Summary
Летные мельницы являются важными инструментами для сравнения того, как возраст,пол, состояние спаривания, температура или различные другие факторы могут влиять на поведение насекомого. Здесь мы описываем протоколы, чтобы привязывать и измерять склонность к полету и производительность западного кукурузного корневого червя при различных методах лечения.
Abstract
Западный корневой червь кукурузы, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Chrysomelidae), является экономически важным вредителем кукурузы в северной части Соединенных Штатов. Некоторые популяции разработали устойчивость к стратегиям управления, включая трансгенную кукурузу, которая производит инсектицидные токсины, полученные из бактерии Bacillus thuringiensis (Bt). Знание западного рассеивания корневого червя кукурузы имеет решающее значение для моделей эволюции устойчивости, распространения и смягчения последствий. Поведение насекомого, особенно на большом расстоянии, по своей сути трудно наблюдать и охарактеризовать. Летные мельницы предоставляют средства для непосредственного тестирования развития и физиологических воздействий и последствий полета в лаборатории, которые не могут быть получены в полевых исследованиях. В этом исследовании летные мельницы использовались для измерения времени полетной активности, общего числа полетов, а также расстояния, продолжительности и скорости полетов, выполняемых женскими корневыми червями в течение 22-h испытательного периода. Шестнадцать летных мельниц были размещены в экологической камере с программируемым освещением, температурой и контролем влажности. Описанная летная мельница имеет типичную конструкцию, где рука полета свободно поворачивает сяротку около центрального опоры. Вращение происходит от полета насекомого, привязанного к одному концу летной руки, и каждое вращение записывается датчиком с отметкой времени. Необработанные данные компилируются с помощью программного обеспечения, которое впоследствии обрабатывается для предоставления сводной статистики по параметрам полетов, представляющим интерес. Самой трудной задачей для любого исследования летной мельницы является присоединение троса к насекомому с клеем, и используемый метод должен быть адаптирован к каждому виду. Крепление должно быть достаточно сильным, чтобы держать насекомое в жесткой ориентации и предотвратить отслоение во время движения, не мешая при этом естественному движению крыла во время полета. Процесс вложения требует ловкости, утонченности и скорости, делая видеоматериалы процесса для корневых червей стоимости.
Introduction
Западный корневой червь кукурузы, Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae), был определен как вредитель культивируемой кукурузы в 19091. Сегодня, это самый важный вредитель кукурузы(Зея может Л.) в США кукурузный пояс, с личинки кормления на корни кукурузы вызывает большую часть потери урожайности, связанные с этим вредителем. Ежегодные расходы на управление и потери производства кукурузы из-за кукурузы корневой червь, по оценкам, превышает $ 1 млрд2. Западный корневой червь кукурузы очень адаптируется, и популяции развили устойчивость к нескольким стратегиям управления, включая инсектициды, севооборот, и трансгенные bt кукурузы3. Определение пространственных измерений, над которыми должна применяться тактика для смягчения локального развития сопротивления, или точки доступа сопротивления, зависит от лучшего понимания разгона4. Меры по смягчению последствий не будут успешными, если они будут ограничены слишком малым пространственного масштаба вокруг точки доступа сопротивления, потому что устойчивые взрослые будут рассеиваться за пределы зоны смягчения5. Понимание поведения полета западной кукурузы корневой червь имеет важное значение для создания эффективных планов управления устойчивостью для этого вредителя.
Разгон по летом играет важную роль во взрослой западной кукурузы корневого червя истории жизни и экологии6, и поведение полета этого вредителя могут быть изучены в лаборатории. Для измерения поведения полета в лаборатории может использоваться несколько методов. Актограф, ограничивающий полет в вертикальной плоскости, может измерять количество времени, в течение которого насекомое участвует в полете. Актографы были использованы для сравнения продолжительности полета и периодичности моделей западной кукурузы корневого червя мужчин и женщин в разном возрасте, размеры тела, температуры, инсектицидной восприимчивости, и воздействие инсектицидов7,8, 9. Полет туннели, которые состоят из камеры слежения и направленного воздушного потока, особенно полезны для изучения поведения полета насекомых при следовании шлейф запаха, таких как кандидат феромонов компонентов10 или растений летучих11. Летные мельницы, пожалуй, наиболее распространенный метод для лабораторных исследований поведения насекомых полета и может охарактеризовать несколько аспектов летной склонности и производительности. Лабораторные летные мельницы были использованы в исследованиях западного кукурузного корневого червя, чтобы охарактеризовать склонность совершать короткие и устойчивые полеты, а также гормональный контроль устойчивого полета12,13.
Летные мельницы обеспечивают относительно простой способ изучения поведения насекомых в лабораторных условиях, позволяя исследователям измерять различные параметры полета, включая периодичность, скорость, расстояние и продолжительность. Многие из летных мельниц, используемых сегодня, являются производными от кольцевых разбое14 и Крога и Вайс-Фога15. Летные мельницы могут быть разными по форме и размеру, но основной принцип остается прежним. Насекомое привязали и смонтировали на радиальной горизонтальной руке, которая свободно вращается, с минимальным трением, о вертикальном валу. Как насекомое летит вперед, его путь ограничивается кружили в горизонтальной плоскости, с расстоянием, пройденное за вращение продиктовано длина руки. Датчик обычно используется для обнаружения каждого вращения руки, вызванного летной активностью насекомого. Сырые данные включают вращения на единицу времени, и время полета дня произошло. Данные подаются в компьютер для записи. Данные с нескольких летных мельниц часто регистрируются параллельно, по существу одновременно, при этом банки 16 и 32 летных мельниц являются общими. Необработанные данные дополнительно обрабатываются пользовательским программным обеспечением для обеспечения значений для таких переменных, как скорость полета, общее количество отдельных рейсов, расстояние и продолжительность полета и так далее.
