדם Minigut מדיה מלאה (כפי להכין בשלב 1.5) כל טוב. החלף את כל יומיים.
  11. לאסוף את enteroids אחרי 5-10 ימים, כאשר ניצני הוא מדמיין. ראה השלבים 4 ו- 5 עבור אוסף הוראות.

3. אינדוקציה של NEC ניסיוני

  1. להוסיף 10 µL של 5 מ"ג/מ"ל של ליפופוליסכריד (LPS) 500 µL של האדם Minigut מדיה מלאה (כפי להכין בשלב 1.5) היטב כל יום 0. החלף את כל יומיים עד אוסף.

4. הכנה פרפין הטבעה

  1. הסר בעדינות את המדיה.
    1. להוסיף 1 מ"ל ל- PBS, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי להמיס את המטריקס. קרום המרתף עם טיפול לא lyse את enteroids.
    2. צנטריפוגה PBS/enteroid תערובת ב < 300 x גרם עבור 5 דקות הצניפה ולהסיר PBS.
  2. להוסיף 4% paraformaldehyde לתקן בטמפרטורת החדר מאובטח.
  3. צנטריפוגה < 300 x גרם עבור 5 דקות כדי גלולה ולאחר מכן הסר PBS.
    1. לשטוף בעדינות עם 1 מ"ל ל- PBS, צנטריפוגה < 300 x גרם עבור 5 דקות כדי גלולה ולאחר מכן הסר PBS.
    2. חזור על שלב 4.3.1.
  4. ממיסים נפח מספיק של הרקמה עיבוד ג'ל (כ-300 µL) על ידי הצבת את הכמות הרצויה צינור חרוטי ומחמם זה ב חממה אמבט יבש ב 65 מעלות צלזיוס למשך 3-10 דקות עד נוזלי.
    1. מוסיפים את הרקמה עיבוד ג'ל כדי בגדר ומערבבים בעדינות.
    2. ב coverslip, במקום טבעת שיבוט קטן.
    3. Pipette הרקמה עיבוד ג'ל תערובת enteroid לתוך טבעת שיבוט רכוב על גבי coverslip.
  5. לאפשר את הרקמה עיבוד ג'ל תערובת enteroid לגבש ב 4 ° C עבור 1 h.
    1. להטביע את הטבעת שיבוט עם תערובת הקרושה לתוך 70% אתנול לקראת הטמעת פרפין.

5. Enteroid אוסף עבור ה-RNA והפקת חלבונים

  1. הסר בעדינות האנושי Minigut מדיה מלאה מכל קידוח.
  2. להוסיף 1 מ"ל PBS, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי להמיס את המטריקס קרום המרתף. יש להיזהר לא לבטל את enteroids.
    1. מניחים תערובת PBS/enteroid לתוך צינור חרוטי mL 2 סטרילי.
    2. צנטריפוגה < 300 x גרם עבור 5 דקות כדי גלולה.
    3. הסר בעדינות PBS, מטפל לא כדי להסיר את enteroids.
  3. חזור על שלב סדרת 5.2 עוד פעמיים.
  4. להקפיא ב- 80 ° C עד מוכן חלבון ו/או מיצוי ה-RNA.
  5. ביצוע גנים ביטוי וחלבון בידוד של enteroids באמצעות לרביעיית ומבוססת-PCR וטכניקות מערביות סופג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מיד לאחר ציפוי, מופיעים כוכים מעיים טריים מבודד מוטות מוארך. בתוך שעות, יקבל enteroid בעל מראה עגול (איור 1). במשך מספר ימים, enteroids יתחיל ויוצרים כדורים כפי שניתן לראות באיור 1ב'. ניצני צריך להתרחש בין 5-10 ימים (איור 1c), אוסף enteroid צריכים להתרחש באותו הזמן.

Enteroids גדל גם תערוכת קוטביות, המכיל של לומן מרכזי, גבול הפסגה, תחום basolateral (איור 2). Enteroids גם מראים המבנית, המיוצג על-ידי שלד התא אקטין חזקים (איור 3). אחרי כמה ימים בתרבות, enteroids LPS התייחס לחוות אפופטוזיס יותר ויהיה תשואה נמוכה יותר מאשר בקבוצת הביקורת (איור 4). כפי שניתן לראות NEC האנושי ודגמים מאתר של NEC9, ביטוי מוגבר של קולטן דמוי אגרה 4 (TLR4) נמצא ב- LPS שטופלו enteroids לעומת שולט (איור 5).

