Brug af Flight Mills til at måle flyve tilbøjelighed og ydeevne af Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (Leconte)

Summary

Flight Mills er vigtige værktøjer til at sammenligne, hvordan alder, køn, parring status, temperatur, eller forskellige andre faktorer kan påvirke et insekt's flyvning adfærd. Her beskriver vi protokoller til at tøjle og måle flyvningen tilbøjelighed og ydeevne af vestlige majs rodorm under forskellige behandlinger.

Abstract

Den vestlige majs rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (Leconte) (Coleoptera: Chrysomelidae), er en økonomisk vigtig skadegører af majs i det nordlige USA. Nogle populationer har udviklet resistens over for ledelsesstrategier, herunder transgene majs, der producerer insektdræbende toksiner afledt af bakterien Bacillus thuringiensis (BT). Viden om vestlige majs rodorm spredning er af afgørende betydning for modeller af resistens Evolution, spredning, og afbødning. Flyvning opførsel af et insekt, især over en langdistance, er i sagens natur vanskeligt at observere og karakterisere. Flight Mills giver et middel til direkte at teste udviklingsmæssige og fysiologiske virkninger og konsekvenser af flyvning i laboratoriet, der ikke kan opnås i feltundersøgelser. I denne undersøgelse blev Flight Mills brugt til at måle timingen af flyveaktivitet, det samlede antal flyvninger, og afstanden, varigheden og hastigheden af flyvninger taget af kvindelige rodorme i en 22-h testperiode. Seksten flyve Møller blev anbragt i et miljøkammer med programmerbar belysning, temperatur og Fugtighedskontrol. Den beskrevne Flight Mill er af et typisk design, hvor en flyarm er fri til at rotere om en central drejning. Rotation er forårsaget af flugt af et insekt bundet til den ene ende af flyve armen, og hver rotation registreres af en sensor med et tidsstempel. Rå data er kompileret af software, som efterfølgende behandles for at give summariske statistikker for flyve parametre af interesse. Den sværeste opgave for enhver flyvning Mill undersøgelse er fastgørelse af tether til insektet med et klæbemiddel, og den anvendte metode skal skræddersys til hver art. Den vedhæftede fil skal være stærk nok til at holde insektet i en stiv retning og forhindre løsrivelse under bevægelse, mens det ikke forstyrrer den naturlige vinge bevægelse under flyvningen. Vedhæftnings processen kræver fingerfærdighed, finesse og hastighed, hvilket gør videooptagelser af processen for rootworms af værdi.

Introduction

Den vestlige majs-rootworm, Diabrotica virgifera virgifera Leconte (Coleoptera: Chrysomelidae), blev identificeret som en skadegører af dyrket majs i 1909¹. I dag er det den vigtigste skadedyr af majs (Zea mays L.) i den amerikanske majs bælte, med larve fodring på majs rødder forårsager det meste af udbyttet tab forbundet med denne pest. De årlige omkostninger til forvaltning og majs produktion tab som følge af majs rodorm anslås at overstige $1.000.000.000². Den vestlige majs rodorm er meget tilpasningsdygtig, og populationer har udviklet resistens over for flere ledelsesstrategier, herunder insekticider, sædskifte, og transgene BT Corn³. Fastlæggelse af rumlige dimensioner over hvilken taktik skal anvendes for at afbøde lokal udvikling af resistens, eller en modstand hotspot, afhænger af en bedre forståelse af spredning⁴. Afbødende foranstaltninger vil ikke blive en succes, hvis de er begrænset til for lille af en rumlig skala omkring en modstand hotspot, fordi resistente voksne vil sprede ud over afbødning område⁵. Forståelse flyvning opførsel af vestlige majs rodorm er vigtigt at skabe effektive resistens Management planer for denne skadedyr.

Dispersal ved flyvning spiller en vigtig rolle i voksne vestlige majs rodorm livshistorie og økologi⁶, og flyvningen opførsel af denne skadedyr kan undersøgt i laboratoriet. Flere metoder kan anvendes til at måle flyve adfærd i laboratoriet. En actograph, som begrænser flyvning i et lodret plan, kan måle mængden af tid, et insekt er involveret i flyvning. Actographs er blevet brugt til at sammenligne flyve varigheden og periodicerne af vestlige majs-rodorm-hanner og-hunner i forskellige aldre, kropsstørrelser, temperaturer, insektfølsomhed og insekt bekæmpelseseksponering^{7,8, 9}. Flight tunneler, som består af et sporings kammer og styret luftstrøm, er især nyttige til at undersøge insekt flyvning adfærd, når efter en lugt Plume, såsom kandidat feromone komponenter¹⁰ eller plante flygtige¹¹. Flight Mills er måske den mest almindeligt metode til laboratorieundersøgelser af insekt flyvning adfærd og kan karakterisere flere aspekter af flyvning tilbøjelighed og ydeevne. Laboratorie flyvning Møller har været ansat i undersøgelser af Western Corn rodorm at karakterisere tilbøjelighed til at foretage korte og vedvarende flyvninger samt hormonelle kontrol af vedvarende flyvning^12,13.

Flight Mills giver en forholdsvis enkel måde at studere insekt flyvning adfærd under laboratorieforhold ved at lade forskerne til at måle forskellige flyvning parametre, herunder periodiciteter, hastighed, distance, og varighed. Mange af de Flight Mills, der anvendes i dag, stammer fra rundkørsler af Kennedy et al.¹⁴ og Krogh og Weis-Fogh¹⁵. Flight Mills kan være forskellige i form og størrelse, men det grundlæggende princip forbliver den samme. Et insekt er bundet og monteret på en radial horisontal arm, der er fri til at rotere, med minimal friktion, om en lodret aksel. Da insektet flyver fremad, er dets vej begrænset til cirklerne i et vandret plan, med den tilbagelagte distance pr. omdrejning dikteret af længden af armen. En sensor bruges typisk til at detektere hver rotation af armen, der forårsages af insektets flyveaktivitet. Rå data omfatter rotationer pr. enheds tid, og tidspunktet på dagen flyvning fandt sted. Dataene føres ind i en computer til optagelse. Data fra flere Flight Mills registreres ofte parallelt, i det væsentlige samtidig, med banker på 16 og 32 Flight Mills er fælles. De rå data behandles yderligere af brugerdefineret software til at levere værdier for sådanne variabler som flyhastighed, samlede antal separate flyvninger, distance og varighed flyves, og så videre.

Hver insektarter er anderledes, når det kommer til den bedste metode til tøjring på grund af morfologiske variabler såsom samlede størrelse, størrelse og form af målområdet for fastgørelse af tether, blødhed, og fleksibilitet af insektet, behov og metode til bedøvelse, potentiale for tilsmudsning vinger og/eller hoved med malplacerede eller overløb klæbemiddel, og mange, mange flere detaljer. I tilfælde af visualiseret tøjring af en plataspid bug¹⁶ og en Ambrosia Beetle¹⁷, er de respektive målområder for tether fastgørelse relativt store og tilgivende af upræcis klæbemiddel placering, fordi hovedet og vingerne er noget godt adskilt fra vedhæftnings stedet. Dette er ikke at bagateller vanskeligheden ved at tøjler disse insekter, som er krævende for enhver art. Men den vestlige majs rodorm er et særligt udfordrende insekt at tøjle: Rygsiden er smal og kort, hvilket gør meget præcis fastgørelse med en minimal mængde klæbemiddel (dentalvoks i dette tilfælde) nødvendig for at forhindre interferens med åbningen af elytra til flyvning og med hovedet, hvor kontakt med øjne eller antenner kan påvirke opførsel. På samme tid, skal tøjle være solidt fastgjort for at undgå afbetaling af denne stærke flyer. Demonstrationen af tethering af rodorm voksne er det vigtigste tilbud i dette papir. Det bør være til hjælp for andre, der arbejder med denne eller lignende insekter, hvor den metode visualiseret her kunne være en nyttig mulighed.

Dette papir beskriver metoder, der anvendes til effektivt at tøjle og karakterisere flyvningen aktivitet af vestlige majs rodorm voksne, der blev opdrættet på forskellige larve tætheer. De fly Møller og software, der anvendes i denne undersøgelse (figur 1) blev afledt af designs lagt ud på internettet af Jones et al.¹⁸ tethering teknikker blev ændret fra beskrivelsen i Stebbing et al.⁹ en række 16 fly Møller var anbragt i et miljøkammer, designet til at styre belysning, fugtighed og temperatur (figur 2). Ved hjælp af denne eller lignende setup sammen med følgende teknikker giver mulighed for test faktorer, der kan påvirke flyvningen tilbøjelighed og ydeevne af vestlige majs rootworm, herunder alder, køn, temperatur, fotoperiode, og mange andre.

Protocol

1. bageste vestlige majs rodorm til Flight tests

Bemærk: Hvis voksnes alder skal kontrolleres eller kendes, skal voksne først indsamles i marken efterfulgt af opdræt af deres afkom til voksenalderen til testning. Hvis en alder af Beetle eller et standardiseret opdræt miljø er ikke til bekymring, så direkte test felt-indsamlede voksne kan være muligt, og protokollen kan begynde med trin 2.

1. Saml mindst 500 Western Corn rodorm voksne fra et majs felt af interesse for at sikre nok æg er fremstillet til opdræt tilstrækkeligt antal voksne. Brug en manuel indsugnings til at indsamle voksne fra marken.
   Bemærk: det anbefales at indsamle voksne under peak overflod, omkring slutningen af juli i USA Corn Belt, for at sikre indsamlingen af begge køn. De fleste voksne vil være hanner, hvis indsamlet tidligere, mens de fleste vil være kvinder, hvis indsamlet senere.
2. Placer de indsamlede mandlige og kvindelige voksne i et mesh bur, der indeholder hakket majs øre, majs blad væv, 1,5% agar solid, og en ovipositions substrat. Et 18 x 18 x 18 cm bur (maskestørrelse 44 x 32, 650 μm blænde) kan holde op til 500 voksne på én gang.
   1. Brug majs dyrket i marken som en kilde til majs øre, som vil blive plukket på R3, eller mælk fase af kernel Development¹⁹. R3-kernen er gul udenfor, mens den indre væske er mælkeagtig hvid på grund af akkumulerende stivelse. Majs ører kan fryses og opbevares i op til et år, indtil de er nødvendige. For at fodre rootworm, Fjern skallerne og hak kornet i horisontale tværsnit omkring 3 cm tyk. Hakket majs er den primære kost for de voksne og bør ændres to gange om ugen.
   2. Få blade fra drivhus-dyrkede majsplanter i alle aldre. Mængden af blad vævet vil variere med antallet af voksne i buret. Undgå at bruge Mark planter, da de kan indføre sygdom.
   3. For at gøre den solide agar blandes 15 g agar pulver med 1 liter DI vand. Blandingen opvarmes til kogning. Hæld væsken i Petri skåle (100 mm x 15 mm), mens den er varm. Anbring et låg på Petri skålen, når det er køligt, og Placer dem i kold opbevaring (6 ° C). Agar giver voksne en kilde til fugt og bør skiftes ud to gange om ugen.
   4. For at tilberede et ovipositions substrat skal du placere 40 g sigtet jordbund (< 180 μm) i en Petri skål. Fugt jorden med deioniseret vand. Sørg for, at jorden i bunden af Petri skålen virker våd. Score toppen af den fugtet jord med en nål værktøj. Fjern ovipositions substrat ugentligt og Placer det i en inkubator ved 25 ° C og 60% RH i mindst en måned.
3. Efter inkubeering af æg i en måned vaskes indholdet af oviposissubstrat gennem en 250-μm-sigte, indtil al jord er fjernet. Kvantificere æggene ved at anbringe vaskede æg i en 10 mL måle cylinder. Der er ca. 10.000 æg pr. 1 mL.
4. De kvantificerede æg placeres i en 44 mL-beholder og dækkes med sigte felt jord (< 180 μm). Vestlige majs rodorm æg gennemgår forpligte drægtighed gennem vinteren²⁰. For at bryde diapause, Placer æg i kold opbevaring (6 ° C) i mindst 6 måneder.
   Bemærk: æg kan opbevares i kold opbevaring i mere end 5 måneder, men æglevedygtig heden aftager med tiden. Efter 12 måneder, kan der være lidt at ingen luge.
5. Efter mindst 5 måneder fjernes æggene fra det kolde lager og placeres i en inkubator ved 25 ° C og 60% RH. Nyfødte klækkes så tidligt som 16 dage efter fjernelse fra kold opbevaring.
6. Når æggene klækkes, placeres tre spilede kerner i bunden af en 44-mL plastikbeholder med rødder eksponeret (dvs. ikke dækket med jord). Brug en blød børste til at overføre 12 nyfødte til overfladen af rødderne.
7. Tilsæt 4,5 mL DI vand til 40 mL sigtet jord (< 600 μm). Placer den fugtet jord over de spilede kerner, der er blevet inficeret med nyfødte, og dæk beholderen med mesh-stof for at forhindre larverne i at undslippe.
8. Samme dag, som 44-mL plastikbeholderen er sat op med nyfødte, skal du tilberede en 473 mL beholder med majskerner, der ikke er spiret. Den rodorm larver vil blive overført til denne større container senere. Antallet af kerner bestemmer den ønskede larve Tæthed pr. plante. Tilsæt 120 g jordblanding bestående af 50% sigtet jordbund (< 600 μm) og 50% pottejord fugtet med 20 ml deioniseret vand.
9. Efter 7 dage overføres alt indhold af 44-mL-beholderen til 473-mL-beholderen. Larverne vil være anden instars på tidspunktet for overførslen.
   Bemærk: denne overførsel til en større container er nødvendig for at forsyne larverne med nok rodmasse til fodring gennem pupation.
10. Observere fremkomsten af voksne typisk omkring 26 dage efter ægluge. Voksne er aktive flidere ved fremkomsten og kan undslippe 473-mL beholderen, når de forsøger at indsamle dem i hånden. Brug i stedet et vakuum med en indsugnings til at samle voksne.
11. At adskille voksne efter køn og/eller dato, hvis det er nødvendigt for sammenlignende testning. Sex af vestlige majs rodorm kan bestemmes ved at observere morfologien af prothoracic basitarsi²¹. Hanner har bred, firkantet prothoracic basitarsi, mens de af kvinder er smalle og koniske-formede.
    1. Placer Beetle i et 45-mL klart polystyren plastik hætteglas og dæk med et låg med 6 små (~ 1 mm diameter) huller.
    2. Anæstetisere Beetle. Anbring enden af et rør, der er fastgjort til en CO₂ -tank regulator over hullerne i låget, og lad en blid strøm af co₂ komme ind i røret i ca. 10 til 15 s, indtil den voksne mister grebet på væggen af hætteglasset.
       Bemærk: det bedøvede insekt vil forblive immobiliseret i ca. 1 min.
    3. Placer den bedøvede Bille, ventrale side op, på en inverteret plastik petriskål bund. Placer forsigtigt det ikke-inverterede låg på Petri skålen over Beetle. Sørg for, at Bille Rens tarsi presser mod låget, så det er let at observere den prothoraciske basitarsi under et dissekere mikroskop.
12. Hvis forsøget kræver, at biller skal være parret før flyvning, derefter bruge hanner mindst 5 dage gammel til at parre med de nyligt dukkede hunner.
    Bemærk: brug af ældre mænd sikrer, at de er seksuelt modne på deres introduktion til jomfru kvinder. Hunnerne er seksuelt modne efter voksnes opståen, hvorimod hannerne kræver 5 til 7 dages post spirings udvikling for at nå seksuel modenhed^22,23.

2. Start Flight Mill softwareprogram før flyvning test

Bemærk: Flight Mill programfiler (. vi filtypenavne, der kører i en kommerciel software platform, se tabel over materialer) og detaljer for deres anvendelse er tilvejebragt til download via links ("dataanalyse rutine" og "cirkulære Flight Mill instruktioner", "Flight Mill ledningsføring og software"-afsnittet på webstedet for Jones et al.¹⁸ . Hvis programmerne ikke længere fungerer i nyere eller fremtidige versioner af softwareplatformen, eller hvis brugeren ønsker at tilføje nye funktioner, kan de rutiner, der leveres af Jones et al. ¹⁸ , ændres af brugeren efter behov.

1. Åbn Flight Mill softwareprogram (figur 3).
2. Angiv oplysningerne under fanen initialisering .
   1. Indstil Start tidspunkt og sluttidspunkt for den ønskede varighed af flyve testen.
      Bemærk: alle voksne skal bindes og monteres på flyve Møller med 30 min før start tidspunktet. Det kan tage en erfaren person 30 min til 45 min til tether og forberede 16 biller til flyvning test (Se punkt 3).
   2. Indstil min-tærsklen (min) til 0. Dette sikrer, at enhver detektering af Flight arm passerer vil blive registreret, og er den standard anbefales af Jones et al. ¹⁸.
   3. Indstil Max-tærsklen (min.) til 1. Her, 1 min blev brugt. Denne værdi betyder, at der skal gå 1 min. mellem sensor detektering af flyve armen til "ring" i slutningen af en flyvning.
   4. Angiv et navn til filen.
   5. Angiv interval for rådata loggen (min.) til 1. Denne værdi styrer det interval, som de rå data skal kompileres for til output rapportering. Her er den sat til 1 min. Således vil produktionen af revolutioner, for eksempel, blive logget per minut.
      Bemærk: det faktiske tidsinterval mellem elektronisk scanning af sensor aktivitet er meget kort, men en 1-minutters interval giver mulighed for at logge på en fin nok skala til de fleste forskningsformål, mens begrænse antallet af linjer i regnearket output til et rimeligt antal til undersøgelse af øjet.
3. Under fanen emne oplysninger skal du udfylde kolonnerne med etiketten id, kost, køn, art og kommentarer efter behov.
4. Klik på Start -knappen, som er placeret i venstre side af skærmdisplayet. Programmet vil begynde at indsamle rå data, når det aktuelle tidspunkt svarer til start tidspunktet.

3. tether Western Corn rodorm til Flight Mill

1. Bøj en 40-mm længde 28-gauge stål wire 90 ° i midten.
   Bemærk: tråden kan også være af et andet metal såsom kobber eller messing.
2. Tag en lille mængde dentalvoks, lidt større end en Pinhead, og rul den mellem fingerspidserne, indtil en kugle dannes. Sørg for, at fingre er rene for at forhindre snavs, snavs og olie i at indarbejde i voks, fordi det kan forhindre, at voks klæber til insektet.
3. Skub den ene ende af 40 mm den bøjede ledning ind i midten af bolden af voks.
4. Anæstetisere test voksen med CO₂ som beskrevet ovenfor (Se 1.11.1 og 1.11.2).
5. Placer den bedøvede voksen på en flad overflade og Placer dens Rygside opad. Hvis Beetle ikke ligger helt fladt på overfladen, skal du flytte benene, så den gør det. Det er vigtigt, at Beetle ligger så fladt som muligt på overfladen for at sikre korrekt positionering af ledningen.
6. Kortvarigt (< 1 s) opvarmer dentalvoks på ledningen med en butan lighter. Hvis voks opvarmes for længe, vil den smeltede voks falde af tråden. Må ikke genbruges voks, hvis det er faldet fra ledningen, da det ikke vil effektivt overholde insekt neglebånd.
7. Placer forsigtigt enden af ståltråden med den smeltede dentalvoks på pronotum-overfladen, mens den anden ende af ledningen, (dvs. enden uden dentalvoks), langs midterlinjen af maven. Alternativt, punkt enden af ledningen uden dentalvoks mod hovedet, hvis det ønskes. I så fald vil en flyvende Bille skubbe flyve armen i stedet for at trække den. Sørg for, at den smeltede voks ikke kommer på elytra eller dens suturer, da det kan forhindre eller hindre flyvning.
8. Anbring den frie ende af ledningen i åbningen af det hule metalrør i flyve mølle armen. Sørg for, at ledningen sidder stramt nok til at holde på plads ved friktion. Den tøjrede Bille kan placeres til at flyve enten med eller mod uret.
9. Umiddelbart efter montering af en Bille, rive et lille stykke (~ 1-cm dia) af silkepapir fra et større væv. Tilbyd vævs stykket til den tøjrede Bille hængende fra flyve møllen til haseleddet kontakt; de fleste biller vil gribe vævet og holde det mod tyngdekraften, indtil de frigiver det i begyndelsen af deres første flyvning aktivitet. Dette vil i høj grad reducere indledende flugt eller landing flyvning adfærd.
   Bemærk: menneskelig tilstedeværelse i Flight-testrummet bør begrænses til at montere og fjerne voksne fra flyve møllerne. Testperioden begynder normalt ikke, før der er gået mindst 30 minutter siden den vedhæftede fil (se bemærkning under 2.2.1), og mennesker bør ikke være til stede i flyve rummet i dette tidsrum eller i selve testperioden.
10. Fjern alle fly-testede voksne efter afslutning af en flyvning mølle test. Fjern voks perle, som forbinder tether med Rygsiden ved forsigtigt at skrælle tråden væk fra Rygsiden. Voks vil adskille let uden at beskadige neglebånd, gør insektet til rådighed for yderligere eksperimenter, hvis det ønskes.

4. Gem de indsamlede data fra Flight Mill programmet.

1. Programmet kan være indstillet til enten Manuel eller Auto. Hvis programmet er indstillet til manuel, skal brugeren afslutte programmet ved at klikke på knappen stop . Hvis programmet er indstillet til Auto, vil programmet stoppe indsamlingen af rå data, når det aktuelle tidspunkt svarer til sluttidspunktet.
2. Klik på exit , når Flight-testperioden er afsluttet.
3. Kontroller, at en TDMS-fil er gemt under det filnavn, der blev indtastet under initialisering af programmet (trin 2,2).
4. Klik på TDMS-filen, og Gem dokumentet som et regneark (. xlsx).

5. Hent flyparametre fra det gemte regneark (. xlsx)

Bemærk: et regneark kan være specialdesignet til at manipulere RAW-dataoutputtet fra Flight Mill-softwaren. Her var softwareprogrammet det samme som beskrevet af Jones et al. ¹⁸, men en ekstra rutine blev tilføjet for at genkende og opsummere den længste uafbrudt flyvning med et enkelt insekt i løbet af testperioden.

1. For hver enkelt person, der beskæftiger sig med flyaktivitet, vil regnearket indeholde følgende oplysninger: flynummer, total omdrejninger, starttid, Sluttidspunkt og flyvarighed i minutter.
   1. For at beregne den samlede distance, der flyves i løbet af testperioden, skal du opsummere kolonnen "total omdrejning" og multiplicere den med den distance, der flyves pr. omdrejning. Afstanden pr. omdrejning afhænger af længden af flyve armen fra den centrale drejning til det vedlagte insekt. For eksempel, hvis denne afstand er 15,9 cm, hver revolution svarer til en meter fløjet. Det samlede antal omdrejninger kan også findes under fanen "test statistik".
   2. For at beregne den samlede varighed, som flyves i løbet af testperioden, skal du opsummere kolonnen "flyve varighed (min.)".
   3. Hvis du vil bestemme afstanden og varigheden af den længste uafbrudt flyvning, skal du gå til fanen "test statistik" og se under kolonnen "længste flyvning #".
   4. Flyve hastigheden kan beregnes ved at dividere afstanden flyves med flyve varighed. For insekter udtrykkes hastigheden almindeligvis i m/s eller km/h.

Representative Results

Figur 4 viser repræsentative eksempler på output, som forventes efterprøvning af flyvningen. Flight data blev indhentet fra eksperimentel arbejde udført i Department of Entomology på Iowa State University. Seks-dages gamle, parret kvindelig vestlige majs rodorm voksne blev bundet til Flight Mills og placeret i en kontrolleret miljøkammer sat på 14:10 l:d, 60% RH, og 25 ° C. Billerne blev efterladt på flyve fabrikkerne i 22 timer i træk begyndende 30 minutter før påbegyndelse af simuleret daggry, og deres flyveaktivitet blev indspillet (figur 4). Daggry og skumring blev simuleret af en programmeret, gradvis ændring i lysintensiteten fra Full-off til Full-On ved daggry (eller vice-versa i skumringen) over en 30-minutters periode. Den første fane i det resulterende regneark opsummerer de enkelte voksne, der blev testet, ved hjælp af oplysninger indtastet fra trin 2,3. De efterfølgende faner omfatter flyvedata for hver enkelt person. De sidste to faner er mærket ' rå DATA ' og ' test statistik '. "Rå DATA" omfatter tidspunktet for flyveaktivitet for alle individer. » Prøvnings statistikker «angiver den længste uafbrudt flyvning for hver Bille og resuméer af varigheden af den længste uafbrudt flyvning i minutter, den samlede tid, det har været under flyvningen i løbet af prøveperioden i minutter, og det samlede antal omdrejninger i løbet af testperiode. Tidsstempler for begyndelsen og slutningen af hver uafhængig flyvning tillader analyser af flyhyppighed.

For den kvindelige Bille, som er bundet til Flight Mill #2 (figur 4b), viser regnearket antallet af flyvninger, total omdrejninger pr. flyvning, start-og sluttidspunkt for hver flyvning og varigheden af hver flyvning. Denne kvinde engageret i flere uafhængige flyvninger, hvoraf de fleste var meget korte. Men i Flight #5 den kvindelige rejste 1.258 m (hvilket svarer til antallet af omdrejninger i dette tilfælde, fordi afstanden pr revolution var 1 m) over en 37,8-min periode uafbrudt flyvning. Den kvindelige Bille, der er bundet til flyve mølle #1 (figur 4c), deltog ikke i flyvningen i løbet af testperioden, så der vises et tomt regneark.

Som et eksempel, resultaterne er præsenteret fra en simpel sammenligning af flyvning karakteristika mellem to grupper af kvindelig vestlige majs rootworm. Voksne blev indsamlet i kommercielle Cornfields fra to steder i Iowa og tilladt at oviposit i laboratoriet. Æg blev indsamlet, og afkom opdrættet som beskrevet i trin 1 i protokollen ved en post-nyfødte tæthed (trin 1,9) af 12 larver pr 36 frøplanter. De resulterende voksne hunner blev bundet og testet som beskrevet i trin 2 og 3. Tabel 1 viser en oversigt overflyve parametrene fra de rå data, der er hentet fra Flight Mill-softwaren som beskrevet i trin 4 og 5. Samlede flyve parametre refererer til summen af alle flyvninger af en person i løbet af 22-h-testperioden, mens de længste flyve parametre refererer til den længste uafbrudt flyvning under prøvningen.

Figur 1. Insekt flyvning Møller anvendes til tøjret eksperimenter. A) hele insekt flyve mølle og B) arbejds delen af flyve møllen. A) den arbejdende del af flyve møllen er cirklet, (B) (1) 1 m flyve armen med hypodermic tube, (2,3) afmærkning af ferrit ring magneter, (4) digital Hall-effekt sensor, (5) lille nikkel Rings magnet, der bruges til at udløse sensoren, og (6) hypodermic Thin Wall tube ("Central pin"), der adskiller afvisende magneter (2, 3). Flight Mills modificeret lidt fra det oprindelige design af Jones et al.¹⁸  venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Komponenter i flyve møllen miljøkammer. (A) udvendige kammer funktioner omfatter (1) intellus controller, (2) Kontrolpanel, og (3) hovedstrøm afbrydelse. (B) indvendige kammer funktioner omfatter (1) enhed kølere (bag loft panel), (2) LED-moduler, (3) reoler, og (4) pan-type luftfugter.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. En grænseflade af Flight Mill softwareprogram. (A) den første fane, mærket ' initialisering ', kræver oplysninger, herunder start-og sluttidspunkter, og filnavnet. B) den anden fane med etiketten "emne oplysninger" kræver ikke, at der indtastes oplysninger, men bruges til at skelne mellem flere personer evalueret i en enkelt flyveprøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Repræsentative flyvedata fra 6-dages gamle kvindelige Western Corn rodorm biller. (A) den første fane i output opsummerer de oplysninger om syv individer flyvning testet på en bestemt dag. (B) flyvedata for hunnen på flight Mill #2 (FM # 2), som deltog i flere uafhængige flyvninger i løbet af 22-timers testperioden. C) den kvinde, der er anbragt på flight Mill #1 (FM # 1), deltog ikke i flyvningen i løbet af 22-timers testperioden, hvilket resulterede i et tomt regneark.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

		Placering
		Ames	Nashua
Prøvestørrelse1		23	31
Samlet flyve distance (m)		387,83 ± 146,21	949,10 ± 267,73
Samlet flyve varighed (min.)		14,34 ± 5,06	37,01 ± 10,51
Samlet flyvehastighed (m/s)		0,42 ± 0,04	0,44 ± 0,06
Længste flyve distance (m)		184,48 ± 81,82	590,13 ± 186,01
Længste flyve varighed (min.)		6,27 ± 2,26	22,15 ± 7,67
Længste flyvehastighed (m/s)		0,46 ± 0,04	0,44 ± 0,03
1 fløj mindst 1 minut

Tabel 1. Mean (± Se) præstation på Flight Mills af kvindelige Western Corn rodorm fra to steder i Iowa. Længste flyvning refererer til den længste uafbrudt (dvs. kontinuerlig) flyvning, der udføres af hver enkelt person i løbet af testperioden.

