Enteroids växer fram som en ny modell i studiet av mänskliga sjukdomar. Protokollet beskrivs hur du simulerar en enteroid modell av mänskliga nekrotiserande enterokolit använder lipopolysackarid (LPS) behandling av enteroids genereras från neonatal vävnad. Insamlade enteroids påvisa inflammatoriska förändringar besläktad med de som setts hos människa nekrotiserande enterokolit.
Nekrotiserande enterokolit är (NEC) en förödande sjukdom hos nyfödda. Den kännetecknas av flera patofysiologiska förändringar i människans tarm epitel, vilket leder till ökad intestinal permeabilitet, nedsatt restitution och ökade celldöd. Det finns ett flertal djurmodeller av NEC, kan svar till skada och terapeutiska insatser vara mycket varierande mellan arter. Det är dessutom etiskt utmanande att studera sjukdomen patofysiologi eller nya terapeutiska medel direkt på människor, särskilt barn. Därför är det önskvärt att utveckla en ny modell av NEC med mänsklig vävnad. Enteroids är 3-dimensionella organoids härrör från tarmepitelceller. De är idealiska för studiet av komplexa fysiologiska samspel, cellsignalering och värd-patogen försvar. I detta manuskript beskriver vi ett protokoll att kulturer mänskliga enteroids efter isolera intestinal stamceller från patienter som genomgår tarm resektion. Crypt cellerna odlas i media som innehåller tillväxtfaktorer som stimulerar differentiering i olika cell typer infödingen av human intestinal epitel. Dessa celler odlas i en syntetisk, kollagena blandning av proteiner som fungerar som en byggnadsställning, härma extra-cellulära basalmembranet. Som ett resultat, utveckla enteroids apikala-basolateral polaritet. Samtidig administrering av lipopolysackarid (LPS) i media orsakar en inflammatorisk reaktion i enteroids, leder till histologisk, genetisk och protein uttryck förändringar liknande de som setts i mänskliga NEC. En experimentell modell av NEC med mänsklig vävnad kan ge en mer exakt plattform för läkemedel och behandling provning innan försök på människa, som vi strävar efter att identifiera ett botemedel mot denna sjukdom.
Mänskliga enteroids är en ex vivo 3-dimensionell kultur systemgenererade från stamceller isoleras från intestinal kryptor av human intestinal vävnadsprover. Denna banbrytande modell var pionjärer av Hans Clevers et al. i 2007 efter upptäckten av Lgr5 + stamceller på kryptor av tunntarmen i möss1. Deras arbete lade grunden för att upprätta en ex vivo intestinal epitelial kultur flera celltyper som kunde vara passaged utan betydande genetiska eller fysiologiska förändringar2. Sedan denna upptäckt, har enteroids använts som romanen modell för att studera normal mag fysiologi och Patofysiologi av tarmsjukdomar såsom inflammatorisk tarmsjukdom, värd-patogen interaktioner och regenerativ medicin2.
Användning av enteroids som ex vivo modell för studier av intestinal patofysiologin har flera fördelar jämfört med alternativa tekniker. För de senaste decennierna, har djurmodeller och förevigade intestinal cancer-derived cellinjer använts för att studera tarmens fysiologi3,4,5. Encelliga kulturer representerar inte mångfalden av celltyper förekommer i normal tarm epitel, därmed saknar celler överhörning och segment-specificitet i proteinuttryck, signalering och patogen-inducerad sjukdom6. I enteroids stamceller differentieras till stora epitelial celltyper såsom enterocyter, Paneth celler, bägarceller, enteroendokrina celler och mer3. De uppvisar polaritet, utföra epitelial transport funktioner och möjliggör intestinal segmentet specificitet6. Eftersom enteroids kan sammanfatta de flera celltyper av human intestinal epitel, är de kunna övervinna denna erkända begränsning av cancer cell-baserat system. Med tiden, derivat av cellinjer är subcloned och utvecklas för att uppvisa större mångfald i protein uttryck och lokalisering3. Däremot kan enteroids vara passaged utan betydande genetiska eller fysiologiska förändringar2. Även om många djurmodeller för NEC finns, kan svar till skada och terapeutiska insatser vara mycket varierande mellan arter. Till följd av dessa begränsningar therapeutics härrör från djurmodeller misslyckas 90% av tiden när testas i mänskliga prövningar på grund av skillnader i toxicitet eller effekt3. Enteroids fungera som lovande prekliniska modeller som kan övervinna dessa brister, vilket leder till en bättre förståelse för komplexa intestinal patofysiologi och därför mer framgångsrikt och kostnadseffektivt terapeutiska innovationer. Det finns också nya rön som åldern av vävnad som en enteroid genereras från återstår biologiskt viktiga7. Detta är en särskilt viktig detalj för vår modell eftersom enteroids genereras från neonatal vävnad, därigenom bibehålla fysiologiska betydelse för patienter med NEC.
Nyttan av enteroids som modeller för humana sjukdomar fortsätter att expandera, i hopp om att hitta botemedel för allvarliga och genomgripande förhållanden. Nekrotiserande enterokolit (NEC) är en förödande tarm sjukdom hos nyfödda kännetecknas av intestinal nekros och ofta leder till perforation av tarmväggen, septikemi, och död8. På grund av komplex och multifaktoriell patofysiologin av NEC, har den exakta mekanismen av sjukdomen inte ännu helt klarlagd; men har ökad intestinal permeabilitet varit tydligt inblandade i sjukdom processen8. Eftersom studien av NEC och potentiella terapeutiska medel är etiskt utmanande på människor, särskilt barn, det är mycket önskvärt att utnyttja en biologiskt relevanta enteroid modell av NEC med mänsklig neonatal vävnad. Hittills har enteroids en begränsad roll i studiet av NEC. Det här protokollet beskriver användningen av enteroids härrör från human intestinal vävnadsprover som en roman ex vivo modell för studier av nekrotiserande enterokolit.
Denna roman ex vivo human intestinal enteroid modell fungerar som en användbar metod för att studera tarmbarriären dysfunktion i nekrotiserande enterokolit (NEC). Enteroid bearbetningsmetoderna presenteras här anpassades från tidigare arbete av Drs. Misty Good, Michael Helmrath och Jason Wertheim10,11,12.
Detaljerna kring hela vävnad samling och tidpunkten för crypt isolering är viktiga steg i…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av det nationella institutet för hälsa Institutet för Diabetes och mag och njur sjukdom Grant (K08DK106450) och Jay Grosfeld Award från American Pediatric kirurgiska Association till C.J.H.
4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
[leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |