Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En roman menneskelige Epithelial Enteroid modell for nekrotiserende enterokolitt

doi: 10.3791/59194 Published: April 10, 2019

Summary

Enteroids dukker opp som en ny modell i studiet av menneskelig sykdom. Protokollen beskriver hvordan å simulere en enteroid modell av menneskelig necrotizing enterokolitt bruker lipopolysakkarid (LPS) behandling av enteroids fra neonatal vev. Samlet enteroids viser inflammatoriske endringer som dem sett i menneskelig necrotizing enterokolitt.

Abstract

Nekrotiserende enterokolitt er (NEC) en ødeleggende sykdom i nyfødte. Det er preget av flere pathophysiologic endringer i menneskelig intestinal epitel, fører til økt tarm permeabilitet, svekket hvile og økt celledød. Men det er mange dyr modeller av NEC, kan det hende at svaret å skade og terapeutisk intervensjon svært variabel mellom artene. Videre er det etisk utfordrende å studere sykdom patofysiologi eller romanen terapeutiske agenter direkte i menneskelig fag, særlig barn. Derfor er det svært ønskelig å utvikle en ny modell av NEC bruker menneskelig vev. Enteroids er 3-dimensjonale organoids avledet fra intestinal epitelceller. De er ideelle for studier av komplekse fysiologiske interaksjoner, celle signalisering og vert-patogen defense. I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll som kulturer menneskelige enteroids etter isolere intestinal stamceller fra pasienter som gjennomgår tarm resection. Krypten cellene er kultivert i media som inneholder vekstfaktorer som oppmuntrer differensiering inn de ulike celle typer innfødte av menneskelig intestinal epitel. Disse cellene er dyrket i et syntetisk, collagenous blanding av proteiner som fungerer som et stillas, etterligne ekstra-mobile kjelleren membranen. Resultatet utvikle enteroids apikale-basolateral polaritet. Co administrasjon av lipopolysakkarid (LPS) i media forårsaker en inflammatorisk respons i enteroids, fører til histologic, genetisk og protein uttrykk endringer like de sett i menneskelig NEC. En eksperimentell modell av NEC bruker menneskelig vev kan gi en mer nøyaktig plattform for narkotika og behandling testing før menneskelige prøvelser, som vi forsøker å identifisere en kur for denne sykdommen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Menneskelig enteroids er en ex vivo 3-dimensjonale kultur-systemet fra stamceller isolert fra intestinal crypts av menneskelige tarmen. Denne banebrytende modellen ble utviklet av Hans Clevers et al. i 2007 etter oppdagelsen av Lgr5 + stamceller på krypten i tynntarmen i mus1. Deres arbeid la grunnlaget for å etablere en ex vivo intestinal epithelial kultur flere celletyper som kan bli passaged uten betydelige genetisk eller fysiologiske endringer2. Siden oppdagelsen har enteroids blitt brukt som en roman modell for å studere normale fordøyelseskanal fysiologi og patofysiologi av tarm sykdommer som inflammatorisk tarmsykdom, vert-patogen interaksjoner og regenerativ medisin2.

Bruk av enteroids som en ex vivo modell for studiet av intestinal patofysiologi har flere fordeler sammenlignet med alternative teknikker. For de siste tiårene, har dyremodeller og udødeliggjort intestinal kreft-avledet cellelinjer blitt brukt til å studere intestinal fysiologi3,4,5. Encellede kulturer representerer ikke mangfoldet i celletyper tilstede i normal intestinal epitel, dermed mangler celle til celle cross-talk og segment-spesifisitet i protein uttrykk, signalisering og patogen-indusert sykdom6. Stamceller i enteroids skille ut store epithelial celletyper som enterocytes, Paneth celler, fangen celler, enteroendocrine celler og mer3. De viser polaritet, utføre epithelial transport funksjoner og tillate intestinal segmentet spesifisitet6. Siden enteroids kan recapitulate de flere celletyper av menneskelig intestinal epitel, er de stand til å overvinne denne anerkjent begrensningen av kreft celle-baserte systemer. Over tid, derivater av linjer er subcloned og utvikle seg til å exhibit større mangfold i protein uttrykk og lokalisering3. Tvert imot, kan enteroids være passaged uten betydelige genetisk eller fysiologiske endringer2. Selv om mange dyr modeller for NEC eksisterer, kan det hende at svaret å skade og terapeutisk intervensjon svært variabel mellom artene. Som følge av disse begrensningene therapeutics avledet fra dyremodeller mislykkes 90% av tiden da testet i menneskelige studier skyldes forskjeller i toksisitet eller effekt3. Enteroids tjener som lovende pre-klinisk modeller som kan overvinne disse manglene, fører til en bedre forståelse av komplekse intestinal patofysiologi, og derfor mer vellykket og kostnadseffektiv terapeutiske innovasjoner. Nyere bevis som en alder av vev som en enteroid genereres fra forblir biologisk viktig7finnes også. Dette er en spesielt viktig detalj for våre modellen siden enteroids genereres fra neonatal vev, og dermed opprettholde fysiologiske relevans til pasienter med NEC.

Nytten av enteroids som modeller av menneskelige sykdommer fortsetter å utvide, i håp om å finne kurer alvorlig og gjennomgripende forhold. Nekrotiserende enterokolitt (NEC) er en ødeleggende tarm sykdom i nyfødte preget av intestinal nekrose og ofte fører til perforering av tarmveggen, septicemia og død8. På grunn av den komplekse og multifaktoriell pathophysiology av NEC, har den eksakte mekanismen for sykdommen ennå ikke fullt utredet; Imidlertid, økt tarm permeabilitet har vært tydelig innblandet i sykdommen prosessen8. Gitt at studiet av NEC og potensielle terapeutiske agenter er etisk utfordrende i menneskelig fag, særlig barn, er det svært ønskelig å benytte biologisk relevante enteroid modell av NEC bruker menneskelig neonatal vev. Så langt har enteroids en begrenset rolle i studiet av NEC. Denne protokollen beskriver bruken av enteroids avledet fra menneskelige tarmen tissue prøver som en roman ex vivo modell for studiet av nekrotiserende enterokolitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Institusjonelle gjennomgang styret godkjenning ble innhentet (IRB #2013-15152) for samling av vevsprøver fra pasienter som gjennomgår tarmen reseksjon på Ann og Robert H. Lurie Children's Hospital i Chicago, Chicago, IL. Alle protokoller ble utført i samsvar med institusjonelle og nasjonale retningslinjer og regler for menneskelig velferd. Skriftlig informert foreldresamtykke var nødvendig og innhentet før prøvetaking i alle tilfeller.