Discussion

Karakterisering vestlig majs rodorm flyvning adfærd er vigtig for at udtænke effektive resistens Management planer. Flyvning opførsel af denne skadegører er blevet undersøgt i laboratoriet ved hjælp af forskellige metoder, herunder actografer, Flight tunneler, og Flight Mills. Flight Mills, som beskrevet og illustreret i dette papir, tillader insekter at foretage uafbrudt flyvninger, så forskerne kan kvantificere flyve parametre såsom distance, varighed, hyppighed og hastighed af individuelle flyvninger, over en hel testperiode.

Det mest udfordrende trin i protokollen for Flight Mill eksperimenter med Western Corn rootworm, som det er for de fleste insektarter, er korrekt anvendelse af en tøjle til den voksne (trin 3). Dette kan være en vanskelig opgave på grund af den lille mængde af overfladeareal til rådighed på Rygsiden til fastgørelse af ledningen, samt den rigelige mængde af naturlige voks på neglebånd overflade. Opgaven er gjort vanskeligere af den begrænsede tid til rådighed til at anvende tether før insektet begynder at røre, som det fremgår af CO₂ bedøvelsesmiddel. Det er vigtigt, at tether er foret korrekt og klædes til beetles Rygsiden gennem hele testperioden. Hvis tether er forkert justeret, kan Beetle have en vanskelig tid at deltage i flyvningen, mens på flyet Mill, hvilket resulterer i kunstnerisk lavere afstand, varighed og hastighed. Beetle kan undslippe i løbet af testperioden, hvis dentalvoks ikke overholder ledningen stærkt nok til pronotum. Derfor er det vigtigt at have rene, stabile hænder, en god fornemmelse for opvarmning af voks til en brugbar temperatur, og tillid, mens tethering biller, som alle er opnåelige med passende praksis.

Der skal træffes beslutning om, hvad en uafhængig flyvehændelse er, således at grænseværdien kan fastsættes (trin 2.2.3). En person kan ikke foretage flyvninger, én flyvning eller snesevis af flyvninger i løbet af en testperiode, afhængigt af dens stop-og-Go-aktivitet, men også af den tildelte Max-tærskelværdi. Den standardværdi rapporteret af Jones et al.¹⁸ er 5 s. I denne undersøgelse af Western Corn rootworm, Max tærsklen blev sat til 1 min. Den mest hensigtsmæssige indstilling er en dom opfordring baseret på insektarter og mål for forskeren. Der er kompromisser. Et insekt, der afsluttes flyvende, men fortsætter med at cirkel for en eller flere omdrejninger på grund af momentum vil have disse revolutioner fejlagtigt tælles som en del af den foregående flyvning, når værdien er sat til 1 min. Hvis værdien er indstillet til 5 s, tælles de fleste ekstra ikke-flyomdrejninger ikke, og logføring af den pågældende flyvning vil blive afsluttet korrekt. På den anden side, undertiden et insekt bremser sin flyvning betydeligt i et forsøg på at kontrollere sin retning, at lande, eller af andre grunde, så genoptager flyver med højere hastighed uden nogensinde at have stoppet aktiv flyvning. En sådan opførsel på Flight Mills er almindelig og er blevet observeret i vestlige majs rootworm; Det ville ofte være logget som to separate flyvninger, når den maksimale tærskel er sat til 5 s, men ville være korrekt registreret som en uafbrudt flyvning, når tærsklen er 1 min. Under 1-min tærskel, dog, flyvningen af et insekt, der virkelig stopper flyvende derefter genoptager flyvning inden for 1 min ville være fejlagtigt registreret som ikke at have stoppet.

En minimums flyve tærskel (f. eks. mindst én flyvning på mindst et minut) kan anvendes til at udelukke voksne, der kan være blevet beskadiget under håndteringen eller på anden måde i dårligt helbred, fra yderligere analyser. Trade-off for at beskytte mod sådanne falske nuller (eller falske meget korte flyvninger) er muligheden for at udelukke true-Zeros (eller sande meget-korte flyvninger), dvs personer, der var sunde, men var ikke motiveret til at flyve. Forskeren skal beslutte, hvordan man håndterer nuller (eller meget korte flyvninger) baseret på målene for forsøget, samt hvilken type fejl er mest sandsynligt, og som er mindst ønskelig, når det kommer til at fortolke resultaterne. Desuden opstår der et fælles problem, når positionen af flyve armen, der understøtter en inaktiv Bille, forekommer at være direkte over eller meget tæt på sensoren, hvor små bevægelser af armen forårsaget af ikke-flybevægelser af insektet eller mindre luft strømme i kammeret kan fejlagtigt optages som omdrejninger. For at undgå, at denne metodiske artefakt oppumper hyppigheden af kortere flyve varigheder, anbefales det at udelukke alle flyvninger, der varer ≤ 1 min. fra analyserne. Denne form for kunstnerisk læsning, hvis den fortsætter i længere tid, kan også resultere i en ufølsom høj hastighed (f. eks. > 2 m/s) for en registreret "flyvning"; når de opdages, bør disse "Flight"-data slettes for den pågældende person.

Selv om Flight Mill undersøgelser har givet vigtig indsigt i vestlige majs rodorm flyvning adfærd, som med alle arter der er komplikationer i forbindelse tøjret flyvning til naturlig flyvning i marken²⁴. Et insekt på en flyve mølle er suspenderet, hvilket giver vertikal støtte til sin vægt. Således den energi, der anvendes til at give Lift under naturlig flyvning kan ikke investeres af tøjret insekter på Flight Mills²⁵. På den anden side, et tøjret insekt skal give mere fremstød end i fri-flyvning til at overvinde friktion på omdrejnings linjen, den ekstra vægt af flyvningen arm, og aerodynamiske træk fra flyve armen^25,26. Naturlig flyvning af Western Corn rodorm også undertiden forekommer i højder over sin flyvning grænse lag²⁷, hvor afstanden dækket under flyvningen kan være stærkt påvirket af vindhastigheder, der er meget større end insektets ustøttede flyvning hastighed ²⁸. Flight Mills pålægger envejsflyvning, så den distance, der flyves, kan overvurdere den samlede forskydning i det område, hvor flyvebanen kan blive bugtende. Giver haseleddet kontakt med et lille stykke væv efter montering af insektet på Flight Mill (trin 3,9) reducerer indledende flugt flyvning samt flyvning aktivitet i forbindelse med et forsøg på at lande. Men når Beetle dråber vævet under et eksperiment, det samme problem med manglende evne til at opsige flyvningen ved landing er stødt på. Alternative actograph systemer har været anvendt i laboratorie flyvning eksperimenter med tøjret^8,9 eller løsgående⁷ Western Corn rootworm. Mens de lindre problemet med flyvningen opsigelse ved at tillade spontan haseleddet kontakt, den trade-off er den manglende evne til at måle flyvning afstand eller hastighed. På trods af disse begrænsninger er Flight Mill meget nyttig som et sammenligningsværktøj til at undersøge, hvordan en række udviklingsmæssige, biotiske og abiotiske faktorer påvirker et insekternes tilbøjelighed til at engagere sig i flyvningen, og hvordan selve flyadfærden påvirkes. Når det kombineres med andre beviser, som det fremgår af Mark-Capture eksperimenter²⁹, Trap data³⁰, og estimater af gene flow³¹, bidrager den unikke indsigt opnået fra Flight Mill eksperimenter til en holistisk forståelse af vestlige majs rodorm spredning i marken og dens befolkning-niveau konsekvenser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butane multi-purpose lighter	BIC	UXMPFD2DC	To soften wax when tethering
Clear polystyrene plastic vial (45-ml)	Freund Container and Supply	AS112	To hold beetle while anesthetizing
Dehydrated culture media, agar powder	Fisher Scientific	S14153	To make agar for holding moisture for adults
Delrin rod (1" diameter, 3.75" long)	Many suppliers: can use cheapest on the internet.		For post of flight mill
Dental wax	DenTek	47701000335	Adheres wire tether to prothorax
Ferrite ring magnets (OD: 0.69”, ID: 0.29”, Thickness: 0.118”; 7oz pull)	Magnet Shop	63B06929118	Opposing - to generate the float.
Hall effect sensor	Optikinc	OHN3120U	Look under magnetic sensors on the left side of the Optekinc website then look for the part number. A link is given for current suppliers.
Hypodermic tubing (22 gauge; 0.0358” OD x 0.01975” ID x 0.004” wall)	Small Parts, Inc.	HTX-22T-12	Used for flight mill arms and main axis rod.
Incubator (104.1 x 85.4 x 196.1 cm)	Percival Scientific	I-41VL
LabVIEW Full Development System software, system-design platform	National Instruments (See http://www.ni.com/en-us/shop/labview/select-edition.html)	LabVIEW 2018 (Full Edition)	Provides environment needed to run flight mill files (.vi extensions) available for download from Jones et al.18 at http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill.  LabVIEW 2018 Full is compatible with Win/Mac/Linux operating systems.
Mesh cage (18 x 18 x 18 cm)	MegaView Science Co. Ltd.	BugDorm-4M1515	mesh size = 44 x 32, 650 µm aperture
Needle tool	BLICK	34920-1063	For scoring soil surface for egg laying in laboratory
Nickel ring magnets (3/16” OD x 1/16” ID x: 1/16” thick)	K&J Magnetics	R311	Used to trigger the digital hall effect sensor.
Petri dish (100 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	S33580A
Plastic container (44-ml)	Dart	150PC	For initial rearing of young larvae
Plastic container (473-ml)	Placon	22885	For rearing of older larvae
Round brush (size 2)	Simply Simmons	10472906	For transferring freshly hatched neonates to surface of roots
Sieve (250-µm)	Fisher Scientific	08-418-05	To separate eggs from soil
Steel wire (28-gauge)	The Hillman Group	38902350282
Teflon rod (3/8" diameter, 3/4" length)	United States Plastic Corporation	47503	To accept the rotating arm.
Vacuum	Gast Manufacturing, Inc.	1531-107B-G288X	For aspirating adults in laboratory
White poly chiffon fabric	Hobby Lobby	194811	To prevent escape of larvae from rearing container