Summary
Flight Mills är viktiga verktyg för att jämföra hur ålder, kön, parning status, temperatur, eller olika andra faktorer kan påverkaen insektflykt beteende. Här beskriver vi protokoll för att tjudra och mäta flyg benägenheten och prestandan hos Western Corn baggar under olika behandlingar.
Abstract
The Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (Leconte) (Coleoptera: Chrysomelidae), är en ekonomiskt viktig Pest av majs i norra USA. Vissa populationer har utvecklat resistens mot förvaltningsstrategier inklusive transgena majs som producerar insekticid toxiner som härrör från bakterien Bacillus thuringiensis (BT). Kunskap om västra majs baggar spridning är av avgörande betydelse för modeller av resistensutveckling, spridning, och lindring. Flygning beteende av en insekt, särskilt över en lång sträcka, är till sin natur svårt att observera och karakterisera. Flygkvarnar ger ett sätt att direkt testa utvecklingsmässiga och fysiologiska effekter och konsekvenserna av flygningen i laboratoriet som inte kan erhållas i fältstudier. I denna studie användes flygkvarnar för att mäta tidpunkten för flygaktivitet, totalt antal flygningar och avståndet, varaktigheten och hastigheten för flygningar som tagits av kvinnliga rootworms under en 22-h testperiod. Sexton flygkvarnar var inhysta i en miljökammare med programmerbar belysning, temperatur och fuktkontroll. Flygkvarnen som beskrivs är av en typisk design, där en flyg arm är fri att rotera om en central Pivot. Rotation orsakas av flykt av en insekt som tjudras till ena änden av flyg armen, och varje rotation registreras av en sensor med en tidsstämpel. Rådata sammanställs av programvara, som därefter bearbetas för att tillhandahålla sammanfattande statistik för flyg parametrar av intresse. Den svåraste uppgiften för varje flygning kvarn studie är kvarstad på tjuder till insekten med ett lim, och den metod som används måste skräddarsys för varje art. Tillbehöret måste vara tillräckligt starkt för att hålla insekten i en styv orientering och för att förhindra avlossning under förflyttning, samtidigt inte störa naturliga Wing rörelse under flygning. Den bifogade processen kräver fingerfärdighet, finess och snabbhet, vilket gör videofilmer av processen för rootworms av värde.
Introduction
Den västra majs Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera Leconte (Coleoptera: Chrysomelidae), identifierades som en pest av odlad majs i 19091. Idag är det den viktigaste Pest av majs (Zea mays L.) i US Corn Belt, med larv utfodring på majs rötter som orsakar de flesta av avkastningen förlusten i samband med denna Pest. De årliga kostnaderna för hantering och majsproduktion förluster på grund av majs baggar beräknas överstiga $1 000 000 0002. Den västra majs baggar är mycket anpassningsbar, och populationer har utvecklats motståndskraft mot flera förvaltningsstrategier inklusive insekticider, växtföljd, och transgena BT Corn3. Bestämma rumsliga dimensioner över vilka taktik måste tillämpas för att mildra lokal utveckling av resistens, eller ett motstånd hotspot, beror på en bättre förståelse av spridning4. Begränsande åtgärder kommer inte att lyckas om de är begränsade till för små av en rumslig skala runt ett motstånd hotspot, eftersom resistenta vuxna kommer att skingra bortom riskreducerande område5. Förstå flygning beteende västra majs baggar är viktigt att skapa effektiva planer motstånds hantering för denna Pest.
Spridning av flygning spelar en viktig roll i vuxna västra majs baggar livshistoria och ekologi6, och flygningen beteende av denna Pest kan studeras i laboratoriet. Flera metoder kan användas för att mäta flyg beteende i laboratoriet. En actograph, som begränsar flygning i ett vertikalt plan, kan mäta hur länge en insekt är engagerad i flygningen. Actographs har använts för att jämföra flygtid och periodicitet mönster av västra majs baggar män och kvinnor i olika åldrar, kroppsstorlekar, temperaturer, insekticid känslighet, och insekticid exponering7,8, 9. Flight tunnlar, som består av en spårnings kammare och riktade luftflöde, är särskilt användbara för att undersöka insekt flygning beteende när du följer en lukt plym, såsom kandidat feromon komponenter10 eller växt flyktiga11. Flight Mills är kanske den vanligaste metoden för laboratoriestudier av insekt flygning beteende och kan karakterisera flera aspekter av flyg benägenhet och prestanda. Laboratoriet Flight Mills har varit anställd i studier av västra majs baggar att karakterisera benägenhet att göra korta och ihållande flygningar samt hormonell kontroll av ihållande flygning12,13.
Flight Mills ger ett relativt enkelt sätt att studera insekt flygning beteende under laboratorieförhållanden genom att låta forskarna att mäta olika flyg parametrar inklusive periodicitet, hastighet, avstånd, och varaktighet. Många av de flygkvarnar som används idag härrör från rondeller av Kennedy et al.14 och Krogh och Weis-Fogh15. Flygkvarnar kan vara olika i form och storlek, men den grundläggande principen förblir densamma. En insekt är tjudrad och monterad på en radiell horisontell arm som är fri att rotera, med minimal friktion, om en vertikal axel. När insekten flyger framåt, är dess väg begränsad till cirkling i ett horisontellt plan, med tillryggalagd sträcka per rotation dikteras av längden på armen. En sensor används vanligtvis för att detektera varje rotation av armen som orsakas av flyg aktiviteten hos insekten. Rådata inkluderar rotationer per enhets tid och tid på dagen flygning inträffade. Data matas in i en dator för inspelning. Data från flera flygkvarnar registreras ofta parallellt, i huvudsak samtidigt, med banker av 16 och 32 flyg fabriker är vanliga. Rådata bearbetas ytterligare av anpassad programvara för att ge värden för sådana variabler som flyghastighet, totalt antal separata flygningar, sträcka och varaktighet flöt, och så vidare.
Varje insekt arter är olika när det gäller den bästa metoden för tjudra på grund av morfologiska variabler såsom övergripande storlek, storlek och form av målområdet för att fästa tjudra, mjukhet, och flexibilitet av insekten, behov och metod för anesthetization, potential för nedsmutsning vingarna och/eller huvudet med felplacerad eller overflow lim, och många, många fler detaljer. I de fall av visualiserade tjudra av en plataspid bugg16 och en Ambrosia Beetle17, respektive mål områden för tjudra kvarstad är relativt stora och förlåtande av oprecisa adhesiv placering eftersom huvudet och vingarna är något väl åtskilda från bilage platsen. Detta är inte att tona ner svårigheten att tjudra dessa insekter, vilket är krävande för alla arter. Men den västra majs baggar är en särskilt utmanande insekt att tjuder: pronotum är smal och kort, vilket gör mycket exakt fastsättning med en minimal mängd lim (dentalvax i detta fall) som krävs för att förhindra störningar med öppnandet av Elytra för flygning och med huvudet, där kontakt med ögon eller antenner kan påverka beteendet. Samtidigt måste tjuder vara ordentligt fastsatta för att undvika fördrivning av denna starka Flyer. Demonstrationen av tjudra av baggar vuxna är det viktigaste erbjudandet i detta papper. Det bör vara till hjälp för andra som arbetar med denna eller liknande insekter där metoden visualiseras här kan vara ett användbart alternativ.
Denna uppsats beskriver metoder som används för att effektivt tjudra och karakterisera flygningen aktivitet av västra majs baggar vuxna som fötts upp vid olika larv täthet. The Flight Mills och programvara som används i denna studie (figur 1) härrör från mönster publiceras på Internet av Jones et al.18 tjudra tekniker ändrades från beskrivningen i Stebbing et al.9 en matris med 16 flyg fabriker var inrymt i en miljökammare, utformad för att styra belysning, fukt och temperatur (figur 2). Med hjälp av denna eller liknande inställning tillsammans med följande tekniker gör det möjligt att testa faktorer som kan påverka flyg benägenheten och prestandan hos Western Corn Rootworm, inklusive ålder, kön, temperatur, fotoperiod, och många andra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bakre västra majs baggar för flygning tester
Anmärkning: om vuxen ålder måste vara kontrollerad eller känd, måste vuxna först samlas i fältet följt av uppfödning deras avkomma till vuxen ålder för testning. Om åldern på Beetle eller en standardiserad uppfödnings miljö är inte av intresse, då direkt testa fält-insamlade vuxna kan vara möjligt, och protokollet kan börja med steg 2.
- Samla minst 500 västra majs baggar vuxna från ett majsfält av intresse för att säkerställa tillräckligt med ägg erhålls för uppfödning tillräckligt antal vuxna. Använd en manuell rökrörs för att samla vuxna från fältet.
Obs: det rekommenderas att samla vuxna under topp överflöd, runt slutet av juli i US Corn Belt, för att säkerställa insamling av båda könen. De flesta vuxna kommer att vara hanar om de samlats in tidigare, medan de flesta kommer att vara kvinnor om de samlas in senare. - Placera de insamlade manliga och kvinnliga vuxna i en mesh bur som innehåller hackad majs öra, majs bladvävnad, 1,5% agar fast, och ett oviposition substrat. En 18 x 18 x 18 cm bur (maskstorlek 44 x 32, 650 μm bländare) kan hålla upp till 500 vuxna på en gång.
- Använd majs odlas i fältet som en källa till majs öra, som kommer att plockas på R3, eller mjölk skede av kärnutveckling19. R3-kärnan är gul utanför, medan den inre vätskan är mjölkvit på grund av ackumulerande stärkelse. Majs öron kan frysas och lagras i upp till ett år tills de behövs. För att mata Rootworm, ta bort skalet och hacka majs i horisontella tvärsnitt ca 3 cm tjocka. Hackad majs är den primära kosten för de vuxna och bör bytas ut två gånger i veckan.
- Få blad från växthusodlade majs växter i alla åldrar. Mängden bladvävnad kommer att variera med antalet vuxna i buren. Undvik att använda fält växter, eftersom de kan införa sjukdom.
- För att göra den fasta agar, blanda 15 g agar pulver med 1 L DI vatten. Värm blandningen tills kokningen. Häll vätskan i petriskålar (100 mm x 15 mm) medan den är varm. Placera ett lock på petriskål en gång svalna och placera dem i kallt utrymme (6 ° C). Agar ger vuxna en fukt källa och bör bytas ut två gånger i veckan.
- För att förbereda ett ovipositions substrat, placera 40 g siktade fält jord (< 180 μm) till en petriskål. Fukta jorden med avjoniserat vatten. Se till att marken på botten av petriskål verkar våt. Betyg toppen av fuktad jord med en nål verktyg. Ta bort ovipositions substrat varje vecka och placera dem i en inkubator vid 25 ° C och 60% RH i minst en månad.
- Efter inkuberande ägg i en månad, tvätta innehållet i ovipositions substratet genom en sikt på 250 μm tills all jord har avlägsnats. Kvantifiera äggen genom att placera tvättade ägg i en 10 mL graderad cylinder. Det finns cirka 10 000 ägg per 1 mL.
- Placera de kvantifierade äggen i en behållare på 44 mL och täck med sållen jordmån (< 180 μm). Västra havre baggar ägg genomgår obligate inplantering till och med vintern20. För att bryta diapause, placera ägg i kall förvaring (6 ° C) i minst 6 månader.
Anmärkning: ägg kan förvaras i kallt förvar längre än 5 månader, men ägg viabiliteten minskar med tiden. Efter 12 månader kan det finnas liten eller ingen lucka. - Efter minst 5 månader, ta bort ägg från kylan lagring och placera i en inkubator vid 25 ° C och 60% RH. Nyfödda kläcks så tidigt som 16 dagar efter att de avlägsnats från kylförvaring.
- När Äggen kläcks, placera tre grodda kärnor på botten av en 44-mL plastbehållare med rötter exponerade (dvs., inte täckt med jord). Använd en mjuk borst borste för att överföra 12 nyfödda till ytan av rötterna.
- Tillsätt 4,5 mL DI-vatten till 40 mL sållen jord (< 600 μm). Placera den fuktiga marken över de grodda kärnor som har infekterats med nyfödda och täck behållaren med mesh tyg för att förhindra larver från att fly.
- På samma dag som 44-mL plastbehållare inrättas med nyfödda, Förbered en 473-mL behållare med majs kärnor som inte har gror. Baggar-larverna kommer att överföras till den större behållaren senare. Antalet kärnor bestämmer den önskade larv tätheten per planta. Tillsätt 120 g jord blandning bestående av 50% siktade fält jord (< 600 μm) och 50% krukväxtjord fuktad med 20 ml avjoniserat vatten.
- Efter 7 dagar, överför allt innehåll i behållaren 44 mL till behållaren 473 mL. Larverna kommer att vara andra stadier vid tidpunkten för överföringen.
Obs: denna överföring till en större behållare är nödvändig för att förse larver med tillräckligt med rot massa för utfodring genom pupation. - Observera uppkomsten av vuxna typiskt cirka 26 dagar efter ägg kläckas. Vuxna är aktiva flygare vid uppkomst och kan undkomma 473-mL behållaren när man försöker samla dem för hand. Använd istället ett vakuum med en rökrörs för att samla vuxna.
- Segregera vuxna efter kön och/eller datum om det behövs för jämförande testning. Sex av västra majs baggar kan bestämmas genom att observera morfologin av prothoracic basitarsi21. Hanar har breda, fyrkantiga prothoracic basitarsi, medan de av honor är smala och koniska-formade.
- Placera Beetle i en 45-mL klar polystyren plastflaska och täck med ett lock med 6 små (~ 1 mm diameter) hål.
- Anesthetize skalbaggen. Placera änden av ett rör fäst vid en CO2 tank regulator över hålen i locket och låta ett skonsamt flöde av co2 för att komma in i röret för cirka 10 till 15 s tills den vuxna förlorar sitt grepp på väggen i flaskan.
Anmärkning: den sövda insekt kommer att förbli immobiliserade i ca 1 min. - Placera den sövda skalbagge, ventrala Sidan upp, på en inverterad plast petriskål botten. Placera försiktigt det icke-inverterade locket på petriskål över skalbaggen. Se till att tarsi av Beetle tryck mot locket, så lätt observation av prothoracic basitarsi under en dissekera Mikroskop.
- Om experimentet kräver att skalbaggar vara parat före flygning, sedan använda hanar minst 5 dagar gamla för att para sig med den nyligen dök upp honor.
Obs: användning av äldre män säkerställer att de är sexuellt mogna vid deras introduktion till jungfru honor. Honor är sexuellt mogna på vuxen uppkomst, medan män kräver 5 till 7 dagar efter uppkomsten utveckling för att nå sexuell mognad22,23.
2. Starta Flight Mill programvara före flygning testning
Obs: The Flight Mill programfiler (. vi filändelser som körs i en kommersiell mjukvaruplattform, se tabell över material) och Detaljer för deras användning tillhandahålls för nedladdning via länkar ("dataanalys rutin" och "cirkulär Flight Mill instruktioner", respektive) i avsnittet "Flight Mill ledningar and Software" på webbplatsen Jones et al.18 . Om programmen inte längre fungerar i nyare eller framtida versioner av mjukvaruplattformen, eller om användaren vill lägga till nya funktioner, kan de rutiner som tillhandahålls av Jones et al. 18 modifieras av användaren efter behov.
- Öppna programmet Flight Mill (bild 3).
- Ange informationen på fliken initiering .
- Ställ in Start tid och Sluttid för den önskade varaktigheten för flygprovet.
Obs: alla vuxna ska vara bundna och monterade på flyg fräsar med 30 min före start tiden. Det kan ta en erfaren person 30 min till 45 min att tjudra och förbereda 16 skalbaggar för flygning testning (se avsnitt 3). - Ställ in min-tröskel (min) på 0. Detta säkerställer att varje detektering av flyg armen passerar kommer att registreras, och är den standard som rekommenderas av Jones et al. 18.
- Ställ in Max tröskeln (min) på 1. Här användes 1 min. Detta värde innebär att 1 min måste förflyta mellan sensor detektering av flyg armen för att "ringa" i slutet av en flygning.
- Ange ett namn för filen.
- Ange intervall för rå data logg (min) till 1. Det här värdet styr intervallet som rådata ska kompileras för utdata-rapportering. Här är det satt till 1 min. Således kommer utdata från revolutioner, till exempel, att loggas per minut.
Obs: det faktiska tidsintervallet mellan elektronisk skanning av sensor aktivitet är mycket kort, men en 1-min intervall tillåter loggning på en tillräckligt bra skala för de flesta forskningsändamål, samtidigt begränsa antalet rader i kalkylbladsutdata till ett rimligt antal för undersökning vid öga.
- Ställ in Start tid och Sluttid för den önskade varaktigheten för flygprovet.
- Under ämnes information fliken, Fyll i kolumnerna märkt ID, diet, kön, art, och kommentarer som önskas.
- Klicka på Start -knappen som finns på vänster sida av skärmvisningen. Programmet kommer att börja samla rådata när den aktuella tiden matchar Start tiden.
3. Tether västra majs baggar till Flight Mill
- Böj en 40-mm längd 28-gauge ståltråd 90 ° i mitten.
Anmärkning: tråden kan också vara av en annan metall som koppar eller mässing. - Ta en liten mängd dentalvax, något större än en Pinhead, och rulla den mellan fingertopparna tills en boll bildas. Se till att fingrarna är rena för att förhindra att skräp, smuts och olja från att införliva i vaxet, eftersom det kan förhindra att vaxet fastnar på insekten.
- Tryck ena änden av 40 mm den böjda tråden i mitten av bollen av vax.
- Anesthetize testet vuxen med CO2 som beskrivs ovan (se 1.11.1 och 1.11.2).
- Placera sövda vuxna på en plan yta och placera dess rygg sida upp. Om skalbaggen inte ligger helt plant på ytan, flytta benen så att den gör. Det är viktigt att skalbaggen ligga så platt som möjligt på ytan för att säkerställa korrekt positionering av tråden.
- Kort (< 1 s) Värm tand vax på tråden med en butan ljusare. Om vaxet värms för länge, kommer smält vax släppa av tråden. Återanvänd inte vaxet om det har fallit bort från tråden, eftersom det inte kommer att effektivt hålla sig till insekten nagelbanden.
- Placera försiktigt änden av ståltråd med smält dentalvax på dorsala ytan av pronotum, medan du pekar den andra änden av tråden, (dvs, slutet utan dentalvax), längs mittlinjen av buken. Alternativt, peka änden av tråden utan dentalvax mot huvudet om så önskas. I så fall kommer en flygande skalbagge driva flyg armen istället för att dra den. Var noga med att smält vax inte får på Elytra eller dess suturer, eftersom det kan förhindra eller hindra flygning.
- Placera den fria änden av tråden i öppningen av det ihåliga metallröret i Flight Mill arm. Se till att tråden passar tight nog att hålla på plats genom friktion. Den tjudrade skalbaggen kan vara placerad för att flyga antingen medurs eller motsols.
- Omedelbart efter montering av en skalbagge, Riva en liten bit (~ 1 cm dia) av silkespapper från en större vävnad. Erbjuda vävnaden bit till tjudrad Beetle hängande från flygningen kvarnen för böjd kontakt; de flesta skalbaggar kommer att greppa vävnaden och hålla den mot gravitationen tills de släpper den i början av sin första flygning aktivitet. Detta kommer att kraftigt minska första flykt eller landning flygning beteende.
Observera: mänsklig närvaro i flyg provningsrummet bör begränsas till att fästa och ta bort vuxna från flyg fabrikerna. Testperioden börjar vanligtvis inte förrän minst 30 minuter har förflutit sedan tillbehöret (se anmärkning i punkt 2.2.1), och människor bör inte vara närvarande i flygrummet under denna tid eller under själva testperioden. - Ta bort alla flygtestade vuxna efter avslutad flygning kvarn test. Ta bort vax pärla ansluter tjuder till pronotum genom att försiktigt peeling tråden bort från pronotum. Vaxet kommer att separera lätt utan att skada nagelbanden, vilket gör insekten tillgänglig för ytterligare experiment om så önskas.
4. Spara data som samlats in från Flight Mill-programmet.
- Programmet kan vara inställt på antingen manuell eller Auto. Om programmet är inställt på manuell, måste användaren avsluta programmet genom att klicka på knappen Stopp ( Stop ). Om programmet är inställt på Auto, kommer programmet att sluta samla in rådata när den aktuella tiden matchar sluttiden.
- Klicka på Avsluta när flyg testperioden har avslutats.
- Se till att en TDMS-fil sparas under det filnamn som angavs under program initieringen (steg 2,2).
- Klicka på TDMS-filen och spara dokumentet som ett kalkylblad (. xlsx).
5. Hämta flyg parametrar från det sparade kalkylbladet (. xlsx)
Obs: ett kalkylblad kan vara anpassade för att manipulera rådata utdata från Flight Mill programvara. Här, programvaran var densamma som beskrivs av Jones et al. 18, men en extra rutin lades till att erkänna och sammanfatta den längsta oavbruten flygning av en enskild insekt under testperioden.
- För varje individ som ägnar sig åt flygaktivitet kommer kalkylbladet att innehålla följande information: flygnummer, totala varv, starttid, sluttid och flygvaraktighet i minuter.
- För att beräkna den totala sträckan som flugit under testperioden, summera kolumnen "totala varvtal" och multiplicera den med det avstånd som flygs per varv. Avståndet per varv beror på längden på flyg armen från den centrala Pivot till den bifogade insekten. Till exempel, om detta avstånd är 15,9 cm, varje varv motsvarar en meter flöt. Det totala antalet varv kan också hittas på fliken "test statistik".
- Om du vill beräkna den totala varaktigheten som flögs under testperioden, summerar du kolumnen "flygtid (min)".
- Om du vill bestämma avstånd och varaktighet för den längsta avbrottsfria flygningen går du till fliken "test statistik" och tittar under kolumnen "längsta flyg #".
- Flyghastigheten kan beräknas genom att dividera sträckan med flygets varaktighet. För insekter uttrycks hastigheten vanligen i m/s eller km/h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 visar representativa exempel på resultat som förväntas efter flygprovning. Flygdata erhölls från experimentellt arbete som utfördes vid Institutionen för entomologi vid Iowa State University. Sex-dagars gammal, parad hona västra majs baggar vuxna var bundna till flyg fabriker och placeras i en kontrollerad miljökammare inställd på 14:10 l:d, 60% RH, och 25 ° C. Skalbagarna lämnades kvar på flyg fabrikerna under 22 sammanhängande timmar med början 30 min innan den simulerade gryningen inleddes, och deras flygaktivitet registrerades (figur 4). Gryning och skymningen simulerades av en programmerad, gradvis förändring i ljusintensitet från full-off till full-on i gryningen (eller vice versa i skymning) under en 30-minuters period. Den första fliken i det resulterande kalkylbladet sammanfattar de enskilda vuxna som testades med hjälp av information som angavs från steg 2,3. De efterföljande flikarna innehåller flygdata för varje individ. De två sista flikarna är märkta "rå DATA" och "test statistik". "Rå DATA" omfattar tid för flygaktivitet för alla individer. "Test statistik" anger den längsta avbrottsfria flygningen för varje skalbagge och sammanfattningar av varaktigheten för den längsta oavbruten flygningen i minuter, den totala tid som tillbringats under flygningen under test perioden i minuter, och det totala antalet varv under testperiod. Tidsstämplar för början och slutet av varje oberoende flygning tillåter analyser av flygets periodicitet.
För den kvinnliga skalbaggen som är bunden till flyg bruket #2 (figur 4b) visar kalkylbladet antalet flygningar, totala varv per flygning, start-och sluttid för varje flygning och varaktigheten för varje flygning. Denna kvinnliga engagerad i flera oberoende flygningar, varav de flesta var mycket kort. Men under flygning #5 honan reste 1 258 m (vilket motsvarar antalet varv i detta fall, eftersom avståndet per varv var 1 m) under en 37,8-min period av oavbruten flygning. Den kvinnliga skalbagge bundna till Flight Mill #1 (figur 4c) inte delta i flygningen under testperioden, så ett tomt kalkylblad visas.
Som ett exempel, resultat presenteras från en enkel jämförelse av flygning egenskaper mellan två grupper av kvinnliga västra majs Rootworm. Vuxna samlades i kommersiella sädesfält från två platser i Iowa och tillåts oviposit i laboratoriet. Ägg samlades in, och avkomman föds upp enligt beskrivningen i steg 1 i protokollet till en post-neonatdensitet (steg 1,9) av 12 larver per 36 plantor. De resulterande vuxna honorna var uppbundna och testade enligt anvisningarna i steg 2 och 3. Tabell 1 visar en sammanfattning av flyg parametrarna från de rådata som hämtats från Flight Mill-programvaran enligt beskrivningen i steg 4 och 5. Totala flyg parametrar avser summan av alla flygningar för en individ under 22-h-testperioden, medan de längsta flyg parametrarna avser den längsta avbrottsfria flygningen under provningen.
Figur 1. Insekt flyg fräsar som används för tjudrad experiment. A hela insektsflygs fabriken och B arbets delen av flyg bruket. A) den arbetande delen av flyg fabriken är inringad, (B) (1) 1 m Hypodermic Tube Flight arm, (2, 3) repellerande ferritring magneter, (4) Digital Hall Effect sensor, (5) liten nickel ring magnet används för att utlösa sensorn, och (6) Hypodermic tunnväggiga rör ("Central stift") som separerar avvärja magneter (2, 3). Flight Mills modifierad något från den ursprungliga utformningen av Jones et al.18 vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Komponenter i flyg brukets miljökammare. (A) yttre kammare funktioner inkluderar (1) intellus Controller, (2) Kontrollpanelen, och (3) huvudström frånkoppling. (B) interiör kammare funktioner inkluderar (1) enhet kylare (bakom takpanelen), (2) LED-moduler, (3) hyllenheter, och (4) Pan-typ luftfuktare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Ett gränssnitt för Flight Mill programvara. (A) den första fliken, med etiketten "initiering", kräver information inklusive start-och sluttider och filnamnet. (B) den andra fliken, märkt "ämnes information", kräver inte att någon information anges, utan används för att skilja mellan flera individer som utvärderas i ett enda flygprov. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa flygdata från 6-dagars gamla kvinnliga västra majs baggar skalbaggar. (A) den första fliken i produktionen sammanfattar informationen om sju personer som testats av flyg på en viss dag. (B) flyguppgifter för honan på flyg fabriken #2 (FM # 2), som ägnar sig åt flera oberoende flygningar under den 22 timmar långa testperioden. (C) honan som släpps ut på flygverk #1 (FM # 1) deltog inte i flygningen under 22-timmars testperiod, vilket resulterade i ett tomt kalkylblad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Plats | |||
| Ames | Nashua | ||
| Provstorlek1 | 23 | 31 | |
| Totalt flyg avstånd (m) | 387,83 ± 146,21 | 949,10 ± 267,73 | |
| Sammanlagd flygtid (min) | 14,34 ± 5,06 | 37,01 ± 10,51 | |
| Total flyghastighet (m/s) | 0,42 ± 0,04 | 0,44 ± 0,06 | |
| Längsta flyg avstånd (m) | 184,48 ± 81,82 | 590,13 ± 186,01 | |
| Längsta flygtid (min) | 6,27 ± 2,26 | 22,15 ± 7,67 | |
| Längsta flyghastighet (m/s) | 0,46 ± 0,04 | 0,44 ± 0,03 | |
| 1 flög minst 1 minut | |||
Tabell 1. Genomsnittlig (± se) prestanda på flygkvarnar för kvinnlig Western Corn baggar från två platser i Iowa. Längsta flygning avser den längsta oavbruten (dvs kontinuerlig) flygning som utförs av varje individ under testperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakterisera Western Corn baggar flygning beteende är viktigt för att utforma effektiva planer motstånds hantering. Flykt beteende av denna Pest har studerats i laboratoriet med hjälp av olika metoder, inklusive actographs, flyg tunnlar, och flyg fabriker. Flight Mills, som beskrivs och illustreras i detta dokument, tillåter insekter att göra oavbruten flygningar så att forskarna kan kvantifiera flyg parametrar såsom avstånd, varaktighet, periodicitet och hastighet för enskilda flygningar, under en hel testperiod.
Den mest utmanande steg i protokollet för flygning kvarn experimenterande med västra majs Rootworm, som det är för de flesta insektsarter, är korrekt tillämpar en tjuder till den vuxna (steg 3). Detta kan vara en svår uppgift på grund av den lilla mängd yta som finns på pronotum för fastsättning av tråden, liksom den rikliga mängden naturliga vaxer på nagelbanden ytan. Uppgiften görs svårare av den begränsade tid som finns att tillämpa tjuder innan insekten börjar röra som det framgår av CO2 anestetization. Det är viktigt att tjudra är uppradade korrekt och följer skalbaggen pronotum under hela testperioden. Om tjuder är feljusterade, kan Beetle ha en svår tid att engagera sig i flygningen medan på flygningen kvarn, vilket resulterar i artifaktuellt lägre avstånd, varaktighet och hastighet. Skalbaggen kan fly under testperioden om tand vax inte fäster tråden starkt nog att pronotum. Därför är det viktigt att ha rena, stadig händer, en bra känsla för uppvärmningen vaxet till en fungerande temperatur, och förtroende medan tjudra skalbaggar, som alla är uppnåeliga med adekvat praxis.
Ett beslut måste fattas om vad som utgör en oberoende flyg händelse så att max tröskelvärdet kan ställas in (steg 2.2.3). En individ kan inte göra några flygningar, en flygning eller dussintals flygningar under en testperiod, beroende på dess Stop-and-Go-aktivitet, men också på det tilldelade Max tröskelvärdet. Standardvärdet som rapporteras av Jones et al.18 är 5 s. I denna studie av västra majs Rootworm, Max tröskeln var inställd på 1 min. Den lämpligaste inställningen är en dom som bygger på insekts arten och målen för forskaren. Det finns kompromisser. En insekt som slutar flyga men fortsätter att cirkla för en eller flera varv på grund av momentum kommer att ha dessa revolutioner felaktigt räknas som en del av den tidigare flygningen när värdet är inställt på 1 min. Om värdet är inställt på 5 s kommer de flesta av de extra icke-flygning revolutionerna inte räknas och loggning av flygningen kommer att avslutas korrekt. Å andra sidan, ibland en insekt saktar sin flygning avsevärt i ett försök att kontrollera dess riktning, att landa, eller av andra skäl, sedan återupptas flyga med högre hastighet utan att någonsin ha slutat aktiv flygning. Sådant beteende på flyg fabriker är vanligt och har observerats i västra majs Rootworm; Det skulle ofta loggas som två separata flygningar när det maximala tröskelvärdet är inställt på 5 s, men skulle registreras korrekt som en oavbruten flygning när tröskeln är 1 min. Under 1 min tröskel, men flygningen av en insekt som verkligen slutar flyga sedan återupptar flygningen inom 1 min skulle vara felaktigt registreras som inte har slutat.
En minimiflygtröskel (t. ex. minst en flygning på minst en minut) får användas för att utesluta alla vuxna som kan ha skadats under hanteringen eller på annat sätt varit i dålig hälsa, från ytterligare analyser. Den trade-off att skydda mot sådana falska nollor (eller falskt mycket korta flygningar) är möjligheten att utesluta True-nollor (eller sant mycket korta flygningar), dvs individer som var friska men inte motiverade att flyga. Forskaren måste bestämma hur man ska hantera nollor (eller mycket korta flygningar) baserat på experimentets mål, liksom vilken typ av fel som är mest sannolik och som är minst önskvärt när det gäller att tolka resultaten. Dessutom uppstår ett vanligt problem när positionen för flyg armen som stöder en inaktiv skalbagge råkar vara direkt över, eller mycket nära, sensorn, där små rörelser av armen som orsakas av icke-flygning rörelser av insekten eller små luft strömmar i kan felaktigt registreras som revolutioner. För att förhindra att denna metod artefakt blåsa upp frekvensen av kortare flygtider, rekommenderas att utesluta alla flygningar som varar ≤ 1 min från analyser. Denna typ av artifakto läsning, om det pågår under en längre tid, kan också resultera i en felfritt hög hastighet (t. ex., > 2 m/s) för en inspelad "flygning"; När de upptäcks ska dessa "Flight"-data raderas för den individen.
Även om Flight Mill studier har gett viktiga insikter i västra majs baggar flygning beteende, som med alla arter finns komplikationer i samband uppbundna flygning till naturliga flygning i fält24. En insekt på en flygkvarn är upphängd, vilket ger vertikalt stöd för sin vikt. Således kan den energi som förbrukas för att ge hiss under Natural Flight inte investeras av tjudrad insekter på Flight Mills25. Å andra sidan, en tjudrad insekt måste ge mer dragkraft än i fri flygning för att övervinna friktion vid vriden, den extra vikten av flygningen armen, och aerodynamiska dra från Flight arm25,26. Natural Flight of Western Corn baggar förekommer också ibland på höjder över dess flygning gränsskikt27, där avståndet täcks under flygning kan vara starkt påverkad av vindhastigheter som är mycket större än insekternas utan hjälp flyghastighet 28. flygkvarnar inför enkelriktad flygning, så att den sträcka som flygs kan överskatta den totala förskjutningen på det område där flygbanan kan vara slingrande. Ge böjd kontakt med en liten bit vävnad efter montering av insekten på flygningen kvarn (steg 3,9) minskar första flykt flygning samt flygverksamhet i samband med ett försök att landa. Men när Beetle droppar vävnaden under ett experiment, samma problem med oförmåga att avsluta flygning genom landning påträffas. Alternativa actograph system har använts i laboratoriet flyg experiment med tjudrad8,9 eller untethered7 Western Corn Rootworm. Medan de lindra problemet med flygning uppsägning genom att tillåta spontan böjd kontakt, är avvägningen oförmågan att mäta flyg avstånd eller hastighet. Trots dessa begränsningar, flygningen kvarnen är mycket användbart som ett jämförande verktyg för att undersöka hur en mängd olika utvecklingsmässiga, biotiska och abiotiska faktorer påverkar en insekt benägenhet att engagera sig i flygningen, och hur flygningen beteende själv påverkas. I kombination med andra bevis, såsom det som tillhandahålls av mark-Capture experiment29, trap data30, och uppskattningar av gen flöde31, de unika insikter som erhållits från Flight Mill experiment bidra till en holistisk förståelse av västra majs baggar spridning på fältet och dess populationsnivå konsekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
E.Y.Y. ' s Graduate assistentstöd stöddes av National Science Foundation I/UCRC, centrum för arthropod Management Technologies, under Grant nr. IIP-1338775 och branschpartners.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butane multi-purpose lighter | BIC | UXMPFD2DC | To soften wax when tethering |
| Clear polystyrene plastic vial (45-ml) | Freund Container and Supply | AS112 | To hold beetle while anesthetizing |
| Dehydrated culture media, agar powder | Fisher Scientific | S14153 | To make agar for holding moisture for adults |
| Delrin rod (1" diameter, 3.75" long) | Many suppliers: can use cheapest on the internet. | For post of flight mill | |
| Dental wax | DenTek | 47701000335 | Adheres wire tether to prothorax |
| Ferrite ring magnets (OD: 0.69”, ID: 0.29”, Thickness: 0.118”; 7oz pull) | Magnet Shop | 63B06929118 | Opposing - to generate the float. |
| Hall effect sensor | Optikinc | OHN3120U | Look under magnetic sensors on the left side of the Optekinc website then look for the part number. A link is given for current suppliers. |
| Hypodermic tubing (22 gauge; 0.0358” OD x 0.01975” ID x 0.004” wall) | Small Parts, Inc. | HTX-22T-12 | Used for flight mill arms and main axis rod. |
| Incubator (104.1 x 85.4 x 196.1 cm) | Percival Scientific | I-41VL | |
| LabVIEW Full Development System software, system-design platform | National Instruments (See http://www.ni.com/en-us/shop/labview/select-edition.html) | LabVIEW 2018 (Full Edition) | Provides environment needed to run flight mill files (.vi extensions) available for download from Jones et al.18 at http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill. LabVIEW 2018 Full is compatible with Win/Mac/Linux operating systems. |
| Mesh cage (18 x 18 x 18 cm) | MegaView Science Co. Ltd. | BugDorm-4M1515 | mesh size = 44 x 32, 650 µm aperture |
| Needle tool | BLICK | 34920-1063 | For scoring soil surface for egg laying in laboratory |
| Nickel ring magnets (3/16” OD x 1/16” ID x: 1/16” thick) | K&J Magnetics | R311 | Used to trigger the digital hall effect sensor. |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | S33580A | |
| Plastic container (44-ml) | Dart | 150PC | For initial rearing of young larvae |
| Plastic container (473-ml) | Placon | 22885 | For rearing of older larvae |
| Round brush (size 2) | Simply Simmons | 10472906 | For transferring freshly hatched neonates to surface of roots |
| Sieve (250-µm) | Fisher Scientific | 08-418-05 | To separate eggs from soil |
| Steel wire (28-gauge) | The Hillman Group | 38902350282 | |
| Teflon rod (3/8" diameter, 3/4" length) | United States Plastic Corporation | 47503 | To accept the rotating arm. |
| Vacuum | Gast Manufacturing, Inc. | 1531-107B-G288X | For aspirating adults in laboratory |
| White poly chiffon fabric | Hobby Lobby | 194811 | To prevent escape of larvae from rearing container |
References
- Gillette, C. P. Diabrotica virgifera Lec. as a corn root-worm. Journal of Economic Entomology. 5 (4), 364-366 (1912).
- Rice, M. E. Transgenic rootworm corn: assessing potential agronomic, economic, and environmental benefits. Plant Management Network. , (2004).
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and invasiveness of western corn rootworm: Intensifying research on a worsening pest. Annual Review of Entomology. 54 (1), 303-321 (2009).
- Martinez, J. C., Caprio, M. A. IPM use with the deployment of a nonhigh dose Bt pyramid and mitigation of resistance for western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera). Environmental Entomology. 45 (3), 747-761 (2016).
- Miller, N. J., Sappington, T. W. Role of dispersal in resistance evolution and spread. Current Opinion in Insect Science. 21, 68-74 (2017).
- Spencer, J. L., Hibbard, B. E., Moeser, J., Onstad, D. W. Behaviour and ecology of the western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). Agricultural and Forest Entomology. 11, 9-27 (2009).
- VanWoerkom, G. J., Turpin, F. T., Barret, J. R. Jr Influence of constant and changing temperatures on locomotor activity of adult western corn rootworms (Diabrotica virgifera) in the laboratory. Environmental Entomology. 9 (1), 32-34 (1980).
- Naranjo, S. E. Comparative flight behavior of Diabrotica virgifera virgifera and Diabrotica barberi in the laboratory. Entomologia Experimentalis et Applicata. 55 (1), 79-90 (1990).
- Stebbing, J. A., et al. Flight behavior of methyl-parathion-resistant and -susceptible western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) populations from Nebraska. Journal of Economic Entomology. 98 (4), 1294-1304 (2005).
- Dobson, I. D., Teal, P. E. A. Analysis of long-range reproductive behavior of male Diabrotica virgifera virgifera LeConte and D. barberi Smith and Lawrence to stereoisomers of 8-methyl-2decyl propanoate under laboratory conditions. Journal of Chemical Ecology. 13 (6), 1331-1341 (1987).
- Spencer, J. L., Isard, S. A., Levine, E. Free flight of western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) to corn and soybean plants in a walk-in wind tunnel. Journal of Economic Entomology. 92 (1), 146-155 (1999).
- Coats, S. A., Tollefson, J. J., Mutchmor, J. A. Study of migratory flight in the western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 15 (3), 620-625 (1986).
- Coats, S. A., Mutchmor, J. A., Tollefson, J. J. Regulation of migratory flight by juvenile hormone mimic and inhibitor in the western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae). Annals of the Entomological Society of America. 80 (5), 697-708 (1987).
- Kennedy, J. S., Ainsworth, M., Toms, B. A. Laboratory studies on the spraying of locusts at rest and in flight. Anti-Locust Bull. L. 2, 64 (1948).
- Krogh, A., Weis-Fogh, T. A Roundabout for studying sustained flight of Locusts. Journal of Experimental Biology. 29, 211-219 (1952).
- Attisano, A., Murphy, J. T., Vickers, A., Moore, P. J. A simple flight mill for the study of tethered flight in insects. Journal of Visualized Experiments. (106), e53377 (2015).
- Okada, R., Pham, D. L., Ito, Y., Yamasaki, M., Ikeno, H. Measuring the flight ability of the ambrosia beetle, Platypus quercivorus (Murayama), using a low-cost, small, and easily constructed flight mill. Journal of Visualized Experiments. (138), e57468 (2018).
- Jones, V. P., Naranjo, S. E., Smith, T. J. Insect ecology and behavior: laboratory flight mill studies. , http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill (Accessed 31 August 2018) (2010).
- Abendroth, L. J., Elmore, R. W., Boyer, M. J., Marlay, S. K. Corn Growth and Development. , Iowa State University. Ames, Iowa. PMR 1009 (2011).
- Meinke, L. J., Sappington, T. W., Onstad, D. W., Guillemaud, T., Miller, N. J., Komáromi, J., Levay, N., Furlan, L., Kiss, J., Toth, F. Western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) population dynamics. Agricultural and Forest Entomology. 11, 29-46 (2009).
- Hammack, L., French, B. W. Sexual dimorphism of basitarsi in pest species of Diabrotica and Cerotoma (Coleoptera: Chrysomelidae). Annals of the Entomological Society of America. 100 (1), 59-63 (2007).
- Guss, P. L. The sex pheromone of the western corn rootworm (Diabrotica virgifera). Environmental Entomology. 5 (2), 219-223 (1976).
- Hammack, L. Calling behavior in female western corn rootworm beetles (Coleoptera: Chrysomelidae). Annals of the Entomological Society of America. 88 (4), 562-569 (1995).
- Minter, M., Pearson, A., Lim, K. S., Wilson, K., Chapman, J. W., Jones, C. M. The tethered flight technique as a tool for studying life-history strategies associated with migration in insects. Ecological Entomology. 43, 397-411 (2018).
- Ribak, G., Barkan, S., Soroker, V. The aerodynamics of flight in an insect flight-mill. PLoS One. 12 (11), e0186441 (2017).
- Riley, J. R., Downham, M. C. A., Cooter, R. J. Comparison of the performance of leafhoppers on flight mills with that to be expected in free flight. Entomologia Experimentalis et Applicata. 83, 317-322 (1997).
- Isard, S. A., Spencer, J. L., Mabry, T. R., Levine, E. Influence of atmospheric conditions on high-elevation flight of western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 33 (3), 650-656 (2004).
- Chapman, J. W., Reynolds, D. R., Wilson, K. Long-range seasonal migration in insects: mechanisms, evolutionary drivers and ecological consequences. Ecology Letters. 18, 287-302 (2015).
- Spencer, J. L., Mabry, T. R., Vaughn, T. T. Use of transgenic plants to measure insect herbivore movement. Journal of Economic Entomology. 96 (6), 1738-1749 (2003).
- Isard, S. A., Spencer, J. L., Nasser, M. A., Levine, E. Aerial movement of western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae): diel periodicity of flight activity in soybean fields. Environmental Entomology. 29 (2), 226-234 (2000).
- Kim, K. S., Sappington, T. W. Genetic structuring of western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) populations in the U.S. based on microsatellite loci analysis. Environmental Entomology. 34 (2), 494-503 (2005).