Figure 1
איור 1: התת-קרקעי ותרבות אנושית enteroid צורה מרקמות כל. תרבות קריפטה () יום 0 עם מראה שטוח, עגול. (b) יום 4 enteroids עם היווצרות ספרואיד. (ג) 7 יום enteroids עם ניצני (חץ שחור). גודל ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 2
איור 2 : היסטולוגית מראה enteroid. Haemotoxylin, צביעת אאוזין. Enteroid מציג של לומן מרכזי ותערוכות קוטביות, עם שני מחשבים של הפסגה, basolateral. Haemotoxylin (סגול) מייצג את הגרעין, ואילו אאוזין (ורוד) מייצג רכיבים cytosolic. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : שלד התא אקטין Enteroid. Micrograph Immunoflorescence של enteroids. Enteroid הצגת המבנית כפי שמגלה את cystoskeleton אקטין בולטים (מגנטה). הגרעינים מוכתם דאפי (כחול), סולם בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Enteroid האנושי תרבות התשואה יורדת עם טיפול LPS. יום 5 enteroids בתרבות, גדל מהרקמה אותו שלם. () Enteroids מטופלים עם שליטה תרבות המדיה. הצגת תהליך צמיחה. (b) Enteroids שטופלו LPS בתקשורת תרבות. רק לשרוד כמה enteroids. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: גדל TLR4 ביטוי ניסיוני NEC enteroids. לרביעיית-PCR () הראה גדל TLR4 mRNA ביטוי enteroids נחשפים LPS (p = 0.03). (b) ניתוח תספיג מראה גדל TLR4 ביטוי enteroid האנושי ניסיוני NEC (p = 0.02). נציג תספיג מתואר. ערכים הם אמצעי ± SEM של 3 דוגמאות לכל קבוצה. * p < 0.05 על ידי מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

רומן זה ex-vivo enteroid מעיים אנושיים המודל משמש שיטה שימושית לצורך המחקר של תפקוד מכשול מעי נמקית (NEC). שיטות עיבוד enteroid המובאת כאן הוסבו מעבודה קודמת של ד"ר מיסטי טוב, מייקל Helmrath, ג'ייסון ורטהיים10,11,12.

הפרטים סביב כל אוסף רקמה והתזמון של בידוד קריפטה הם השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה. רקמות חייב להיות שנאספו באופן מיידי בזמנו של כריתה פעיל ומעובדים לבידוד קריפטה ברגע הרקמה מגיע למעבדה. בחרנו רקמות מחולים פחות מ-3 חודשים עבור דגם זה. עיבוד מושהה יכול להתרחש בתוך 24 שעות אחרי כל רקמות אוסף במידת הצורך. בנוסף, האיכות של דגימת רקמה אנושית מאוד משפיע על התשואה של בידוד הקריפטה. המעי הדק בריא וללא הפתולוגיה הבסיסית של חולים צעירים (< 2 חודשים של גיל) נמצאו להניב את התוצאות הטובות ביותר. בנוסף, יש לבחור את הרקמה שנאספו מהאזור הבריא, בדרך כלל בקצוות דיסטלי של הדגימה resected. באמצעות חתיכה גדולה יותר של המעי לא לשפר בידוד קריפטה עם אמצעי האחסון הפתרון המתואר לעיל בפרוטוקול. במעיים מגזרים כ 1-2 ס מ אורך, במשקל 0.75-2.5 g הם אופטימליים. אינדוקציה של NEC ניסיוני בעזרת חשיפה LPS היה המודל מן התרבות התא ומבוססת דגמים בעלי חיים. העבודה מבוססת על Hackam et al. הראה את תפקיד קריטי TLR4 (קולטן LPS) ב- NEC פיתוח9,13,14,15. LPS הפעלה של TLR4 מעוררת ציטוקינים proinflammatory, צמצום מכשול שלמות, והפעלה של לויקוציטים subepithelial המאפיינות האירועים איתות מעורב NEC אנושי. TLR4 היה מעורב כמו מולקולה מפתח בקידום דלקת7 ובעלי חוסר TLR4 פונקציונלית הם הדגימו הגנה מפני ההתפתחות של NEC15. רמות במחזור של LPS הן גבוהות בחולים עם NEC גבוהות צואה ופלסמה של מודלים חייתיים של NEC. LPS גורם דלקת מעיים אצל בעלי חיים הדומה NEC אנושי, המדגישה את החשיבות של דלקת במסלול זה. שיקוף תרבית תאים מבוססת על מודלים חייתיים של NEC, אנו מאמינים כי אינדוקציה של NEC ניסיוני באמצעות הנהלת LPS בתרבות enteroid הוא שימושי ex-vivo האנושי neonatal מודל המחקר של NEC. בהתאם לדיווחים קודמים ב ויצר מודלים אחרים, שלנו enteroids NEC ניסיוני הראה ביטוי מוגבר של TLR4 לעומת שולט.

הפרוטוקול עבור אינדוקציה של NEC ניסיוני בעזרת חשיפה LPS עבר מספר שינויים חשובים ושיפורים. בתחילה, enteroids היו גדל במשך 5 ימים ואז מחוסן עם התקליטים במשך 24 שעות ביממה, שנאספו לאחר מכן. הפרוטוקול ממליצה עכשיו LPS חיסון ביום 0 עם חשיפה ממושכת בתוך כל שינוי תרבות המדיה עד אוסף. בנוסף, המינון של LPS אופטימלי. לאחר ביצוע עקומת מינון, trialing מספר ריכוזים שונים של LPS, נבחר 5 מ"ג/מ"ל. ניסויים עם חיסון LPS ישירות לתוך התערובת מטריקס/enteroid קרום המרתף בזמנו של ציפוי היה גם trialed; עם זאת, זה היה מסורבל, לא לשפר את התוצאות.

קיימות מגבלות שדורש התייחסות הניצול של המודל enteroid האנושי מתפתח. מאז גילוי בשנת 2007, מספר פרוטוקולים שונים שימשו כדי ליצור תרבות enteroids. גורמי גדילה רבים, הנדרשים enteroid תחזוקה ובידול היעדר תקינה, אשר עשוי להשפיע על הפארמצבטית. בנוסף, תרבות enteroid חסרה מכני כוחות המשפיעים על האפיתל במעי האדם בתנאים הפיזיולוגיות. לחץ זרימה luminal, הפריסטלטיקה עשוי להשפיע ביטוי גנים וחלבונים, אשר לא מהצהוב במודל זה. מודל זה חסרה גם העצבים, תאים חיסוניים, microbiome, להערכת, מזנכימה הקיימים בכל אדם אפיתל המעי.

חשיפה LPS במודל enteroid מעיים אנושיים זה גורם לתגובה דלקתית המוביל אל היסטולוגית, גנטי, שינויים בביטוי חלבונים דומים לאלה שנמצאו NEC אנושי. למרות שיש מספר מודלים חייתיים הנוכחי של NEC, בתגובה לפציעה מעיים והתערבויות טיפוליות משתנה מאוד בין המינים. מאז זה מאתגר מבחינה אתית ללמוד פתופסיולוגיה המחלה או לבחון את הרומן סוכני טיפולית ישירות בבני אדם, ובמיוחד תינוקות, זה חשוב מאוד להמשיך ולטפח את הרומן הזה ex-vivo מודל של NEC באמצעות רקמה אנושית. Enteroids האנושי נתונות ההנדסה הגנטית, וייתכן שהוא מהותי בפיתוח של טיפולים במחלות מעיים אנושיים רבים16. כיוונים לעתיד צריכים לשאוף enteroids התרבות האנושית על גרדום חדיר בחדר זלוף עם הפסגה וכוחות הזרימה basolateral עד כדי לשחזר אדריכלות קריפטה ויוו-סיסי באותה מידה כמו הפיזיולוגיות כגון תנועה פריסטלטית וזרימה luminal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון של המוסד לביטוח לאומי של סוכרת, העיכול, גרנט מחלת הכליה (K08DK106450) ופרס ג'יי Grosfeld של האגודה האמריקאית כירורגי בילדים כדי C.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291, (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239, (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7, (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51, (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190, (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23, (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179, (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176, (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143, (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, (1), 81-83 (2011).
הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).More

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter