Bruke Flight Mills å måle Flight tilbøyelighet og ytelse av Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte)

Summary

Flight Mills er viktige verktøy for å sammenligne hvordan alder, kjønn, mating status, temperatur, eller ulike andre faktorer kan påvirke et insekt's Flight oppførsel. Her beskriver vi protokoller for å feste og måle fly tilbøyelighet og ytelse av vestlig mais rootworm under forskjellige behandlinger.

Abstract

Den vestlige mais rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Bladbiller), er en økonomisk viktig pest av mais i det nordlige USA. Noen populasjoner har utviklet motstand mot ledelses strategier inkludert transgene mais som produserer insecticidal giftstoffer avledet fra bakterien Bacillus thuringiensis (BT). Kunnskap om vestlig mais rootworm spredning er av avgjørende betydning for modeller av motstand evolusjon, spredning, og utslippsreduksjoner. Flight oppførsel av et insekt, spesielt over lang avstand, er iboende vanskelig å observere og karakterisere. Flight Mills gi et middel til å direkte teste utviklingsmessige og fysiologiske virkninger og konsekvenser av flyturen i laboratoriet som ikke kan fås i feltstudier. I denne studien ble fly møller brukt til å måle tidspunktet for fly aktivitet, totalt antall flygninger, og avstanden, varigheten og hastigheten på flyvninger tatt av kvinnelige rootworms i løpet av en 22-h testperiode. Seksten fly møller ble plassert i et miljøkammer med programmerbar belysning, temperatur og fuktighet kontroll. Fly møllen beskrevet er av en typisk design, der en flukt arm er fri til å rotere om en sentral Pivot. Rotasjon skyldes flukt av et insekt bundet til den ene enden av fly armen, og hver rotasjon er registrert av en sensor med et tidsstempel. Rådata er kompilert av programvare, som senere behandles for å gi sammendragsstatistikk for fly parametere av interesse. Den vanskeligste oppgaven for enhver fly mølle studie er vedlegg av snor til insekt med et klebemiddel, og metoden som brukes må skreddersys til hver art. Vedlegget må være sterk nok til å holde insekt i en rigid orientering og for å hindre avløsning under bevegelse, mens ikke forstyrrer naturlig vinge bevegelse under flyging. Vedlegget prosessen krever fingerferdighet, finesse, og hastighet, noe som gjør videoopptak av prosessen for rootworms av verdi.

Introduction

Den vestlige mais rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Bladbiller), ble identifisert som en pest av dyrket mais i 1909¹. I dag er det den viktigste pest av mais (Zea Mays L.) i US Corn Belt, med larvestadiet fôring på mais røtter forårsaker det meste av yield tap forbundet med denne pest. De årlige kostnadene for forvaltning og korn produksjon tap på grunn av mais rootworm er anslått til å overstige $1 000 000 000². Den vestlige mais rootworm er svært tilpasningsdyktig, og befolkningsgrupper har utviklet motstand mot flere Styrings strategier inkludert insektmidler, avling rotasjon, og transgene BT mais³. Bestemme romlige dimensjoner over hvilke taktikk må brukes for å redusere lokal utvikling av motstand, eller en motstand hotspot, avhenger av en bedre forståelse av spredning⁴. Begrensning tiltak vil ikke lykkes hvis de er begrenset til for lite av en romlig skala rundt en motstand hotspot, fordi resistente voksne vil spre utover reduksjonen området⁵. Forstå Flight atferden til vestlig mais rootworm er viktig å skape effektive motstand Styrings planer for denne pest.

Spredning av fly spiller en viktig rolle i voksen vestlig mais rootworm livshistorie og økologi⁶, og flyet atferden til denne pest kan bli studert i laboratoriet. Flere metoder kan brukes til å måle flyets virkemåte i laboratoriet. En actograph, som begrenser flyturen i et vertikalt fly, kan måle hvor mye tid et insekt er engasjert i flukt. Actographs har blitt brukt til å sammenligne Flight varighet og periodisitet mønstre av vestlig mais rootworm menn og kvinner på ulike aldre, kroppsstørrelser, temperaturer, insektmiddel mottakelighet, og insektmiddel eksponering^{7,8, 9}i. Flight tunneler, som består av en sporing kammer og regissert luftstrømmen, er spesielt nyttig for å undersøke insekt fly atferd når du følger en lukt Sky, slik som kandidat feromon komponenter¹⁰ eller plante flyktige¹¹. Flight Mills er kanskje den vanligste metoden for laboratoriet studier av insekt fly atferd og kan karakterisere flere aspekter ved fly tilbøyelighet og ytelse. Laboratory Flight Mills har vært ansatt i studier av Western Corn rootworm å karakterisere tilbøyelighet til å lage korte og vedvarende flyreiser samt hormonell kontroll av vedvarende Flight^12,13.

Flight Mills gi en relativt enkel måte å studere insekt Flight atferd under laboratorieforhold ved at forskerne å måle ulike fly parametere inkludert periodisitet, hastighet, distanse og varighet. Mange av fly fabrikkene som brukes i dag, er avledet fra rundkjøringer til Kennedy et al.¹⁴ og Krogh og Weis-Fogh¹⁵. Flight møller kan være forskjellig i form og størrelse, men det grunnleggende prinsippet forblir den samme. Et insekt er bundet og montert på en radial horisontal arm som er fri til å rotere, med minimal friksjon, om en vertikal aksel. Som insekt flyr fremover, er dens bane begrenset til sirkle i et horisontalt plan, med avstanden reist per rotasjon diktert av lengden på armen. En sensor brukes vanligvis til å oppdage hver rotasjon av armen forårsaket av fly aktiviteten av insekt. Rådata inkluderer rotasjoner per enhets tid, og tid på dagen fly skjedde. Dataene mates inn i en datamaskin for innspilling. Data fra flere fly møller er ofte registrert parallelt, i hovedsak samtidig, med banker på 16 og 32 fly møller blir vanlig. Rådata blir videre behandlet av tilpasset programvare for å gi verdier for slike variabler som flytur hastighet, totalt antall separate fly, distanse og varighet fløyet, og så videre.

Hver insektarter er annerledes når det gjelder den beste metoden for tethering på grunn av morfologiske variabler som Total størrelse, størrelse og form av målområdet for feste av snor, mykhet og fleksibilitet av insekt, behov og metode for bedøvelsen, potensial for forurensning av vinger og/eller hode med feilplassert eller overflow lim, og mange, mange flere detaljer. I tilfeller av visualisere tethering av en plataspid bug¹⁶ og en ambrosia Beetle¹⁷, de respektive målområdene for bindebånd er relativt store og tilgivende av unøyaktig lim plassering fordi hodet og vingene er noe godt separert fra vedlegget området. Dette er ikke å nedtone vanskelighetene med tethering disse insekter, som er krevende for alle arter. Men den vestlige mais rootworm er et spesielt utfordrende insekt til snor: pronotum er smal og kort, noe som gjør veldig presis vedlegg med en minimal mengde av klebemiddel (Dental voks i dette tilfellet) er nødvendig for å hindre interferens med åpningen av beina for fly og med hodet, hvor kontakt med øyne eller antenner kan påvirke atferden. Samtidig må festet festes godt for å unngå koagulater av denne sterke brosjyren. Demonstrasjonen av tethering av rootworm voksne er det viktigste tilbudet i denne utredningen. Det bør være til hjelp for andre som arbeider med denne eller lignende insekter der metoden visualisere her kan være et nyttig alternativ.

Dette papiret beskriver metoder som brukes til å effektivt snor og karakterisere fly aktiviteten av vestlig mais rootworm voksne som ble oppdratt på ulike larvestadiet tetthet. Flyet møller og programvare som brukes i denne studien (figur 1) var avledet fra design lagt ut på Internett av Jones et al.¹⁸ tethering teknikker ble endret fra beskrivelsen i stebbing et al.⁹ en matrise av 16 fly møller ble plassert i et miljøkammer, designet for å kontrollere belysning, fuktighet og temperatur (figur 2). Ved hjelp av denne eller lignende oppsett sammen med følgende teknikker gjør det mulig for testing faktorer som kan påvirke flyturen tilbøyelighet og ytelse av vestlige mais rootworm, inkludert alder, kjønn, temperatur, photoperiod, og mange andre.

Protocol

1. bakre vestlige mais rootworm for fly tester

Merk: Hvis voksen alder må kontrolleres eller kjent, må voksne først samles i felten etterfulgt av å oppdra sine avkom til voksen alder for testing. Hvis alderen på bille eller et standardisert oppdrett miljø er ikke av bekymring, deretter direkte testing felt-samlet voksne kan være mulig, og protokollen kan begynne med trinn 2.

1. Samle minst 500 vestlige mais rootworm voksne fra en åkeren av interesse for å sikre nok egg er innhentet for å oppdra tilstrekkelig antall voksne. Bruk en manuell aspirator for å samle voksne fra feltet.
   Merk: det anbefales å samle voksne under peak overflod, rundt slutten av juli i US Corn Belt, for å sikre innsamling av begge kjønn. De fleste voksne vil være menn hvis samlet tidligere, mens de fleste vil være kvinner hvis samlet senere.
2. Plasser samlet mannlige og kvinnelige voksne i en mesh bur som inneholder hakket mais øre, mais blad vev, 1,5% agar solid, og en oviposition substrat. En 18 x 18 x 18 cm bur (mesh størrelse 44 x 32, 650 μm blender) kan holde opp til 500 voksne på en gang.
   1. Bruk mais dyrket i feltet som en kilde til mais øre, som vil bli plukket på R3, eller melk stadium av kjerne utvikling¹⁹. R3-kjernen er gul utenfor, mens den indre væsken er melkeaktig hvit på grunn av akkumulering av stivelse. Corn ører kan fryses og lagres i opptil et år før de er nødvendig. Å mate det rootworm, fjerne det skrelle og hugge kornet i horisontal krysset-avdelinger om 3 cm tykk. Hakket korn er den primære dietten for de voksne og bør endres ut to ganger i uken.
   2. Få blader fra drivhus dyrket korn planter i alle aldre. Mengden av blad vev vil variere med antall voksne i buret. Unngå å bruke feltet planter, som de kan innføre sykdom.
   3. For å gjøre solid agar, bland 15 g av agar pulver med 1 L av DI vann. Varm blandingen til koking. Hell væsken i Petri retter (100 mm x 15 mm) mens den er varm. Plasser et lokk på Petri parabolen en gang kjølig og legg dem i kald lagring (6 ° C). Agar gir voksne med en kilde til fuktighet og bør endres ut to ganger i uken.
   4. For å forberede et oviposition substrat, plasser 40 g av soldet felt jord (< 180 μm) inn i en Petri parabolen. Fukt jorda med deionisert vann. Sørg for at jorda på bunnen av Petri parabolen vises våt. Score toppen av fuktet jord med en nål verktøyet. Fjern oviposition substrat ukentlig og plasser i en inkubator ved 25 ° C og 60% RH i minst en måned.
3. Etter incubating egg i en måned, vask innholdet i oviposition underlaget gjennom en 250-μm sil til all jord er fjernet. Kvantifisere eggene ved å plassere vasket egg i en 10-mL gradert sylinder. Det er ca 10 000 egg per 1 mL.
4. Plasser kvantifisert eggene i en 44 beholder og dekk med soldet felt jord (< 180 μm). Vestlig mais rootworm egg gjennomgår forplikte diapause gjennom vinteren²⁰. For å bryte diapause, Legg eggene i kald oppbevaring (6 ° C) i minst 6 måneder.
   Merk: egg kan oppbevares i kaldt lager i mer enn 5 måneder, men egg levedyktighet avtar med tiden. Etter 12 måneder, kan det være liten eller ingen luke.
5. Etter minst 5 måneder, fjerne egg fra kulde lagring og plass i en inkubator ved 25 ° C og 60% RH. Nyfødte Luke så tidlig som 16 dager etter fjerning fra kald lagring.
6. Når eggene klekkes, plassere tre spirer kjerner på bunnen av en 44-mL plastbeholder med røtter eksponert (dvs. ikke dekket med jord). Bruk en myk børste til å overføre 12 nyfødte til overflaten av røttene.
7. Tilsett 4,5 mL av DI vann til 40 mL soldet jord (< 600 μm). Plasser fuktig jord over spirer kjerner som har blitt infisert med nyfødte og dekk beholderen med mesh stoff for å hindre larver fra å rømme.
8. På samme dag som den 44 plast beholderen er satt opp med nyfødte, klargjør du en 473-mL beholder med mais kjerner som ikke har spirer. De rootworm larver vil bli overført til denne større container senere. Antall kjerner bestemmer ønsket larvestadiet tetthet per plante. Tilsett 120 g jord blanding bestående av 50% soldet felt jord (< 600 μm) og 50% potting jord fuktet med 20 ml deionisert vann.
9. Etter 7 dager overfører du alt innholdet i 44-mL-beholderen til 473-mL-beholderen. Larvene vil bli andre larvestadiene på tidspunktet for overdragelsen.
   Merk: denne overføringen til en større container er nødvendig for å forsyne larver med nok rot masse for fôring gjennom forpupping.
10. Observer fremveksten av voksne vanligvis rundt 26 dager etter egg luke. Voksne er aktive løpesedler på fremveksten og kan unnslippe 473-mL container når du prøver å samle dem for hånd. Bruk i stedet et vakuum med en aspirator for å samle voksne.
11. Skille voksne etter kjønn og/eller dato om nødvendig for sammenlignende testing. Sex of Western Corn rootworm kan bestemmes ved å observere morfologi av bruk basitarsi²¹. Hanndyr ha bred, kvadrat-formet bruk basitarsi, mens de av kvinner er smal og konisk-formet.
    1. Plasser bille i en 45-mL klar polystyren plast hetteglass og dekk med et lokk med 6 små (~ 1 mm diameter) hull.
    2. Bedøve. Plasser enden av et rør festet til en CO₂ tank regulator over hullene i lokket og la en svak strøm av co₂ å gå inn i røret for ca 10 til 15 s til den voksne mister grepet på veggen av hetteglasset.
       Merk: det anesthetized insekt vil forbli immobilisert i ca 1 min.
    3. Plasser anesthetized bille, ventrale side opp, på en invertert plast Petri parabolen bunnen. Forsiktig plassere ikke-invertert lokket av Petri parabolen over bille. Kontroller at tarsi på bille trykket mot lokket, noe som gir enkel observasjon av bruk basitarsi under et dissekere mikroskop.
12. Hvis eksperimentet krever at biller være paret før flyturen, og deretter bruke menn minst 5 dager gamle til kompis med den nylig dukket kvinner.
    Merk: bruk av eldre menn sikrer at de er seksuelt modne på deres introduksjon til jomfru kvinner. Kvinner er seksuelt modne upon voksen fremveksten, mens menn krever 5 til 7 dager av post-fremveksten utvikling for å nå seksuell modenhet^22,23.

2. Start Flight Mill programmet før fly testing

Merk: The Flight Mill programfiler (. vi filendelser som kjøres i en kommersiell programvareplattform, se tabell over materialer) og detaljer for deres bruk er gitt for nedlasting via lenker ("dataanalyse rutine" og "Circular Flight Mill instruksjoner", henholdsvis) i "Flight Mill kabling og programvare"-delen på Jones et al.¹⁸ nettsted. Hvis programmene ikke lenger fungerer i nyere eller fremtidige versjoner av programvareplattformen, eller hvis brukeren ønsker å legge til nye funksjoner, kan rutinene fra Jones et al. ¹⁸ endres av brukeren etter behov.

1. Åpne programvaren for fly møllen (Figur 3).
2. Angi informasjonen under kategorien initialisering .
   1. Still Start tid og sluttid for ønsket varighet av flyturen testen.
      Merk: alle voksne skal være bundet og montert på fly møller med 30 min før start time. Det kan ta en erfaren person 30 min til 45 min å feste og forberede 16 biller for fly testing (se avsnitt 3).
   2. Angi minimums terskel (min.) til 0. Dette sikrer at alle deteksjon av fly arm bestått vil bli registrert, og er standard anbefalt av Jones et al. ¹⁸.
   3. Angi maksimums terskel (min.) til 1. Her ble 1 min brukt. Denne verdien betyr at 1 min må gå mellom sensor deteksjon av fly armen for å "syne" slutten på en flyvning.
   4. Skriv inn et navn på filen.
   5. Angi Intervall for rå data Logg (min.) til 1. Denne verdien styrer intervallet som rådata skal kompileres for utdata-rapportering. Her er det satt til 1 min. Dermed vil produksjonen av revolusjoner, for eksempel, logges per minutt.
      Merk: den faktiske tidsintervallet mellom elektronisk skanning av sensor aktivitet er svært kort, men en 1-min intervall gjør det mulig å logge på en fin nok skala for de fleste forskningsformål, mens begrense antall linjer i regneark utgang til et rimelig tall for å undersøke ved øyet.
3. Under kategorien emneinformasjon fyller du ut kolonnene merket ID, diett, kjønn, arter og kommentarer etter ønske.
4. Falle i staver på starte knapp lokalisert på igjen side av skjermen utfoldelse. Programmet vil begynne å samle rådata når gjeldende tid samsvarer med Start tid.

3. snor vestlig mais rootworm til Flight mill

1. Bøy en 40 mm lengde 28-gauge stål wire 90 ° i midten.
   Merk: ledningen kan også være av et annet metall som kobber eller messing.
2. Ta en liten mengde tann voks, litt større enn en Pinhead, og rull den mellom fingertuppene til en ball dannes. Sørg for at fingrene er rene for å hindre rusk, skitt og olje fra innlemme i voks, fordi det kan hindre at voks fra å følge insekt.
3. Skyv den ene enden av 40 mm den bøyde ledningen inn i midten av ballen av voks.
4. Bedøve testen voksen med CO₂ som beskrevet ovenfor (se 1.11.1 og 1.11.2).
5. Plasser anesthetized på et flatt underlag og plasser den med rygg side opp. Hvis bille ikke ligger helt flatt på overflaten, omplassere bena slik at den gjør. Det er viktig at bille ligge så flatt som mulig på overflaten for å sikre riktig posisjonering av ledningen.
6. Kort (< 1 s) varme tann voks på ledningen med en butan lighter. Hvis voks varmes opp for lenge, smeltet voks vil slippe ut av ledningen. Ikke gjenbruk voksen hvis den har falt av fra ledningen, som det ikke vil effektivt holde seg til insekt cuticle.
7. Legg forsiktig i enden av ståltråd med smeltet tann voks på rygg flaten av pronotum, mens peker den andre enden av ledningen, (dvs. slutten uten Dental voks), langs midtlinjen av magen. Alternativt kan du peke på slutten av ledningen uten Dental voks mot hodet hvis ønskelig. I så fall vil en flygende bille presse fly armen i stedet for å trekke den. Vær sikker på at smeltet voks ikke får på beina eller dens sting, da det kan hindre eller hindre fly.
8. Plasser den frie enden av ledningen inn i åpningen av hul metallrøret på fly mølle armen. Sørg for at tråden sitter tett nok til å holde på plass ved friksjon. Den bundet bille kan være posisjonert til å fly enten med klokken eller mot urviseren.
9. Umiddelbart etter montering av en bille, rive et lite stykke (~ 1-cm DIA) av vev papir fra et større vev. Tilby vevet stykke til bundet bille hengende fra flyfabrikken for tarsal kontakt; de fleste biller vil ta tak i vevet og holde det mot tyngdekraften til de slipper den i begynnelsen av sin første flytur aktivitet. Dette vil i stor grad redusere første flukt eller landing flytur oppførsel.
   Merk: menneskelig tilstedeværelse i Flight-testing rommet bør begrenses til å feste og fjerne voksne fra flyet møller. Testperioden begynner vanligvis ikke før minst 30 min har gått siden vedlegget (se note under 2.2.1), og mennesker bør ikke være til stede i fly rommet i løpet av denne tiden, eller i løpet av testperioden selv.
10. Fjern alle fly testede voksne etter fullføring av en fly mølle test. Fjern voks perlen som kobler ledningen til pronotum ved å forsiktig skrelle kabelen bort fra pronotum. Voksen vil skille lett uten å skade cuticle, noe som gjør insekt tilgjengelig for videre eksperimentering hvis ønskelig.

4. lagre dataene som er samlet inn fra fly mølle programmet.

1. Programmet kan være satt til enten manuell eller automatisk. Hvis programmet er satt til manuell, må brukeren avslutte programmet ved å klikke på Stopp -knappen. Hvis programmet er satt til Auto, vil programmet slutte å samle rådata når gjeldende klokkeslett samsvarer med sluttidspunkt.
2. Falle i staver utgangen etter det flyreise-tester periode har endte.
3. Kontroller at en TDMS-fil er lagret under filnavnet som ble angitt under initialisering av programmet (trinn 2,2).
4. Klikk på TDMS-filen og lagre dokumentet som et regneark (XLSX).

5. hente fly parametere fra det lagrede regnearket (XLSX)

Merk: et regneark kan være tilpasset for å manipulere rådata fra fly mølle programvaren. Her var programvaren den samme som beskrevet av Jones et al. ¹⁸, men en ekstra rutine ble lagt til å anerkjenne og oppsummere den lengste uavbrutt flytur av et individ insekt i løpet av testperioden.

1. For hver enkelt person som er engasjert i fly aktivitet, vil regnearket inneholde følgende informasjon: flynummer, total revolusjoner, starttid, sluttid og fly varighet i minutter.
   1. For å beregne den totale avstanden fløyet i løpet av testperioden, sum kolonnen merket "total omdreininger" og multiplisere den med avstanden fløyet per revolusjon. Avstand per revolusjon avhenger av lengden på fly armen fra den sentrale pivot til vedlagte insekt. For eksempel, hvis denne avstanden er 15,9 cm, er hver revolusjon tilsvarende en meter fløyet. Det totale antallet omdreininger kan også finnes i ' test statistikk '-fanen.
   2. Hvis du vil beregne den totale varigheten som er fløyet i løpet av testperioden, summerer du kolonnen for «fly varighet (min)».
   3. For å bestemme avstanden og varigheten av den lengste uavbrutt flyvning, gå til ' test statistikk '-fanen og se under kolonnen merket ' lengste Flight # '.
   4. Flight hastighet kan beregnes ved å dele avstand fløyet av flyturen varighet. For insekter, er hastighet vanligvis uttrykt i m/s eller km/t.

Representative Results

Figur 4 viser representative eksempler på utganger som forventes etter fly testing. Flight data ble innhentet fra eksperimentell arbeid utført ved Institutt for entomologi ved Iowa State University. Seks-dagers-gamle, paret kvinnelige vestlige mais rootworm voksne var bundet til fly møller og plassert i et kontrollert miljøkammer satt til 14:10 L:D, 60% RH, og 25 ° C. Den biller ble etterlatt på flyet møller i 22 sammenhengende timer begynner 30 min før initiering av simulert soloppgang, og deres fly aktivitet ble registrert (Figur 4). Dawn og skumring ble simulert av en programmert, gradvis endring i lys intensitet fra full-off til full-on ved daggry (eller vice-versa i skumringen) over en 30-minutters periode. Den første kategorien i det resulterende regnearket oppsummerer de enkelte voksne som ble testet, ved hjelp av informasjon som er angitt fra trinn 2,3. De etterfølgende fanene inkluderer fly data for hver enkelt person. De to siste fanene er merket med "RAW DATA" og "test statistikk". "RÅDATA" inkluderer tid for fly aktivitet for alle individer. "Test stats" indikerer den lengste uavbrutt flytur for hver bille, og Sammendrag av varigheten av den lengste uavbrutt flytur i minutter, den totale tiden i flukt i løpet av test perioden i minutter, og det totale antall omdreininger i løpet av testperioden. Tidsstempler for begynnelsen og slutten av hver uavhengig flyvning tillater analyser av fly periodisitet.

For kvinnelig bille bundet til Flight Mill #2 (figur 4b), viser regnearket antall flyreiser, totalt omdreininger per fly, start-og sluttid for hver flyging, og varigheten av hver flyreise. Denne kvinnelige engasjert i flere uavhengige flyreiser, hvorav de fleste var svært korte. Men i flukt #5 den kvinnelige reist 1 258 m (som tilsvarer antall omdreininger i dette tilfellet, fordi avstanden per revolusjon var 1 m) over en 37,8-min periode med uavbrutt flytur. Den kvinnelige bille bundet til Flight Mill #1 (figur 4c) ikke engasjere seg i flukt i løpet av testperioden, så et tomt regneark vises.

Som et eksempel, resultatene er presentert fra en enkel sammenligning av flyturen egenskaper mellom to grupper av kvinnelige vestlige mais rootworm. Voksne ble samlet i kommersielle kornåkre fra to steder i Iowa og lov til å oviposit i laboratoriet. Egg ble samlet inn, og avkom oppdratt som beskrevet i trinn 1 av protokollen på en post-nyfødte tetthet (trinn 1,9) av 12 larver per 36 frøplanter. Den resulterende voksne hunner ble bundet og testet som beskrevet i trinn 2 og 3. Tabell 1 viser et sammendrag av fly parametere fra rådata som hentes fra fly mølle programvaren, som beskrevet i trinn 4 og 5. Totalt antall fly parametere henviser til summen av alle flyreisene til en person i løpet av 22-h testperioden, mens de lengste fly parametrene viser til den lengste uavbrutt flyvning under testen.

Figur 1. Insekt fly møller brukes til bundet eksperimenter. (A) hele insekt fly mølle og (B) arbeider del av flyfabrikken. (A) Working del av flyfabrikken er sirkel, (B) (1) 1 m sprøyte tube Flight arm, (2, 3) repelling Ferrite ring magneter, (4) Digital Hall effekt sensor, (5) små nikkel ring magnet brukes til å utløse sensoren, og (6) sprøyte tynn vegg rør ("Sentral pinne") som skiller repelling magneter (2, 3). Flight Mills modifisert litt fra den opprinnelige utformingen av Jones et al.¹⁸  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Komponenter av flyfabrikken miljøkammer. (A) utvendig kammer funksjoner inkluderer (1) Intellus kontrolleren, (2) kontrollpanelet, og (3) hoved strøm koble. (B) innvendige kammer funksjoner inkluderer (1) enhet kjølere (bak tak panel), (2) LED-moduler, (3) hyller enheter, og (4) Pan-type luftfukter.  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Et grensesnitt av Flight Mill programmet. (A) den første kategorien, merket "initialisering", krever informasjon som start-og sluttids-og filnavn. (B) den andre kategorien, merket "emneinformasjon", ikke krever noen informasjon som skal oppgis, men brukes til å skille mellom flere individer evaluert i en enkelt flytur test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Representative Flight data fra 6-dagers-gamle kvinnelige vestlige mais rootworm biller. (A) den første kategorien av produksjonen oppsummerer informasjonen på syv individer fly testet på en bestemt dag. (B) Flight data for hunnen på flyfabrikken #2 (FM # 2), som driver flere uavhengige flyvninger i løpet av 22-timers testperioden. (C) den kvinnelige plassert på flyfabrikken #1 (FM # 1) ikke engasjere seg i flukt i løpet av 22-timers testperiode, noe som resulterer i et tomt regneark.  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

		Plasseringen
		Ames	Nashua
Eksempel størrelse1		23	31
Total fly distanse (m)		387,83 ± 146,21	949,10 ± 267,73
Total fly varighet (min)		14,34 ± 5,06	37,01 ± 10,51
Total flytur hastighet (m/s)		0,42 ± 0,04	0,44 ± 0,06
Lengste fly distanse (m)		184,48 ± 81,82	590,13 ± 186,01
Lengste fly varighet (min)		6,27 ± 2,26	22,15 ± 7,67
Lengste flytur hastighet (m/s)		0,46 ± 0,04	0,44 ± 0,03
1 fløy minst 1 minutt

Tabell 1. Mean (± SE) ytelse på fly møller av kvinnelige vestlige mais rootworm fra to steder i Iowa. Lengste flyvning refererer til den lengste uavbrutt (dvs. kontinuerlig) flyvning som utføres av hver enkelt person i løpet av testperioden.

Discussion

Karakteriserer vestlige mais rootworm fly atferd er viktig for å utarbeide effektive motstands ledelses planer. Flight atferden til denne pest har blitt studert i laboratoriet ved hjelp av ulike metoder, inkludert actographs, fly tunneler, og fly møller. Flight Mills, som beskrevet og illustrert i denne utredningen, la insekter å gjøre uavbrutt flyreiser slik at forskerne kan kvantifisere Flight parametre som avstand, varighet, periodisitet, og hastigheten på enkelte flyreiser, over en hel testperiode.

Den mest utfordrende skritt i protokollen for flyfabrikken eksperimentering med vestlig mais rootworm, som det er for de fleste insektarter, er riktig å bruke en snor til den voksne (trinn 3). Dette kan være en vanskelig oppgave på grunn av den lille mengden av overflateareal tilgjengelig på pronotum for festing av wire, samt store mengder av naturlige voks på cuticle overflaten. Oppgaven er gjort vanskeligere av den begrensede tiden tilgjengelig for å bruke snor før insekt begynner å røre som det framgår av CO₂ bedøvelsen. Det er viktig at snor er lined opp riktig og fester seg til bille ' s pronotum gjennom hele testperioden. Hvis det er feiljustert, kan bille ha en vanskelig tid å engasjere seg i flukt mens på flyfabrikken, noe som resulterer i artifactually lavere avstand, varighet og hastighet. Bille kan unnslippe under testperioden hvis tann voks ikke overholder ledningen sterkt nok til pronotum. Derfor er det viktig å ha rene, stødige hender, en god sans for oppvarming av voks til en gjennomførbar temperatur, og tillit mens tethering biller, som alle er oppnåelige med tilstrekkelig praksis.

Det må tas en avgjørelse om hva som utgjør en uavhengig fly begivenhet, slik at maksimums terskelverdien kan stilles inn (Step 2.2.3). En person kan gjøre ingen flyreiser, en flyreise, eller dusinvis av flyreiser i løpet av en testperiode, avhengig av sin stop-and-Go aktivitet, men også på den tildelte maks terskelverdi. Standardverdien som rapporteres av Jones et al.¹⁸ er 5 s. I denne studien av vestlig mais rootworm, ble Max terskelen satt til 1 min. Den mest hensiktsmessige innstillingen er en dom samtale basert på insektarter og målene for forskeren. Det er Trade-offs. Et insekt som slutter å fly, men fortsetter å sirkel for en eller flere revolusjoner på grunn av momentum vil ha disse revolusjoner feilaktig telles som en del av forrige fly når verdien er satt til 1 min. Hvis verdien er satt til 5 s, vil de fleste av de ekstra ikke-fly revolusjoner ikke telles og logging av at flyturen vil bli riktig avsluttet. På den annen side, noen ganger et insekt bremser sin flytur betydelig i et forsøk på å kontrollere sin retning, til land, eller av andre grunner, så fortsetter flyr i høyere hastighet uten å ha stoppet aktiv flytur. Slik oppførsel på fly møller er vanlig og har blitt observert i vestlig mais rootworm; det vil ofte bli loggført som to separate flyvninger når maksimums terskelen er satt til 5 s, men vil bli riktig registrert som en uavbrutt flyvning når terskelen er 1 min. Under 1-min terskel, men flyet av et insekt som virkelig stopper flyr deretter gjenopptar flyturen innen 1 min ville være feilaktig registrert som ikke har stoppet.

En minimumsgrense for flyvning (f.eks. minst én flyvning på minst ett minutt) kan brukes til å ekskludere fra videre analyser voksne som kan ha blitt skadet under behandling eller som ellers var i dårlig helse. The trade-off for å beskytte mot slike falske-nuller (eller falske svært korte fly) er muligheten for å ekskludere sant-nuller (eller ekte svært korte flyreiser), dvs. individer som var friske, men var ikke motivert til å fly. Forskeren må bestemme hvordan man skal håndtere nuller (eller svært korte fly) basert på målene for eksperimentet, samt hvilken type feil er mest sannsynlig og som er minst ønskelig når det gjelder å tolke resultatene. I tillegg oppstår et vanlig problem når plasseringen av flyet armen støtter en inaktiv bille skjer for å være direkte over, eller svært nær, sensoren, hvor små bevegelser av armen forårsaket av ikke-flybevegelser av insekt eller svak luft strømmer i kan bli feilaktig registrert som revolusjoner. For å hindre at denne metodisk gjenstanden kan blåse opp frekvensen av kortere flytider, anbefales det å ekskludere alle flyvninger som varer ≤ 1 min fra analyser. Denne typen artifactual lesing, hvis den går på i lengre tid, kan også resultere i en nonsensically høy hastighet (f. eks, > 2 m/s) for en innspilt "Flight"; Når de oppdages, bør disse "Flight"-dataene slettes for den enkelte.

Selv om Flight Mill studier har gitt viktig innsikt i vestlig mais rootworm flyturen atferd, som med alle arter er det komplikasjoner i forbindelse bundet fly til naturlig flytur i feltet²⁴. Et insekt på en fly mølle er suspendert, noe som gir vertikal støtte for sin vekt. Dermed energien brukt til å gi løft under naturlig flytur kan ikke investeres av bundet insekter på fly møller²⁵. På den annen side må et bundet insekt gi mer kraft enn i fri-fly for å overvinne friksjon ved pivot, den ekstra vekten av fly armen, og aerodynamisk drag fra fly armen^25,26. Naturlig fly av vestlige mais rootworm også noen ganger oppstår på høyder over sin flukt grensen lag²⁷, der avstanden dekkes under flyturen kan være sterkt påvirket av vindhastigheter som er mye større enn insekt ' s blotte flytur hastighet ²⁸. Flight Mills pålegge enveis fly, slik at avstanden fløyet kan overvurdere total forskyvning i feltet der flyturen banen kan være svingete. Gir tarsal kontakt med et lite stykke vev etter montering av insekt på flyfabrikken (trinn 3,9) reduserer første flukt fly, samt fly aktivitet knyttet til et forsøk på å lande. Men når bille dråper vevet under et eksperiment, det samme problemet med manglende evne til å avslutte flytur ved landing er oppstått. Alternative actograph systemer har blitt brukt i laboratoriet fly eksperimenter med bundet^8,9 eller kabelkaos⁷ Western Corn rootworm. Mens de lindre problemet med flukt oppsigelse ved å tillate spontan tarsal kontakt, er trade-off er manglende evne til å måle fly distanse eller hastighet. Til tross for disse begrensningene, er flyfabrikken svært nyttig som et komparativ verktøy for å undersøke hvordan en rekke utviklingsmessige, biotiske og abiotiske faktorer påvirker et insekt ' s tilbøyelighet til å engasjere seg i flukt, og hvordan fly atferden selv er berørt. Når det kombineres med andre bevis, slik som det som er gitt av merke-Capture eksperimenter²⁹, Trap data³⁰, og estimater av gen Flow³¹, bidrar den unike innsikten fra Flight Mill eksperimenter mot en helhetlig forståelse av vestlig korn rootworm spredning i felten og dens befolkning-nivå konsekvenser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butane multi-purpose lighter	BIC	UXMPFD2DC	To soften wax when tethering
Clear polystyrene plastic vial (45-ml)	Freund Container and Supply	AS112	To hold beetle while anesthetizing
Dehydrated culture media, agar powder	Fisher Scientific	S14153	To make agar for holding moisture for adults
Delrin rod (1" diameter, 3.75" long)	Many suppliers: can use cheapest on the internet.		For post of flight mill
Dental wax	DenTek	47701000335	Adheres wire tether to prothorax
Ferrite ring magnets (OD: 0.69”, ID: 0.29”, Thickness: 0.118”; 7oz pull)	Magnet Shop	63B06929118	Opposing - to generate the float.
Hall effect sensor	Optikinc	OHN3120U	Look under magnetic sensors on the left side of the Optekinc website then look for the part number. A link is given for current suppliers.
Hypodermic tubing (22 gauge; 0.0358” OD x 0.01975” ID x 0.004” wall)	Small Parts, Inc.	HTX-22T-12	Used for flight mill arms and main axis rod.
Incubator (104.1 x 85.4 x 196.1 cm)	Percival Scientific	I-41VL
LabVIEW Full Development System software, system-design platform	National Instruments (See http://www.ni.com/en-us/shop/labview/select-edition.html)	LabVIEW 2018 (Full Edition)	Provides environment needed to run flight mill files (.vi extensions) available for download from Jones et al.18 at http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill.  LabVIEW 2018 Full is compatible with Win/Mac/Linux operating systems.
Mesh cage (18 x 18 x 18 cm)	MegaView Science Co. Ltd.	BugDorm-4M1515	mesh size = 44 x 32, 650 µm aperture
Needle tool	BLICK	34920-1063	For scoring soil surface for egg laying in laboratory
Nickel ring magnets (3/16” OD x 1/16” ID x: 1/16” thick)	K&J Magnetics	R311	Used to trigger the digital hall effect sensor.
Petri dish (100 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	S33580A
Plastic container (44-ml)	Dart	150PC	For initial rearing of young larvae
Plastic container (473-ml)	Placon	22885	For rearing of older larvae
Round brush (size 2)	Simply Simmons	10472906	For transferring freshly hatched neonates to surface of roots
Sieve (250-µm)	Fisher Scientific	08-418-05	To separate eggs from soil
Steel wire (28-gauge)	The Hillman Group	38902350282
Teflon rod (3/8" diameter, 3/4" length)	United States Plastic Corporation	47503	To accept the rotating arm.
Vacuum	Gast Manufacturing, Inc.	1531-107B-G288X	For aspirating adults in laboratory
White poly chiffon fabric	Hobby Lobby	194811	To prevent escape of larvae from rearing container