Каждый вид насекомых отличается, когда дело доходит до наилучшего метода для привязывания из-за морфологических переменных, таких как общий размер, размер и форма целевой области для крепления троса, мягкость, и гибкость насекомого, необходимость и метод для анестезии, потенциал для загрязнения крыльев и / или головы с неуместным или переполнения клея, и многие, многие другие детали. В случаях визуализированного привязывания plataspid ошибка16 и амброзия жук17, соответствующие целевые области для крепления троса являются относительно большими и прощает неточное размещение клея, потому что голова и крылья несколько хорошо отделены от сайта вложений. Это не преуменьшать сложность привязывая этих насекомых, который требует для любого вида. Но западный кукурузный корневой червь является особенно сложным насекомым, чтобы привязывать: пронотам узкий и короткий, что делает очень точное вложение с минимальным количеством клея (зубной воск в этом случае), необходимых для предотвращения вмешательства в открытие elytra для полета и с головой, где контакт с глазами или антеннами может повлиять на поведение. В то же время, трос аттера должны быть твердо прикреплены, чтобы избежать выбивки этой сильной листовки. Демонстрация привязывания корневого червя взрослых является наиболее важным предложением в этой работе. Это должно быть полезным для тех, кто работает с этим или аналогичными насекомыми, где метод визуализированы здесь может быть полезным вариантом.
В этой статье описаны методы, используемые для эффективного привязки и характеризуют летную активность западных взрослых кукурузных корневого червя, которые были воспитаны при различных личинках плотности. Летные мельницы и программное обеспечение, используемое в этом исследовании(Рисунок 1) были получены из проектов, размещенных в Интернете Джонс и др.18 Привязывая методы были изменены из описания в Stebbing и др.9 Массив 16 летных мельниц был размещены в экологической камере, предназначенной для контроля освещения, влажности и температуры(рисунок 2). Использование этой или аналогичной установки наряду со следующими методами позволяет для тестирования факторов, которые могут повлиять на склонность к полету и производительность западного кукурузного корневого червя, в том числе возраст, пол, температура, фотопериод, и многие другие.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Задний западный корневой червь кукурузы для летных испытаний
ПРИМЕЧАНИЕ: Если возраст взрослого человека должен быть под контролем или известно, взрослые должны быть собраны в поле, а затем воспитание их потомство во взрослую жизнь для тестирования. Если возраст жука или стандартизированной среды воспитания не вызывает беспокойства, то непосредственное тестирование полевых взрослых может быть возможным, и протокол может начаться с шага 2.
- Соберите по крайней мере 500 западных кукурузных корневого червя взрослых из кукурузного поля интерес для обеспечения достаточного количества яиц получены для воспитания достаточного числа взрослых. Используйте ручной аспиратор для сбора взрослых с поля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется собирать взрослых во время пик изобилия, примерно в конце июля в США кукурузный пояс, чтобы обеспечить сбор обоих полов. Большинство взрослых будут мужчины, если собраны ранее, в то время как большинство из них будут женщины, если собраны позже. - Поместите собранные мужчины и женщины взрослых в сетчатой клетке, содержащей нарезанный кукурузный ух, кукурузный лист ткани, 1,5% агар твердых, и оипозиции субстрата. Клетка 18 x 18 x 18 см (размер сетки 44 x 32, 650 мкм диафрагмы) может вместить до 500 взрослых одновременно.
- Используйте кукурузу, выращенную в поле, в качестве источника кукурузного уха, который будет собран на R3, или молочной стадии развития ядра19. Ядро R3 желтое снаружи, в то время как внутренняя жидкость молочно-белая из-за накопления крахмала. Кукурузные уши могут быть заморожены и храниться до года, пока они не понадобятся. Чтобы накормить корневого червя, удалите шелуху и нарежьте кукурузу на горизонтальные поперечные секции толщиной около 3 см. Нарезанная кукуруза является основной диетой для взрослых и должна быть изменена два раза в неделю.
- Получить листья из тепличных кукурузных растений любого возраста. Количество листовых тканей будет варьироваться в зависимости от количества взрослых в клетке. Избегайте использования полевых растений, так как они могут ввести болезни.
- Чтобы сделать твердый агар, смешать 15 г порошка агара с 1 л воды DI. Нагрейте смесь до кипения. Налейте жидкость в посуду Петри (100 мм х 15 мм), пока она горячая. Поместите крышку на чашку Петри один раз прохладно и поместите их в холодное хранение (6 "C). Агар обеспечивает взрослых источником влаги и должен быть изменен два раза в неделю.
- Чтобы приготовить подстрат овиса, поместите 40 г просеянной полевой почвы (Злт;180 мкм) в чашку Петри. Смочите почву деионированной водой. Убедитесь, что почва на дне чашки Петри кажется влажной. Оценка верхней части увлажненной почвы с помощью инструмента иглы. Удалите оивную субстрат еженедельно и поместите в инкубатор при 25 градусах Цельсия и 60% НЧ, по крайней мере, в течение одного месяца.
- После инкубации яиц в течение одного месяца, мыть содержимое оипозиции субстрата через 250-мкм сито, пока вся почва была удалена. Количественно яйца, поместив промытые яйца в 10-мл градуированный цилиндр. Есть около 10000 яиц на 1 мл.
- Поместите количественные яйца в контейнер 44 мл и накройте просеянной полевой почвой (180 мкм). Западные яйца корневого червя кукурузы проходят обязывать диапаузу через зиму20. Чтобы сломать диапаузу, поместите яйца в холодное хранение (6 градусов по Цельсию) в течение по крайней мере 6 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут храниться в холодном хранении более 5 месяцев, но жизнеспособность яйца уменьшается со временем. После 12 месяцев, может быть практически нет люка. - После как минимум 5 месяцев, удалить яйца из холодильной хранения и поместить в инкубатор на 25 "C и 60% RH. Новорожденные вылупляются уже через 16 дней после удаления из холодного хранения.
- После того, как яйца люк, место три проросших ядер на дне 44-мл пластиковый контейнер с корнями подвергаются (т.е., не покрыты ею). Используйте мягкую щетку для переноса 12 новорожденных на поверхность корней.
- Добавьте 4,5 мл воды DI в 40 мл просеянной почвы (ют;600 мкм). Поместите увлажненную почву над проросшими ядрами, которые были заражены новорожденными, и накройте контейнер сеточной тканью, чтобы личинки не убегали.
- В тот же день, когда 44-мл пластиковый контейнер установлен с новорожденными, подготовить 473-мл контейнер с кукурузными ядрами, которые не прорастали. Личинки корневого червя будут переданы в этот большой контейнер позже. Количество ядер определяет желаемую плотность личинок на растение. Добавьте 120 г почвенной смеси, состоящей из 50% просеянной полевой почвы (злт;600 мкм) и 50% почвы, смоченной 20 мл деионированной воды.
- Через 7 дней перенесите все содержимое контейнера 44 мл в контейнер 473 мл. Личинки будут вторыми в звездах на момент передачи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот переход в большой контейнер необходим для снабжения личинок достаточной корневой массой для кормления через ощение. - Обратите внимание на появление взрослых, как правило, около 26 дней после яичного люка. Взрослые являются активными летчиками при появлении и могут избежать 473-мл контейнер при попытке собрать их вручную. Вместо этого используйте вакуум с аспиратором для сбора взрослых.
- Сегрегация взрослых по полу и/или дате, если это необходимо для сравнительного тестирования. Пол западного кукурузного корневого червя можно определить, наблюдая морфологию проторакального basitarsi21. Самцы имеют широкие, квадратно-образные проторакальные basitarsi, в то время как у женщин узкие и конические формы.
- Поместите жука в 45-мл прозрачного полистирола пластиковый флакон и накройте крышкой с 6 маленькими отверстиями (диаметром 1 мм).
- Анестезия жука. Поместите конец трубки, прикрепленной к регулятору бака CO2, над отверстиями в крышке и позвольте нежный поток CO2 войти в трубку примерно в течение 10-15 с, пока взрослый не потеряет контроль над стенкой флакона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обезоженое насекомое будет оставаться обездвижемым около 1 мин. - Поместите обезопатого жука, вентральную сторону вверх, на перевернутое пластиковое дно чашки Петри. Аккуратно поместите неперевернутую крышку чашки Петри над жуком. Убедитесь, что тарси жука прижмет сядр к крышке, позволяя легко наблюдать проторакальный basitarsi под рассекающим микроскопом.
- Если эксперимент требует, чтобы жуки спаривались перед полетом, то используйте самцов по крайней мере 5 дней, чтобы спариваться с вновь возникших самок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пожилых мужчин гарантирует, что они сексуально зрелые при их введении к девственным женщинам. Самки сексуально зрелые после появления взрослых, в то время как мужчины требуют от 5 до 7 дней после появления развития для достижения половой зрелости22,23.
2. Запуск программного обеспечения летного завода до летных испытаний
ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы программы полетной мельницы (.vi расширения файла, которые работают в коммерческой программной платформе, см. Таблица материалов) и детали для их использования предоставляются для скачивания по ссылкам ("режим анализа данных" и "Инструкции по Круговой полетной мельнице", соответственно) в разделе "Полетная мельница и программное обеспечение" на сайте Jones et al.18. Если программы больше не функционируют в новых или будущих версиях программной платформы, или если пользователь хочет добавить новые возможности, процедуры, предоставляемые Jones et al. 18, могут быть изменены пользователем по мере необходимости.
- Откройте программу программного обеспечения летной мельницы(рисунок 3).
- Введите информацию под вкладкой Инициализации.
- Установите время начала и время окончания для желаемой продолжительности летного испытания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все взрослые должны быть привязаны и установлены на летных мельницах на 30 минут до начала времени. Это может занять опытный человек от 30 минут до 45 минут, чтобы привязали и подготовить 16 жуков для летных испытаний (см. раздел 3). - Установите Мин Порог (мин) до 0. Это гарантирует, что любое обнаружение прохождения пролета руки полета будет записано, и по умолчанию рекомендуется Джонс и др. 18.
- Установите порог Макса (мин) до 1. Здесь использовалась 1 мин. Это значение означает, что 1 мин должен проходить между датчиком обнаружения руки полета, чтобы "вызвать" конец полета.
- Введите имя файла.
- Установите Интервал входа в необработанные данные (мин) до 1. Это значение контролирует интервал, с помощью которого будут компилироваться необработанные данные для вывода отчетности. Здесь он установлен на 1 мин. Таким образом, выход революций, например, будет регистрировался в минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фактический интервал времени между электронным сканированием активности датчика очень короткий, но 1-минутный интервал позволяет войти в достаточно тонкой шкале для большинства исследовательских целей, ограничивая количество строк в выходе таблицы разумным числом для изучения на глаз.
- Установите время начала и время окончания для желаемой продолжительности летного испытания.
- Под вкладкой Subject Information заполните столбцов с пометкой ID, диетой, полом, видами и комментариями по желанию.
- Нажмите на кнопку START, расположенную на левой стороне дисплея экрана. Программа начнет сбор исходных данных, как только текущее время будет совпадать с временем начала.
3. Tether западного кукурузного корневого червя к летной мельнице
- Согните 40-мм длиной 28-калиберный стальной провод 90 "в центре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проволока также может быть другого металла, такого как медь или латунь. - Возьмите небольшое количество зубного воска, немного больше, чем булавочной головой, и свернуть его между кончиками пальцев, пока мяч не образуется. Убедитесь, что пальцы чисты, чтобы предотвратить мусор, грязь и масло от включения в воск, потому что это может предотвратить воск от припекания к насекомому.
- Нажмите один конец 40 мм изогнутой проволоки в центре шара воска.
- Анестезия тест взрослого с CO2, как описано выше (см. 1.11.1 и 1.11.2).
- Поместите обезопатого взрослого на плоскую поверхность и поместите его пресную сторону вверх. Если жук не лежит полностью плоским на поверхности, переложить ноги так, что он делает. Важно, чтобы жук лежал как можно более плоским на поверхности, чтобы обеспечить правильное позиционирование провода.
- Кратко (1 с) нагреть зубной воск на проволоке с бутан омрачитель. Если воск нагревается слишком долго, расплавленный воск упадет из провода. Не используйте воск, если он упал с провода, так как он не будет эффективно придерживаться кутикулы насекомых.
- Аккуратно поместите конец стальной проволоки с расплавленным зубным воском на тонусовой поверхности пронотума, указывая при этом на другой конец провода, (т.е. конец без зубного воска), вдоль средней линии живота. Кроме того, укажите конец провода без зубного воска к голове при желании. В этом случае летающий жук будет толкать руку полета вместо того, чтобы тянуть его. Будьте уверены, что расплавленный воск не попадет на элитру или его швы, так как это может помешать или помешать полету.
- Поместите свободный конец провода в отверстие полой металлической трубки руки летной мельницы. Убедитесь, что провод подходит достаточно плотно, чтобы удержать на месте трения. Привязанный жук может быть расположен, чтобы летать по часовой стрелке или против часовой стрелки.
- Сразу же после установки жука, разорвать небольшой кусочек (1 см диа) из более крупной ткани. Предложите кусок ткани привязанный жук висит от летной мельницы для контакта смолы; большинств жуки схватят ткань и держат ее против силы тяжести до тех пор пока они не выпустят ее на начале их первой деятельности полета. Это значительно уменьшит первоначальное поведение полета побега или посадки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Присутствие человека в летно-испытательном зале должно ограничиваться присоединением и удалением взрослых с летных мельниц. Испытательный период обычно не начинается до тех пор, пока не пройдет по крайней мере 30 мин с момента вложения (см. Примечание под 2.2.1), и люди не должны присутствовать в летной комнате в течение этого времени или в течение самого испытательного периода. - Удалите всех взрослых, проверенных на полеты, после завершения летного испытания. Удалите восковой бисер, соединяющий трос с пронотами, аккуратно отслаив провод от пронотума. Воск будет отделяться легко, не повреждая кутикулу, что делает насекомое доступным для дальнейших экспериментов при желании.
4. Сохранить данные, собранные из программы летного завода.
- Программа может быть установлена либо MANUAL или AUTO. Если программа настроена на руководство, пользователь должен закончить программу, нажав кнопку STOP. Если программа установлена на AUTO,то программа прекратит сбор необработанных данных, как только текущее время соответствует времени окончания.
- Нажмите EXIT после окончания летно-испытательного периода.
- Убедитесь, что файл TDMS сохраняется под именем файла, введенным во время инициализации программы (шаг 2.2).
- Нажмите на файл TDMS и сохраните документ в виде электронной таблицы (.xlsx).
5. Извлекать параметры полета из сохраненной таблицы (.xlsx)
ПРИМЕЧАНИЕ: Электронная таблица может быть специально разработана для манипулирования необработанными данными из программного обеспечения летной мельницы. Здесь программа была такой же, как описано Джонсом и др. 18, но дополнительная рутина была добавлена признать и суммировать самый длинный непрерывный полет отдельным насекомым в течение испытательного периода.
- Для каждого человека, занимающегося полетной деятельностью, электронная таблица будет содержать следующую информацию: номер рейса, общие обороты, время начала, время окончания и продолжительность полета за считанные минуты.
- Чтобы рассчитать общее расстояние, пройденное в течение испытательного периода, сумма столбца помечена как "Всего Revs" и умножить его на расстояние, пройденное за революцию. Расстояние за революцию зависит от длины руки полета от центрального стержня к прикрепленному насекомому. Например, если это расстояние составляет 15,9 см, каждая революция эквивалентна одному метру. Общее количество оборотов также можно найти во вкладке "Статистика теста".
- Для расчета общей продолжительности полета в течение испытательного периода сумма столбца с пометкой "Продолжительность полета (мин)".
- Чтобы определить расстояние и продолжительность самого длинного непрерывного полета, перейдите на вкладку «Статистика тестирования» и посмотрите под столбец с пометкой «Самый длинный полет».
- Скорость полета может быть рассчитана путем деления расстояния, пролетенного по продолжительности полета. Для насекомых скорость обычно выражается в м/с или км/ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 4 показаны репрезентативные примеры результатов, ожидаемых после летных испытаний. Данные о полетах были получены в ходе экспериментальных работ, проведенных на кафедре энтомологии Университета штата Айова. Шестидневный, спаренный женский западный корень кукурузы взрослых были привязаны к летных мельниц и помещены в контролируемой экологической камере, установленной в 14:10 L:D, 60% RH, и 25 "C. Жуки были оставлены на летных мельницах в течение 22 часов подряд, начиная с 30 минут до начала имитации рассвета, и их полетная активность была записана(рисунок 4). Рассвет и сумерки были смоделированы запрограммированным, постепенным изменением интенсивности света от полного к полному на рассвете (или наоборот в сумерках) в течение 30-минутного периода. Первая вкладка в полученной таблице обобщает отдельных взрослых, которые были протестированы, используя информацию, введенную с шага 2.3. Последующие вкладки включают данные о полете для каждого человека. Последние две вкладки помечены как «RAW DATA» и «Тест статистика». 'RAW DATA' включает в себя время полетной активности для всех людей. «Тестовая статистика» указывает на самый длинный непрерывный полет для каждого жука, а также резюме продолжительности самого длинного непрерывного полета за считанные минуты, общее время, проведенное в полете в течение испытательного периода в минутах, и общее количество оборотов во время испытательный период. Временные марки для начала и окончания каждого независимого рейса позволяют анализировать периодичность полета.
Для самки жука, привязанного к летной мельнице #2(рисунок 4B),в таблице отображается количество рейсов, общее количество оборотов за полет, время начала и окончания каждого полета, а также продолжительность каждого полета. Эта женщина совершала несколько самостоятельных перелетов, большинство из которых были очень короткими. Однако в полете #5 самка проехала 1258 м (что в данном случае равно количеству оборотов, так как расстояние за революцию составляло 1 м) за 37,8 мин непрерывного полета. Самка жука привязана к летной мельнице #1(рисунок 4C) не участвовала в полете в течение испытательного периода, поэтому отображается пустая таблица.
В качестве примера приводятся результаты простого сравнения летных характеристик между двумя группами самки западного кукурузного корневого червя. Взрослые были собраны в коммерческих кукурузных полей из двух мест в Айове и разрешено овипоза в лаборатории. Яйца были собраны, и потомство, выращенное, как описано в шаге 1 протокола при пост-неонатной плотности (шаг 1,9) из 12 личинок на 36 саженцев. В результате взрослые самки были привязаны и протестированы, как описано в шагах 2 и 3. В таблице 1 показана сводка параметров полета из необработанных данных, извлеченных из программного обеспечения летной мельницы, описанного в шагах 4 и 5. Общие параметры полета относятся к сумме всех полетов человека в течение 22-h испытательного периода, в то время как самые длинные параметры полета относятся к самому длинному непрерывному полету во время испытания.
Рисунок 1. Летные мельницы насекомых, используемые для привязных экспериментов. (A) Целая летная мельница насекомых и (B) рабочая часть летной мельницы. (A) Рабочая часть летной мельницы кружится, (B) (1) 1 м подкожной трубки полета руку, (2, 3) отталкивающие ферритные магниты кольца, (4) цифровой датчик эффекта зал, (5) небольшой никель кольцо магнит, используемый для запуска датчика, и (6) подкожная тонкая настенная трубка ("центральный штифт"), которая отделяет отталкивающие магниты (2,3). Летные мельницы немного изменили от первоначального дизайна Jones et al.18 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Компоненты экологической камеры летного комбината. (A) Внешние функции камеры включают (1) контроллер intellus, (2) панель управления, и (3) основной разрыв питания. (B) Особенности внутренней камеры включают (1) блок охладители (за потолочной панели), (2) светодиодные модули, (3) стеллажи единиц, и (4) увлажнитель общений типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Интерфейс программного обеспечения летного завода. (A) Первая вкладка, помеченная как «Инициализация», требует информации, включая время начала и окончания, а также имя файла. (B) Вторая вкладка, помеченная как "Субъектная информация", не требует ввода какой-либо информации, но используется для дифференциации нескольких лиц, оцениваемых в одном летном тесте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Представитель данных полета от 6-дневный женский западный кукурузный корневой червь жуков. (A) Первая вкладка вывода обобщает информацию о семи человеках полета испытания в определенный день. (B) Полетные данные для женщин на летной мельнице #2 (FM-2), которая совершала несколько самостоятельных полетов в течение 22-часового испытательного периода. (C) самка, помещенная на летную мельницу #1 (ФМЗ1), не участвовала в полете в течение 22-часового испытательного периода, в результате чего у нее была пустая таблица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Расположение | |||
| Эймс | Nashua | ||
| Размер образца1 | 23 | 31 | |
| Общая дальность полета (м) | 387,83 и 146,21 | 949.10 и 267.73 | |
| Общая продолжительность полета (мин) | 14.34 и 5.06 | 37.01 и 10.51 | |
| Общая скорость полета (м/с) | 0,42 и 0,04 | 0,44 и 0,06 | |
| Самая длинная дальность полета (м) | 184.48 и 81.82 | 590,13 и 186,01 | |
| Самая длинная продолжительность полета (мин) | 6,27 и 2,26 | 22.15 - 7,67 | |
| Самая длинная скорость полета (м/с) | 0,46 и 0,04 | 0,44 и 0,03 | |
| 1 Пролетел не менее 1 минуты | |||
Таблица 1. Средняя производительность на летных мельницах самки западного кукурузного корневого червя из двух мест в Айове. Самый длинный полет относится к самому длинному непрерывному (т.е. непрерывному) полету, выполняемому каждым человеком в течение испытательного периода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Характеристика западного поведения полета корневого червя кукурузы имеет важное значение для разработки эффективных планов управления сопротивлением. Поведение этого вредителя изучалось в лаборатории с использованием различных методов, включая актографы, летные туннели и летные мельницы. Летные мельницы, как описано и проиллюстрировано в настоящей статье, позволяют насекомым совершать непрерывные полеты, чтобы исследователи могли количественно определить параметры полета, такие как расстояние, продолжительность, периодичность и скорость отдельных полетов, в течение всего испытательного периода.
Наиболее сложным шагом в протоколе для экспериментов летной мельницы с западными кукурузными корневыми червями, как и для большинства видов насекомых, является правильное применение троса для взрослых (Шаг 3). Это может быть трудной задачей из-за небольшого количества площади поверхности, доступной на пронотуме для крепления провода, а также обильное количество натуральных восков на поверхности кутикулы. Задача усложняется ограниченным временем для применения троса до того, как насекомое начнет шевелиться по мере того, как оно возникает в результате анестезии CO2. Важно, чтобы трос выстраивался правильно и придерживался пронотума жука на протяжении всего периода тестирования. Если трос невыровнен, жук может иметь трудное время участия в полете в то время как на летной мельнице, в результате хитро стьюбделов меньше расстояния, продолжительности и скорости. В течение испытательного периода жук может сбежать, если зубной воск не придерживается проволоки достаточно сильно, чтобы пронотума. Поэтому важно иметь чистые, устойчивые руки, хорошее чувство для разогрева воска до работоспособной температуры, и уверенность при привязывании жуков, все из которых достижимы при адекватной практике.
Необходимо принять решение о том, что представляет собой независимое событие полета, чтобы можно было установить значение Max Threshold (Шаг 2.2.3). Человек может совершать никаких полетов, один рейс или десятки полетов в течение тестового периода, в зависимости от его стоп-энд-гоу деятельности, но и от заданного значения Max Threshold. Значение по умолчанию, о которых сообщает Jones et al.18, составляет 5 с. В этом исследовании западного кукурузного корневого червя, Порог Макса был установлен на 1 мин. Наиболее подходящей настройкой является решение вызова на основе видов насекомых и целей исследователя. Есть компромиссы. Насекомое, которое прекращает летать, но продолжает кружить в течение одной или нескольких революций из-за импульса будет иметь эти революции неправильно считается частью предыдущего полета, когда значение установлено на 1 мин. Если значение установлено на уровне 5 с, большинство дополнительных неполетных оборотов не будут учтены, и запись этого рейса будет правильно прекращена. С другой стороны, иногда насекомое существенно замедляет свой полет, пытаясь контролировать свое направление, приземляться или по другим причинам, а затем возобновляет полет ы на более высокой скорости, даже не прекращая активного полета. Такое поведение на летных мельницах является распространенным явлением и наблюдается в западной кукурузы корневого червя; он часто регистрируется как два отдельных рейса, когда максимальный порог установлен на 5 с, но будет правильно записан как непрерывный рейс, когда порог составляет 1 мин. Под 1-мин порог, однако, полет насекомого, который действительно останавливается летать, то возобновляет полет в течение 1 мин будет неправильно записанкак, как не остановился.
Минимальный порог полета (например, по крайней мере один полет продолжительностью не менее одной минуты) может использоваться для исключения из дальнейшего анализа любых взрослых, которые могли быть повреждены во время обработки или были иным образом в плохом состоянии здоровья. Компромиссом защиты от таких ложных нулей (или ложных очень коротких рейсов) является возможность исключения истинных нулей (или истинных очень коротких полетов), т.е. лиц, которые были здоровы, но не были мотивированы на полеты. Исследователь должен решить, как обрабатывать нули (или очень короткие полеты) на основе целей эксперимента, а также какой тип ошибки является наиболее вероятным и который является наименее желательным, когда дело доходит до интерпретации результатов. Кроме того, общая проблема возникает, когда положение руки полета, поддерживающей неактивного жука, оказывается непосредственно над датчиком или очень близко, где небольшие движения руки, вызванные неполетными движениями насекомого или легкими воздушными течениями в камера может быть ложно записана как революции. Чтобы предотвратить увеличение частоты более короткой продолжительности полета, рекомендуется исключить из анализа все полеты продолжительностью 1 минуту. Этот вид артефактного чтения, если он продолжается в течение более длительного времени, также может привести к бессмысленно высокой скорости (например, 2 м/с) для зарегистрированного "полета"; при обнаружении эти "полетные" данные должны быть удалены для этого лица.
Хотя летная мельница исследования предоставили важные идеи в западной кукурузы rootworm поведение полета, как и с любыми видами Есть осложнения в связи привязанный полет к естественному полету в поле24. Насекомое на летной мельнице приостанавливается, что обеспечивает вертикальную поддержку его веса. Таким образом, энергия, затраченная на обеспечение подъема во время естественного полета, не может быть инвестирована привязанными насекомыми на летных мельницах25. С другой стороны, привязанное насекомое должно обеспечить большую тягу, чем в свободном полете, чтобы преодолеть трение на опоре, дополнительный вес летной руки и аэродинамическое сопротивление от летной руки25,26. Естественный полет западного коровинного червя кукурузы также иногда происходит на высотах над слоем границполета27, где расстояние, пройденное во время полета, может сильно зависеть от скорости ветра, которая намного больше, чем непоправимая скорость полета насекомого 28. Летные мельницы навязывают однонаправленный полет, так что пройденное расстояние может переоценить полное перемещение в поле, где траектория полета может быть извилистым. Обеспечение контакта смолы с небольшим куском ткани после установки насекомого на летной мельнице (шаг 3.9) снижает первоначальный побег, а также полетную активность, связанную с попыткой приземлиться. Однако, как только жук падает ткани во время эксперимента, та же проблема неспособности прекратить полет при посадке возникает. Альтернативные системы актографа были использованы в лабораторных экспериментах полета с привязанным8,9 или untethered 7 западных корневого червя кукурузы. Хотя они облегчают проблему прекращения полета, допуская спонтанный контакт смолы, компромиссом является неспособность измерить расстояние полета или скорость. Несмотря на эти ограничения, летная мельница очень полезна в качестве сравнительного инструмента для изучения того, как различные факторы развития, биотики и абиотические факторы влияют на склонность насекомого к полету, и как влияет само поведение полета. В сочетании с другими доказательствами, такими как, что предусмотрено знак захвата экспериментов29, ловушки данных30, и оценки генного потока31, уникальные идеи, полученные из экспериментов полет мельницы способствовать целостный понимание западного кукурузного корневого червя рассеивания в поле и его последствий на уровне населения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Ассистента выпускника E.Y.Y. была поддержана Национальным научным фондом I/UCRC, Центром технологий управления артроподами под управлением Гранта No. IIP-1338775 и отраслевые партнеры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butane multi-purpose lighter | BIC | UXMPFD2DC | To soften wax when tethering |
| Clear polystyrene plastic vial (45-ml) | Freund Container and Supply | AS112 | To hold beetle while anesthetizing |
| Dehydrated culture media, agar powder | Fisher Scientific | S14153 | To make agar for holding moisture for adults |
| Delrin rod (1" diameter, 3.75" long) | Many suppliers: can use cheapest on the internet. | For post of flight mill | |
| Dental wax | DenTek | 47701000335 | Adheres wire tether to prothorax |
| Ferrite ring magnets (OD: 0.69”, ID: 0.29”, Thickness: 0.118”; 7oz pull) | Magnet Shop | 63B06929118 | Opposing - to generate the float. |
| Hall effect sensor | Optikinc | OHN3120U | Look under magnetic sensors on the left side of the Optekinc website then look for the part number. A link is given for current suppliers. |
| Hypodermic tubing (22 gauge; 0.0358” OD x 0.01975” ID x 0.004” wall) | Small Parts, Inc. | HTX-22T-12 | Used for flight mill arms and main axis rod. |
| Incubator (104.1 x 85.4 x 196.1 cm) | Percival Scientific | I-41VL | |
| LabVIEW Full Development System software, system-design platform | National Instruments (See http://www.ni.com/en-us/shop/labview/select-edition.html) | LabVIEW 2018 (Full Edition) | Provides environment needed to run flight mill files (.vi extensions) available for download from Jones et al.18 at http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill. LabVIEW 2018 Full is compatible with Win/Mac/Linux operating systems. |
| Mesh cage (18 x 18 x 18 cm) | MegaView Science Co. Ltd. | BugDorm-4M1515 | mesh size = 44 x 32, 650 µm aperture |
| Needle tool | BLICK | 34920-1063 | For scoring soil surface for egg laying in laboratory |
| Nickel ring magnets (3/16” OD x 1/16” ID x: 1/16” thick) | K&J Magnetics | R311 | Used to trigger the digital hall effect sensor. |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | S33580A | |
| Plastic container (44-ml) | Dart | 150PC | For initial rearing of young larvae |
| Plastic container (473-ml) | Placon | 22885 | For rearing of older larvae |
| Round brush (size 2) | Simply Simmons | 10472906 | For transferring freshly hatched neonates to surface of roots |
| Sieve (250-µm) | Fisher Scientific | 08-418-05 | To separate eggs from soil |
| Steel wire (28-gauge) | The Hillman Group | 38902350282 | |
| Teflon rod (3/8" diameter, 3/4" length) | United States Plastic Corporation | 47503 | To accept the rotating arm. |
| Vacuum | Gast Manufacturing, Inc. | 1531-107B-G288X | For aspirating adults in laboratory |
| White poly chiffon fabric | Hobby Lobby | 194811 | To prevent escape of larvae from rearing container |
References
- Gillette, C. P. Diabrotica virgifera Lec. as a corn root-worm. Journal of Economic Entomology. 5 (4), 364-366 (1912).
- Rice, M. E. Transgenic rootworm corn: assessing potential agronomic, economic, and environmental benefits. Plant Management Network. , (2004).
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and invasiveness of western corn rootworm: Intensifying research on a worsening pest. Annual Review of Entomology. 54 (1), 303-321 (2009).
- Martinez, J. C., Caprio, M. A. IPM use with the deployment of a nonhigh dose Bt pyramid and mitigation of resistance for western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera). Environmental Entomology. 45 (3), 747-761 (2016).
- Miller, N. J., Sappington, T. W. Role of dispersal in resistance evolution and spread. Current Opinion in Insect Science. 21, 68-74 (2017).
- Spencer, J. L., Hibbard, B. E., Moeser, J., Onstad, D. W. Behaviour and ecology of the western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). Agricultural and Forest Entomology. 11, 9-27 (2009).
- VanWoerkom, G. J., Turpin, F. T., Barret, J. R. Jr Influence of constant and changing temperatures on locomotor activity of adult western corn rootworms (Diabrotica virgifera) in the laboratory. Environmental Entomology. 9 (1), 32-34 (1980).
- Naranjo, S. E. Comparative flight behavior of Diabrotica virgifera virgifera and Diabrotica barberi in the laboratory. Entomologia Experimentalis et Applicata. 55 (1), 79-90 (1990).
- Stebbing, J. A., et al. Flight behavior of methyl-parathion-resistant and -susceptible western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) populations from Nebraska. Journal of Economic Entomology. 98 (4), 1294-1304 (2005).
- Dobson, I. D., Teal, P. E. A. Analysis of long-range reproductive behavior of male Diabrotica virgifera virgifera LeConte and D. barberi Smith and Lawrence to stereoisomers of 8-methyl-2decyl propanoate under laboratory conditions. Journal of Chemical Ecology. 13 (6), 1331-1341 (1987).
- Spencer, J. L., Isard, S. A., Levine, E. Free flight of western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) to corn and soybean plants in a walk-in wind tunnel. Journal of Economic Entomology. 92 (1), 146-155 (1999).
- Coats, S. A., Tollefson, J. J., Mutchmor, J. A. Study of migratory flight in the western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 15 (3), 620-625 (1986).
- Coats, S. A., Mutchmor, J. A., Tollefson, J. J. Regulation of migratory flight by juvenile hormone mimic and inhibitor in the western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae). Annals of the Entomological Society of America. 80 (5), 697-708 (1987).
- Kennedy, J. S., Ainsworth, M., Toms, B. A. Laboratory studies on the spraying of locusts at rest and in flight. Anti-Locust Bull. L. 2, 64 (1948).
- Krogh, A., Weis-Fogh, T. A Roundabout for studying sustained flight of Locusts. Journal of Experimental Biology. 29, 211-219 (1952).
- Attisano, A., Murphy, J. T., Vickers, A., Moore, P. J. A simple flight mill for the study of tethered flight in insects. Journal of Visualized Experiments. (106), e53377 (2015).
- Okada, R., Pham, D. L., Ito, Y., Yamasaki, M., Ikeno, H. Measuring the flight ability of the ambrosia beetle, Platypus quercivorus (Murayama), using a low-cost, small, and easily constructed flight mill. Journal of Visualized Experiments. (138), e57468 (2018).
- Jones, V. P., Naranjo, S. E., Smith, T. J. Insect ecology and behavior: laboratory flight mill studies. , http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill (Accessed 31 August 2018) (2010).
- Abendroth, L. J., Elmore, R. W., Boyer, M. J., Marlay, S. K. Corn Growth and Development. , Iowa State University. Ames, Iowa. PMR 1009 (2011).
- Meinke, L. J., Sappington, T. W., Onstad, D. W., Guillemaud, T., Miller, N. J., Komáromi, J., Levay, N., Furlan, L., Kiss, J., Toth, F. Western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) population dynamics. Agricultural and Forest Entomology. 11, 29-46 (2009).
- Hammack, L., French, B. W. Sexual dimorphism of basitarsi in pest species of Diabrotica and Cerotoma (Coleoptera: Chrysomelidae). Annals of the Entomological Society of America. 100 (1), 59-63 (2007).
- Guss, P. L. The sex pheromone of the western corn rootworm (Diabrotica virgifera). Environmental Entomology. 5 (2), 219-223 (1976).
- Hammack, L. Calling behavior in female western corn rootworm beetles (Coleoptera: Chrysomelidae). Annals of the Entomological Society of America. 88 (4), 562-569 (1995).
- Minter, M., Pearson, A., Lim, K. S., Wilson, K., Chapman, J. W., Jones, C. M. The tethered flight technique as a tool for studying life-history strategies associated with migration in insects. Ecological Entomology. 43, 397-411 (2018).
- Ribak, G., Barkan, S., Soroker, V. The aerodynamics of flight in an insect flight-mill. PLoS One. 12 (11), e0186441 (2017).
- Riley, J. R., Downham, M. C. A., Cooter, R. J. Comparison of the performance of leafhoppers on flight mills with that to be expected in free flight. Entomologia Experimentalis et Applicata. 83, 317-322 (1997).
- Isard, S. A., Spencer, J. L., Mabry, T. R., Levine, E. Influence of atmospheric conditions on high-elevation flight of western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 33 (3), 650-656 (2004).
- Chapman, J. W., Reynolds, D. R., Wilson, K. Long-range seasonal migration in insects: mechanisms, evolutionary drivers and ecological consequences. Ecology Letters. 18, 287-302 (2015).
- Spencer, J. L., Mabry, T. R., Vaughn, T. T. Use of transgenic plants to measure insect herbivore movement. Journal of Economic Entomology. 96 (6), 1738-1749 (2003).
- Isard, S. A., Spencer, J. L., Nasser, M. A., Levine, E. Aerial movement of western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae): diel periodicity of flight activity in soybean fields. Environmental Entomology. 29 (2), 226-234 (2000).
- Kim, K. S., Sappington, T. W. Genetic structuring of western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) populations in the U.S. based on microsatellite loci analysis. Environmental Entomology. 34 (2), 494-503 (2005).