1. forberedelse av reagenser

  1. Forberede kultur medier lagerløsning for hele vev samling: 1 L av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM), 110 mL av Fetal Bovine Serum (FBS), 11 mL av Penicillin-Streptomycin (siste konsentrasjon 1%) og 1.1 mL av filter-steriliseres insulin (siste konsentrasjon 0,1%.) Lagre lagerløsning på 4 ° C.
  2. Forberede Chelating Buffer #1: 30 mL kultur medier (som beskrevet i 1.1), 600 µL av 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (siste konsentrasjon 10 mM), 300 µL av Gentamicin (siste konsentrasjon 1%) og 60 µL av amfotericin B (siste konsentrasjon 0,2%). Lagre lagerløsning på 4 ° C.
  3. Forberede Chelating Buffer #2: 30 mL kultur medier (som beskrevet i 1.1), 300 µL av 0,5 M EDTA (siste konsentrasjon 5mM), 300 µL av Gentamicin (siste konsentrasjon 1%) og 60 µL av amfotericin B (siste konsentrasjon 0,2%). Lagre lagerløsning på 4 ° C.
  4. Forbered menneskelige Minigut Media: 41.4 mL DMEM/F-12, 5 mL FBS (siste 10%), 500 µL av Penicillin-Streptomycin (siste konsentrasjon 1%), 500 µL av L-glutamin (siste konsentrasjon 1%), 500 µL av Gentamicin (siste konsentrasjon 1%), 100 µL av amfotericin B (endelig konsentrasjon 0,2%), 500 µL av 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonsyre (HEPES) (siste konsentrasjon 10 mM), 500 µL av 100 x N-2 supplement og 1 mL av 50 x B-27 supplement minus Vitamin A for et totalt volum på 50 mL. Lagre lagerløsning på 20 ° C.
  5. Forbered menneskelige Minigut Media fullført: 10 mL av menneskelig Minigut Media (forberedt i 1.4), 10 µL 100 µg/ml Wnt3a (siste konsentrasjon 100 ng/mL), 10 µL 100 µg/ml Noggin (siste konsentrasjon 100 ng/mL), 10 µL av 1 mg/mL R-Spondin (siste konsentrasjon 1 µg/mL) , 10 µL av 500 µg/mL Epidermal vekstfaktor (EGF) (siste konsentrasjon 50 ng/mL), 10 µL av 1 M N-Acetylcysteine (siste konsentrasjon 1 mM), 10 µL 10 mm Y-27632 (siste konsentrasjon 10 µM), 10 µL 500 µM A-83 (siste konsentrasjon 500 nM), 10 µL av 10 mM SB202190 (siste konsentrasjon 10 µM), 100 µL av 1 M nikotinamid (siste konsentrasjon 10 mM) og 1 µL av 100 µM [leu] 15-gastrin 1 (siste konsentrasjon 10 nM). Totalt volum 10 mL. Lagre lagerløsning på 4 ° C.
    Merk: Løsningene må brukes innen 48 timer.

2. krypten isolasjon og Plating fra hele vev

  1. Ved samling i operativ suite, plassere menneskelige liten tarmen tissue prøven i kalde Dulbecco fosfat bufret saltvann (DPBS). Vask prøven i kalde DPBS til klar av avføring og blod. Lagre prøven på 4 ° C i RPMI 1640 Medium til klar for krypten isolasjon.
    Merk: Vev kan ikke lagres mer enn 24 timer.
    1. Kontroller at prøven er fjernet av avføring og blod. Bruker delikat dissecting saks, fjerne alle overflødig fett eller kirurgisk klipp/kramper osv. Veie prøven.
      Merk: Mål for en stykke omtrent 0,75-2.5 g.
  2. Kutt prøven i 0,5 cm biter og Legg i 30 mL av chelaterande Buffer #1 (som forberedt i trinn 1.2).
    1. Kamerarystelser ved lav hastighet i 15 min på 4 ° C.
    2. Filtrere vev gjennom 100 µm celle sil og kast strømme gjennom.
  3. Legge vevet til 30 mL av chelaterande Buffer #2 (som forberedt i trinn 1.3).
    1. Kamerarystelser ved lav hastighet i 15 min på 4 ° C.
    2. Filtrere vev gjennom en 100 µm celle sil og kast strømme gjennom.
  4. Tine 500 mL kjelleren membran matrise på is for bruk i trinn 2.8.
  5. Legge til vev 10 mL kaldt DMEM i et 50 mL konisk rør og rist kraftig hånd for 10 s.
    1. Filtrere gjennom en 100 µm celle sil og samle strømme gjennom (etiketten #1). Holde røret #1 på is.
    2. Legg vev til en annen 10 mL kaldt DMEM i et separat 50 mL konisk rør og rist kraftig hånd for 10 s.
    3. Filtrere gjennom en 100 µm celle sil og samle strømme gjennom (etiketten #2).
    4. Gjenta to ganger til det er fire konisk rør med strømme gjennom (merket rør #1-4).
  6. Filteret rør #1 løsning gjennom en 100 µm celle sil og overføre strømme gjennom til 15 mL konisk tube (etiketten #1). Gjenta for #2-4.
    1. Sentrifuger 15 mL rør #1-4 200 x g i 15 min på 4 ° C.
  7. I laminær strømning panseret, fjerne nedbryting fra rør #1-4 og kast. Unngå forstyrre skyen av vev umiddelbart over pellets, selv om det betyr etterlot noen nedbryting.
    1. Av pipettering sakte, bland sammen pellet med leftover supernatant i rør #1-4.
    2. Overføre blandingen fra rør #1-4 til en enkelt 2 mL konisk tube.
    3. Sentrifuge konisk røret på 200 x g for 20 min på 4 ° C.
  8. Fjern nedbryting og å avbryte pellet 500 µL av kjelleren membran matrise.
    Merk:
    holde kjelleren membran matrix på is til alle tider og jobbe raskt for de neste trinnene. Dette produktet polymerizes raskt ved romtemperatur.
    1. Bruke 50 µL av prøven/kjeller membran matrix suspensjon til midten av en brønn i en 24-vel plate. Dette vises kuppel-formet.
      Merk: Bruk av kjølt pipette-spisser hjelpemidler i jevnere overføring av suspensjon, minimere polymerisasjon.
    2. Gjenta 9 ganger fylle 10 totalt brønner.
  9. Plass 24-vel platen i 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 30 min å tillate polymerisasjon.
  10. Legg til 500 µL av menneskelig Minigut Media komplett (som forberedt i trinn 1.5) i hver brønn. Erstatte hver 2 dager.
  11. Samle enteroids etter 5-10 dager, når spirende er visualisert. Se trinn 4 og 5 for instruksjoner.

3. induksjon av eksperimentelle NEC

  1. Legge til 10 µL av 5 mg/mL av lipopolysakkarid (LPS) 500 µL av menneskelig Minigut Media komplett (som forberedt i trinn 1.5) i hver brønn på dag 0. Erstatte hver 2 dager til samlingen.

4. forberedelse til parafininnstøper

  1. Forsiktig fjerne media.
    1. Legg 1 mL av PBS og Pipetter forsiktig opp og ned for å oppløse kjelleren membran matrisen med forsiktighet for ikke å lyse i enteroids.
    2. Sentrifuge PBS/enteroid blanding på < 300 x g i 5 min pellets og fjerne PBS.
  2. Legge til 4% paraformaldehyde å fikse ved romtemperatur 1t.
  3. Sentrifuge på < 300 x g i 5 min pellets, og deretter fjerne PBS.
    1. Vask forsiktig med 1 mL av PBS og sentrifuge på < 300 x g i 5 min pellets, og deretter fjerne PBS.
    2. Gjenta trinn 4.3.1.
  4. Smelte et tilstrekkelig volum av vev behandling gel (rundt 300 µL) ved å plassere ønsket mengde i en konisk rør og oppvarming det i en tørr bad inkubator på 65 ° C i 3-10 min før væske.
    1. Legg vev behandling gel til pellet og bland forsiktig.
    2. På en dekkglassvæske, plassere en liten kloning ring.
    3. Pipetter vev behandling gel og enteroid blandingen i en kloning ring montert på en dekkglassvæske.
  5. Kan vev behandling gel og enteroid blandingen å stivne ved 4 ° C i 1 time.
    1. Senk kloning ringen med befestet blanding til 70% etanol i forberedelse til parafininnstøper.

5. Enteroid samling for RNA og Protein utvinning

  1. Forsiktig fjerne menneskelig Minigut Media fullstendig fra hver brønn.
  2. Legg 1 mL PBS og Pipetter forsiktig opp og ned for å oppløse kjelleren membran matrix. Være forsiktig ikke for å oppheve tilknytningen til enteroids.
    1. Plass PBS/enteroid blandingen i et sterilt 2 mL konisk rør.
    2. Sentrifuge på < 300 x g for 5 min til pellets.
    3. Fjern PBS, ta vare ikke for å fjerne enteroids.
  3. Gjenta trinn serien 5.2 to ganger.
  4. Fryse i-80 ° C til klar for protein og/eller RNA utvinning.
  5. Utføre gene expression og protein isolering av enteroids bruker veletablerte qRT PCR og Western Blotting teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Umiddelbart etter plating vises fersk isolert intestinal crypts som langstrakt stenger. Innen timer tar enteroid på en runde utseende (figur 1en). Over de neste dagene starter enteroids danner kuler som vist i figur 1b. Spirende oppstår mellom 5-10 dager (figur 1c) og enteroid samling skje på den tiden.

Den økende enteroids vil også ha polaritet, som inneholder en sentralisert lumen, en apikale kantlinje og basolateral domene (figur 2). Enteroids viser også strukturelle integritet, representert av en robust begrepsordbok cytoskjelett (Figur 3). Etter flere dager i kultur, LPS behandlet enteroids oppleve mer apoptose og vil ha en lavere avkastning enn i kontrollgruppen (Figur 4). Sett i menneskelig NEC og murine modeller av NEC9, fant det økt uttrykket for Toll-like reseptor 4 (TLR4) i LPS behandlet enteroids sammenlignet med kontrollene (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Krypten kultur og menneskelige enteroid formasjon fra hele vev. (en) dag 0 krypten kultur med rund, flat utseende. (b) dag 4 enteroids med formet formasjon. (c) dag 7 enteroids med spirende (svart pil). Skalere barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Histologiske utseendet til en enteroid. Haemotoxylin og Eosin flekker. Enteroid viser et sentralisert lumen og utstillinger polaritet, med både en apikale og basolateral domene. Haemotoxylin (lilla) representerer kjernen, mens eosin (rosa) representerer cytosolic komponenter. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Enteroid utgangen cytoskjelett. Immunoflorescence mikroskop-bilde av en enteroids. Enteroid viser konstruksjonssikkerhet som demonstrert av fremtredende begrepsordbok cystoskeleton (rosa). Kjerner farget med DAPI (blå), skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Menneskelig enteroid kultur avkastning er redusert med LPS behandling. Dag 5 enteroids i kultur, vokst fra det samme hele Vevsprøve. (en) Enteroids behandlet med kontroll kultur medier. Vise robust vekst. (b) Enteroids behandlet med LPS i kultur medier. Bare noen få overlevende enteroids. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Økte TLR4 uttrykk i eksperimentell NEC enteroids. (en) qRT PCR viste økt TLR4 mRNA uttrykk i enteroids utsatt for LPS (p = 0,03). (b) Western blot analyse viser økt TLR4 uttrykk i eksperimentell menneskelige enteroid NEC (p = 0,02). Representant western blot avbildet. Verdiene er betyr ± SEM av 3 prøver per gruppe. * p < 0,05 av Student t -test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne romanen ex vivo menneskelige intestinal enteroid modell fungerer som en nyttig metode for studier av intestinal barriere dysfunksjon i nekrotiserende enterokolitt (NEC). Enteroid behandlingsmetoder presenteres her var tilpasset fra tidligere arbeidet til Dr. Misty Good, Michael Helmrath og Jason Wertheim10,11,12.

Detaljene rundt hele vev samling og timing krypten isolasjon er avgjørende skritt i denne protokollen. Vev må samles umiddelbart ved operative resection og behandlet krypten isolering så snart vevet kommer i laboratoriet. Vi valgte vev fra pasienter mindre enn 3 måneder gammel for denne modellen. Forsinket behandling kan oppstå innen 24 timer etter hele vev samling hvis nødvendig. I tillegg påvirker kvaliteten på menneskelig vev prøven sterkt avkastningen av crypt isolasjon. Sunn tynntarmen uten underliggende patologi og yngre pasienter (< 2 måneders alder) har blitt funnet for å gi de beste resultatene. I tillegg bør samlet vevet velges fra sunneste området, vanligvis i distale endene av resected prøven. Bruke et større stykke av tarmen blir ikke bedre krypten isolasjon med beskrevet løsning volumene i protokollen ovenfor. Intestinal segmenter ca 1-2 cm i lengde, vekt 0,75-2.5 g er optimale. Induksjon av eksperimentelle NEC via LPS eksponering er modellert etter veletablerte celle kultur og dyr modeller. Etablerte arbeidet av Hackam et al. viste den kritiske rollen TLR4 (LPS reseptor) i NEC, utvikling,9,,13,,14,,15. LPS aktivering av TLR4 stimulerer proinflammatory cytokiner, en reduksjon i barriere integritet og aktivering av subepithelial leukocytter som karakteriserer signalnettverk hendelsene i menneskelig NEC. TLR4 har vært innblandet som et viktig molekyl fremme betennelse7 og dyr at mangel funksjonelle TLR4 er har vist mot utviklingen av NEC15. Sirkulerende er LPS opphøyet hos pasienter med NEC og forhøyet i avføring og plasma av dyr modeller av NEC. LPS induserer intestinal betennelser i dyr som ligner menneskelige NEC, som fremhever betydningen av betennelse i denne veien. Speiling etablerte cellekultur og dyr modeller av NEC, tror vi at induksjon av eksperimentelle NEC via LPS administrasjon i enteroid kultur er en nyttig ex vivo menneskelige Nyfødte modell for studiet av NEC. I tråd med tidligere rapporter i andre etablerte modeller viste våre eksperimentelle NEC enteroids økt uttrykk for TLR4 forhold til kontroller.

Protokollen for induksjon av eksperimentelle NEC via LPS eksponering har gjennomgått flere viktige endringer og forbedringer. Først var enteroids vokst for 5 dager, og inokulert med LPS 24 h og deretter samlet. Protokollen nå anbefaler LPS inoculation dag 0 med fortsatte eksponering i hver kultur medier endring til samlingen. I tillegg ble dosering av LPS optimalisert. Etter å ha foretatt en dose kurve og trialing flere ulike LPS konsentrasjoner, er 5 mg/mL valgt. Eksperimentering med LPS vaksinasjon direkte inn i kjelleren membran matrise/enteroid blandingen på tiden av plating var også trialed; men dette var tungvinte og ble ikke bedre resultater.

Det er begrensninger må tas som utnyttelse av menneskelige enteroid modellen utvikler seg. Siden oppdagelsen i 2007, har flere forskjellige protokoller blitt brukt til å opprette og kultur enteroids. Mange vekstfaktorer kreves for enteroid vedlikehold og differensiering mangel standardisering, som kan påvirke reproduserbarhet. I tillegg mangler enteroid kultur mekaniske krefter som påvirker menneskelig intestinal epitel i fysiologiske forhold. Press fra luminal flyt og peristalsis kan påvirke genet og protein uttrykk som ikke er regnskapsført i denne modellen. Denne modellen mangler også nerver, immunceller, microbiome, blodkar og mesenchyme som finnes i menneskelige tarmen epitel.

Eksponering for LPS i denne menneskelige intestinal enteroid modellen fører en betennelsesreaksjon som fører til histologic, genetisk og protein uttrykk endringer ligner funnet i menneskelige NEC. Men det er flere dyr modellene av NEC, varierer svar på intestinal skader og terapeutisk intervensjon mellom artene. Siden det er etisk utfordrende å studere sykdom patofysiologi eller teste romanen terapeutiske agenter direkte hos mennesker, spesielt barn, er det svært viktig å dyrke denne romanen ex vivo modell av NEC bruker menneskelig vev. Menneskelig enteroids er mottakelig for genetisk modifisering og kan være grunnleggende i utviklingen av terapi for mange menneskelige tarmen sykdommer16. Framtidige retningslinjer bør sikte på å kultur menneskelige enteroids et permeable skafott i en perfusjonsmåling kammer med apikale og basolateral flyt for å reprodusere i vivo krypt-villus arkitektur samt fysiologiske styrker som peristalsis og luminal flyt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institute for Health Institute Diabetes fordøyelseskanal og nyre sykdom Grant (K08DK106450) og Jay Grosfeld prisen fra American Pediatric kirurgiske Association til C.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291, (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239, (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7, (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51, (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190, (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23, (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179, (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176, (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143, (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, (1), 81-83 (2011).
En roman menneskelige Epithelial Enteroid modell for nekrotiserende enterokolitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).More

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter