Enteroids dukker opp som en ny modell i studiet av menneskelig sykdom. Protokollen beskriver hvordan å simulere en enteroid modell av menneskelig necrotizing enterokolitt bruker lipopolysakkarid (LPS) behandling av enteroids fra neonatal vev. Samlet enteroids viser inflammatoriske endringer som dem sett i menneskelig necrotizing enterokolitt.
Nekrotiserende enterokolitt er (NEC) en ødeleggende sykdom i nyfødte. Det er preget av flere pathophysiologic endringer i menneskelig intestinal epitel, fører til økt tarm permeabilitet, svekket hvile og økt celledød. Men det er mange dyr modeller av NEC, kan det hende at svaret å skade og terapeutisk intervensjon svært variabel mellom artene. Videre er det etisk utfordrende å studere sykdom patofysiologi eller romanen terapeutiske agenter direkte i menneskelig fag, særlig barn. Derfor er det svært ønskelig å utvikle en ny modell av NEC bruker menneskelig vev. Enteroids er 3-dimensjonale organoids avledet fra intestinal epitelceller. De er ideelle for studier av komplekse fysiologiske interaksjoner, celle signalisering og vert-patogen defense. I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll som kulturer menneskelige enteroids etter isolere intestinal stamceller fra pasienter som gjennomgår tarm resection. Krypten cellene er kultivert i media som inneholder vekstfaktorer som oppmuntrer differensiering inn de ulike celle typer innfødte av menneskelig intestinal epitel. Disse cellene er dyrket i et syntetisk, collagenous blanding av proteiner som fungerer som et stillas, etterligne ekstra-mobile kjelleren membranen. Resultatet utvikle enteroids apikale-basolateral polaritet. Co administrasjon av lipopolysakkarid (LPS) i media forårsaker en inflammatorisk respons i enteroids, fører til histologic, genetisk og protein uttrykk endringer like de sett i menneskelig NEC. En eksperimentell modell av NEC bruker menneskelig vev kan gi en mer nøyaktig plattform for narkotika og behandling testing før menneskelige prøvelser, som vi forsøker å identifisere en kur for denne sykdommen.
Menneskelig enteroids er en ex vivo 3-dimensjonale kultur-systemet fra stamceller isolert fra intestinal crypts av menneskelige tarmen. Denne banebrytende modellen ble utviklet av Hans Clevers et al. i 2007 etter oppdagelsen av Lgr5 + stamceller på krypten i tynntarmen i mus1. Deres arbeid la grunnlaget for å etablere en ex vivo intestinal epithelial kultur flere celletyper som kan bli passaged uten betydelige genetisk eller fysiologiske endringer2. Siden oppdagelsen har enteroids blitt brukt som en roman modell for å studere normale fordøyelseskanal fysiologi og patofysiologi av tarm sykdommer som inflammatorisk tarmsykdom, vert-patogen interaksjoner og regenerativ medisin2.
Bruk av enteroids som en ex vivo modell for studiet av intestinal patofysiologi har flere fordeler sammenlignet med alternative teknikker. For de siste tiårene, har dyremodeller og udødeliggjort intestinal kreft-avledet cellelinjer blitt brukt til å studere intestinal fysiologi3,4,5. Encellede kulturer representerer ikke mangfoldet i celletyper tilstede i normal intestinal epitel, dermed mangler celle til celle cross-talk og segment-spesifisitet i protein uttrykk, signalisering og patogen-indusert sykdom6. Stamceller i enteroids skille ut store epithelial celletyper som enterocytes, Paneth celler, fangen celler, enteroendocrine celler og mer3. De viser polaritet, utføre epithelial transport funksjoner og tillate intestinal segmentet spesifisitet6. Siden enteroids kan recapitulate de flere celletyper av menneskelig intestinal epitel, er de stand til å overvinne denne anerkjent begrensningen av kreft celle-baserte systemer. Over tid, derivater av linjer er subcloned og utvikle seg til å exhibit større mangfold i protein uttrykk og lokalisering3. Tvert imot, kan enteroids være passaged uten betydelige genetisk eller fysiologiske endringer2. Selv om mange dyr modeller for NEC eksisterer, kan det hende at svaret å skade og terapeutisk intervensjon svært variabel mellom artene. Som følge av disse begrensningene therapeutics avledet fra dyremodeller mislykkes 90% av tiden da testet i menneskelige studier skyldes forskjeller i toksisitet eller effekt3. Enteroids tjener som lovende pre-klinisk modeller som kan overvinne disse manglene, fører til en bedre forståelse av komplekse intestinal patofysiologi, og derfor mer vellykket og kostnadseffektiv terapeutiske innovasjoner. Nyere bevis som en alder av vev som en enteroid genereres fra forblir biologisk viktig7finnes også. Dette er en spesielt viktig detalj for våre modellen siden enteroids genereres fra neonatal vev, og dermed opprettholde fysiologiske relevans til pasienter med NEC.
Nytten av enteroids som modeller av menneskelige sykdommer fortsetter å utvide, i håp om å finne kurer alvorlig og gjennomgripende forhold. Nekrotiserende enterokolitt (NEC) er en ødeleggende tarm sykdom i nyfødte preget av intestinal nekrose og ofte fører til perforering av tarmveggen, septicemia og død8. På grunn av den komplekse og multifaktoriell pathophysiology av NEC, har den eksakte mekanismen for sykdommen ennå ikke fullt utredet; Imidlertid, økt tarm permeabilitet har vært tydelig innblandet i sykdommen prosessen8. Gitt at studiet av NEC og potensielle terapeutiske agenter er etisk utfordrende i menneskelig fag, særlig barn, er det svært ønskelig å benytte biologisk relevante enteroid modell av NEC bruker menneskelig neonatal vev. Så langt har enteroids en begrenset rolle i studiet av NEC. Denne protokollen beskriver bruken av enteroids avledet fra menneskelige tarmen tissue prøver som en roman ex vivo modell for studiet av nekrotiserende enterokolitt.
Denne romanen ex vivo menneskelige intestinal enteroid modell fungerer som en nyttig metode for studier av intestinal barriere dysfunksjon i nekrotiserende enterokolitt (NEC). Enteroid behandlingsmetoder presenteres her var tilpasset fra tidligere arbeidet til Dr. Misty Good, Michael Helmrath og Jason Wertheim10,11,12.
Detaljene rundt hele vev samling og timing krypten isolasjon er avgjørende skritt …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institute for Health Institute Diabetes fordøyelseskanal og nyre sykdom Grant (K08DK106450) og Jay Grosfeld prisen fra American Pediatric kirurgiske Association til C.J.H.
4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
[leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |