Summary
Här presenterar vi ett protokoll med hjälp av en mus positioneringsenhet som möjliggör lämplig placering av möss för intranasal administrering av en hjärna-inriktning peptid-siRNA formulering möjliggör effektiv gen ljuddämpning i centralanervsystemet.
Abstract
Intranasal (IN) Drug leverans till hjärnan har vuxit fram som en lovande metod för att kringgå blod-hjärnbarriären (BBB) för leverans av läkemedel i centralanervsystemet (CNS). Nyligen genomförda studier visar användningen av en peptid, RVG9R, införliva den minimala receptor-bindande domänen av rabies viruset glykoprotein, i framkalla leverans av siRNA till nervceller i hjärnan. I detta protokoll, peptid-siRNA formuleringen levereras intranasalt med en pipett i den dominerande handen, medan den sövda musen hindras av kragen med dominanta hand i en "Head ner-och-framåt position" för att undvika dränering i lungorna och mage vid inandning. Denna exakta gripande av möss kan läras men är inte lätt och kräver övning och skicklighet för att resultera i effektiv CNS upptag. Vidare, processen är långdragen, kräver ca 45 min för administrering av en total volym av ~ 20-30 μL lösning i 1-2 μL dropp volymer per inandning, med 3-4 min viloperioder mellan varje inhalation. Syftet med denna studie är att avslöja en mus positionering enhet som möjliggör lämplig placering av möss för effektiv administration av peptid-siRNA formulering. Flera funktioner är införlivade i utformningen av enheten, såsom fyra eller åtta positionsstolar med justerbar höjd och lutning för att hindra sövda möss i huvudet ner-och-framåt position, vilket möjliggör enkel visualisering av mössen s Nares och en inbyggd värmedyna för att bibehålla mössen kroppstemperatur under förfarandet. Viktigt, förmågan att behandla fyra eller åtta möss samtidigt med RVG9R-siRNA komplex på detta sätt möjliggör studier på en mycket snabbare tidsskala, för testning av en i terapeutisk siRNA tillvägagångssätt. Sammanfattningsvis, denna enhet möjliggör lämplig och kontrollerad mus huvud positionering för tillämpning av RVG9R-siRNA och andra terapeutiska molekyler, såsom nanopartiklar eller antikroppar, för CNS leverans.
Introduction
BBB förhindrar systemiskt administrerade molekyler av > 400-600 da från att komma in i hjärnan, utgör en betydande utmaning för leverans av terapeutiska biomolekyler för sjukdomar som påverkar CNS och hjärnan1. Direkt Drug leverans till hjärnan kan uppnås genom stereotaktisk injektion; emellertid, detta kräver kirurgisk expertis och är mycket begränsad i leverans till områden proximala till injektionsstället, vilket gör det olämpligt för rutinmässig klinisk användning2. I leverans till hjärnan kan också resultera i direkt hjärna leverans genom att kringgå BBB, möjliggör direkt och snabb överföring av en mängd olika ämnen till hjärnan3,4. Denna överföring tros ske genom transportmekanismer via lukt-och trigeminusnerver som förbinder nasal passage till hjärnan, cerebrospinalvätskan, och lymfsystemet5. Som direkt näsa-till-hjärna rutten inte innebär perifera organ och vävnader, det minskar avsevärt systemiska biverkningar och förbättrar potens. I administration är ett lovande noninvasiv alternativ till både lokala och systemiska vägar för hjärnans leverans av terapeutiska medel och kan representera en kraftfull metod för att bekämpa neurologiska sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, och hjärncancer, och utforskas i flera kliniska prövningar6,7,8.
Flera experimentella faktorer, såsom volym och metod för inympning, samt formulering pH, starkt påverka läkemedelsleverans till CNS via näsan till hjärnan väg9. I studier med möss, framgången för i läkemedelsleverans beror starkt på korrekt huvud positionering, vilket är avgörande för effektiv hjärn deposition och för att undvika drog dränering i den yttre miljön eller luftvägarna. I synnerhet använder majoriteten av gnagare studier en head-back position (liggande) med en 70 °-90 ° lutning för läkemedelsleverans till luktsinnet epitel, även om huvudet positionering vid 0 ° kan gynna dränering i luftstrupen9. VID leverans av läkemedel hos möss som är vakna resultat i minskad hjärn deposition jämfört med någon ansökan i ryggläge, främst på grund av forskares oförmåga att hålla möss i önskad position för längre tidsperioder. Dessutom, den upp och ner position som krävs av huden grepp metod som används för vaken möss resulterar i drog avsättning främst i trigeminusnerven och luktsinnet glödlampa, liksom perifera organ, såsom njurar och lungor, inom 30 min postinympning10. Den lämpligaste kroppen position för leverans av Therapeutics genom lukt-eller trigeminala nerver hos större djur som icke-mänskliga primater i kliniska studier verkar vara huvudet nedåt och framåt position (dvs. den så kallade "be till Mecka position ")11. Emellertid, denna position har inte varit väl studerat i musmodell, och rygg positionen är mer allmänt används i gnagare studier.
Tidigare har vi visat att RVG9R, en peptid som utformats baserat på den minimala receptor bindnings domänen av rabies viruset, visar tropism till celler som uttrycker nikotinacetylkolinreceptorsubenheter som nervceller och makrofager och förmedlar intracellulär leverans av siRNA genom en mekanism som involverar receptor engagemang och tillfällig plasmamembran delokalisering på platsen för receptor aggregation12,13. Viktigt, systemisk intravenös administrering av RVG9R-siRNA komplex möjliggör transvaskulär leverans av siRNA i CNS14. Den systemiska vägen späder dock ut mängden siRNA som levererats till CNS, och de senaste uppgifterna visar att den i administreringen av RVG9R: siRNA-komplexen till möss som placerats i huvudet nedåt-och-framåt-läge framkallar en bred spridning av mål genen i flera regioner i hjärnan15. Viktigt, denna nivå av knockdown uppnåddes med så lite som 13,5 μg siRNA administreras under en fyra-dos, 2 dagars regim medan IV vägen kräver en ~ 5 gånger högre dos per injektion för att uppnå jämförbar knockdown. Den enda bristen i IN-metoden är att det är ett mödligt förfarande, som kräver användning av båda händerna under administrering av lösningen samtidigt som den kontinuerligt gripande möss alternativt i huvudet ner-och-framåt och i avslappnade positioner mellan varje inhalation under en avsevärd lång behandlingsperiod (ett 30-45 min-förfarande för effektivt upptag av en volym på ~ 20-30 μL per mus). Med hjälp av den mus positioneringsenhet som presenteras här möjliggör en korrekt placering av möss med liten fysisk tvång till djuren och den personal som utför protokollet, samt behandling av flera kohorter av möss inom en rimlig tidsperiod, möjliggöra en fördjupad studie om att använda siRNAs som en terapeutisk för West Nile encefalit hos möss i sena stadier av sjukdomen15.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjer och protokoll som godkänts av djurskötsel-och användnings kommittén för Hanyang-universitetet. I detta protokoll användes 6 veckor gamla Balb/c-möss som väger 20-25 g (n = 3 per grupp). Djuren var inhysta i en patogen-fri anläggning med 12 h ljusa/mörka cykler vid en kontrollerad temperatur och fuktighetsnivå med fri tillgång till vatten och mat.
1. montering av enheten
- Montera de enskilda delarna av positionerings anordningen som visas i figur 1a.
Obs: enheten levereras i enskilda delar som enkelt kan monteras och demonteras.
2. material inställning
Anmärkning: den i administrationen av kondenserade läkemedel kräver följande förbehandling steg.
- Förbered de material som krävs, inklusive positionerings enheten, en mikropipett på 10 μL, 10 μL mikropipettspetsar, en behandlingslösning (t. ex. RVG9R-siRNA-komplex), en timer-klocka och 70% etanol (se figur 2A).
- Koppla in ström koden för att slå på enhetens värmesystem minst 15-20 min före experimentet. Den optimala temperaturen för djurförsök upprätthålls automatiskt vid ~ 37 ° c.
- Förbered anestesi ketamin: xylazin: fosfat-buffrad saltlösning (PBS) vid ett förhållande av 1:0.5:8.5 och söva varje mus med en enda intraperitoneal (i.p.) injektion i en slutlig volym av 200 μl per 20 g mus.
Obs: Observera att alla optimerade läkemedel för att säkerställa anestesi villkoret för en period av 30-45 min kan användas.
3. mus positionering
- Bedöma nivån av anestesi genom pedal reflex (fast tå nypa) för att bibehålla det kirurgiska planet.
- Placera positionerings enheten på lämpligt avstånd och höjd för att ge bekväm tillgång till alla nödvändiga reagenser.
- När mössen är ordentligt sövda, försiktigt lyfta varje mus genom kragen av halsen med tummen och pekfingret och placera den på den utsedda stolen.
- Korrekt positionering av musen på stolen är mycket viktigt i detta skede. Lägg musen bakåt parallellt med ryggstödet av stolen, och vid 90 ° till stolen sätet. Lyft händerna från musen och låt djuret ligga naturligt i huvudet nedåt och framåt position, utan att trycka eller trycka på, som visas i figur 2b. Se till att musens fram armar ger naturligt stöd medan djuret är i detta avslappnade läge, utan obehag för musen.
- När mössen är korrekt placerade, spänn fast mössen med stols bältet och starta omedelbart inympningen.
4. intranasal leverans
Anmärkning: detta protokoll beskriver i leveransen av RVG9R: siRNA komplex med hjälp av musen positionering enheten. Med detta protokoll kan maximalt 20-30 μL lösning enkelt administreras till varje mus i 2 μL droppar. Denna volym är lägre än den i musens näshålan, som är 0,032 cm3, så att förfarandet inte resulterar i dödliga näsborre obstruktion eller kvävning. Detta protokoll möjliggör samtidig inokulering av minst fyra möss och högst åtta möss per enhet, vilket resulterar i tidsoptimering och minskad variation.
- Ta 10 μL mikropipett och justera den till 2 μL.
- Fyll på mikropipetten med 2 μL RVG9R: siRNA Complex Solution (t. ex. 5,2 μg siCy5 komplex med 104 μg RVG9R för leveransförsöket, och 13,5 μg siSOD1 komplex med 270 μg RVG9R för ljuddämpnings försöket, i en slutlig volym på 25 μL PBS innehållande 5% glukos.
- Medan du håller pipetten i den dominerande handen, justera positionen genom att placera en armbåge på bänkskiva. Stöd handen som håller pipetten med den andra handen för att undvika okontrollerade rörelser under administreringen.
- Placera en ~ 2 μl droppe mycket nära en näsborre så att musen kan direkt andas in dropp (se figur 2b). Om en liten droppe inte är lätt bildas, sedan byta pipettspetsen med en ny och upprepa operationen. Använd stoppuret för att kontrollera tidsintervallet mellan inokulationerna.
- Denna enhet tillåter behandling av minst fyra möss i taget. Om en annan grupp möss krävs för att upprepa steg 4,4, Ställ in en annan stapel med fyra stolar ovanför eller under den första stapeln med fyra stolar för att rymma upp till åtta möss i taget på enheten.
- Upprepa steg 4,4 med den andra näsborren efter 3-4 min från den första inympningen. Detta tidsintervall är tillräckligt för musen för att slutföra inandning av den första dosen och återställa normal andning. Om en droppe inhalerad lösning tas bort på grund av oavsiktlig snarning ut från musens Naris, upprepa inokuleringen en ytterligare 2 μl lösning.
- Upprepa hela processen med alternativa näsborrar tills dosen 20-30 μL är avslutad. Det kommer att ta ~ 30-45 min att slutföra hela inympning förfarande.
- Sätt våt salva på mössen ögon innan du återvänder möss tillbaka till sina utsedda burar.
Obs: lämna inte möss utan uppsikt förrän de har återfått tillräckligt medvetande för att bibehålla sternala recumbency.
5. analys av data
- För att bekräfta hjärn nedsättningen av fluor-märkta RVG9R, söva möss (som beskrivs i steg 2,3) och isolera hjärnan, samt andra perifera organ, såsom lung, lever, mjälte, och njure. Placera varje organ på ImageStation och visualisera fluorescens med ImageStation.
- För att visualisera fluorescens på grund av Cy5-märkningen, Förbered 20 μm-tjocka kryosektioner, costained med Hoechst 33342, och utför full hjärnskanning med ett konfokalmikroskop.
- För att bedöma avtystning av gener, extrahera RNA från olika hjärnregioner, såsom luktbulben, cortex, Hippocampus, Thalamus, hypothalamus, lillhjärnan, och hjärnstammen, med ett RNA renings kit, omvänd transkriberas till cDNA med hjälp av en cDNA syntes satsen och utför qPCR med primer-par som beskrivits tidigare15.
Representative Results
Huvud positionen under i administrationen är en stor inverkan på effektiviteten av drogen leverans till hjärnan. Här beskrev vi huvudet nedåt och framåt position med hjälp av en mus positionering enhet för i administrationen av en hjärna-inriktning peptid-siRNA formulering för leverans av blandningen till musens CNS. För att kontrollera leverans genom in Route, vi använde RVG9R peptid, tidigare visat sig effektivt binda till neuronala celler både in vitro-och in vivo14,16.
Vi testade först näsa-till-hjärna leverans av RVG9R peptid märkt med Alexa fluor 488 (RVG9R-A488) med hjälp av musen positionering enhet som beskrivs här. Vid 48 h postinympning, olika organ, inklusive hjärnan, sinus, lungor, lever, mjälte, och njurar var censurerade att mäta vävnad-associerade en488 fluorescens. En488 ensamt, eller en kontroll peptid (RVM9R-a488)14 som inte binder nAChR, användes som negativa kontroller. Som väntat upptäcktes varken en488 eller RVM9R-A488 i någon av organen vid 48 h postinympning (figur 3a, vänster). Å andra sidan, en stark fluorescerande en488 signal upptäcktes exklusivt i hjärnan hos RVG9R-inokulerade gruppen. Dessutom jämförde vi denna mus placering position till ryggläge metod som har använts tidigare17, liksom till den vakna metoden, för effekt. Vi inokulerade ett fast belopp på RVG9R-A488 (100 μg) och analyseras biodistribution vid 48 h postinympning. Resultaten visade att positionering av möss huvudet nedåt och framåt förbättrat penetrans och deposition av RVG9R-en488 i hela hjärnvävnaden (figur 3a, höger). I motsats, djuren inokulerade i en liggande ställning resulterade i leverans av RVG9R-en488 till hjärnan men inte lika stark som sett med positionering enhetsmetoden. För att ytterligare bekräfta siRNA leverans till hjärnan, utförde vi full-hjärnskanning efter en enda i administrationen av RVG9R komplex till 400 pmol (5,2 μg) av Cy5-märkta siRNA. I motsats till PBS eller RVM9R, komplexbildare med RVG9R resulterade i en stark ansamling av siRNA i större hjärnregioner, inklusive luktbulben, cortex, Hippocampus, Thalamus, hypotalamus, midbrain, och lillhjärnan (figur 3b ).
Slutligen använde vi RT-qPCR-analys för att verifiera den intracellulära leveransen av funktionell siRNA riktad mot superoxiddismutase-1 (SOD1)-genen. Möss inokulerades intranasalt för 3 gånger på varandra följande dagar med RVG9R: siSOD1 (13,2 μg siRNA), och SOD1 mRNA uttryck analyserades 24 h efter den sista inympningen. RVG9R: siSOD1 administration resulterade i en betydande minskning av det SOD1 uttrycket i luktbulben (63%), cortex (47%), Hippocampus (61%), thalamus (53%), hypotalamus (55%), mellanhjärnan (39%), och lillhjärnan (30%) (Figur 4). Sammanfattningsvis, användning av en positionering enhet möjliggör en enkel inympning av RVG9R-complexed siRNA hos möss, vilket resulterar i hjärnspecifik siRNA leverans inducera funktionell ljuddämpning av målgenen.
Figur 1 : Fotografisk presentation av enhets monteringen. Positions stolarna monteras på stativet på lämplig höjd med skruvar. Efter monteringen, enheten är ansluten till en strömförsörjning för uppvärmning till den fysiologiska temperaturen under inympning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Fotografisk presentation av inokuleringsproceduren med positionerings enheten. Aförsöksutrustning som krävs för inympning. B) djur i huvudet nedåt-och-framåt-läge sittande på anordningen (vänster) och nedfallet av en 2 μl droppe för inympning (till höger). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Distribution av Fluorescent märkt peptid och siRNA efter i administrering. A) biodistribution av intranasalt INOKULERADE RVG9R peptid vid 48 h efter en enstaka inympning. Hjärnan och andra perifera organ utvärderades för förekomst av fluorescens i möss inokulerade med saltlösning (PBS), en488, RVM-a488, och rvg-a488 (vänster). Avbildning av möss behandlas som nämnts ovan medan de är vakna, i ryggläge, och i musen positionering utforma i huvudet nedåt och framåt position (höger). Bbiodistribution av RVG9R: siRNA-komplexet i hjärnan (n = 3 per grupp). Distributionen av Cy5-märkta siRNA visualiserades i hela hjärnans kryosektioner med ett konfokalmikroskopi-lasermikroskop hos djur som inokulerats med saltlösning (PBS), siRNA komplex med kontroll peptid (RVM9R-siCy5) eller hjärn måls peptid RVG9R (RVG9R-siCy5). Skalstapeln representerar 1 mm. förkortningar: o. b = lukt glödlampa; CTX = cortex; Hippo = Hippocampus; Hypo = hypothalamus; Tha = thalamus; m. b = midbrain; CER = cerebellum. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Vid applicering av RVG9R: siSOD1 inducerar målgentystning i flera regioner i hjärnan. qPCR-analys för murina SOD1 mRNA i indikerade hjärnregioner 24 h efter den sista inympningen av saltlösning (PBS), RVG9R: siCD4 (siCD4), RVM9R: siSOD1 (RVM9R), och RVG9R: siSOD1 (RVG9R). Den relativa SOD1 tystning i luktbulben, cortex, Hippocampus (övre), Thalamus, hypotalamus, lillhjärnan (mitten), och mellanhjärnan (lägre) visas. Data representerar medelvärdet ± SD i förhållande till GAPDH efter normalisering med motsvarande data av saltlösning-behandlade möss (n = 3 per grupp). Den tecknade serien som skildrar andelen SOD1 mRNA i den indikerade hjärnregionen efter inympningen visas (nedre högra). * *P < 0,01, * ** p < 0,001. Förkortningar: o. b = lukt glödlampa; CTX = cortex; Hippo = Hippocampus; Hypo = Hippocampus; Tha = thalamus; m. b = midbrain; CER = cerebellum. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi har utvecklat en mus positioneringsenhet för optimalt positionerande möss för näsa-till-hjärna-tillförsel av Therapeutics. Enheten är utrustad med olika funktioner, vilket garanterar enkel samtidig hantering av djur. Det är också utrustad med Värmekuddar för underhåll av djurens fysiologiska kropps temperaturer under experimenterande. De sövda möss kan underhållas i huvudet nedåt och framåt position med hjälp av särskilt utformade stolar, med minimal obehag för djuren. Höjden av positionering stolar kan justeras på ett sådant sätt som är bäst att visualisera djur näsborrar samtidigt administrera droger.
I hjärnan leverans har flera inneboende begränsningar, inklusive den lilla ytan av näsborrar (möjliggör maximal volym på 20-30 μL per administrering), näsirritation, epitel skador, och begränsad absorption över nasala epitel18. Den i administrering av läkemedel till möss placeras i ryggläge har använts för hjärnans leverans genom att släppa flytande droger i djurens alternativa Nares via pipett eller polyuretan slangar (24 G x 19 mm) ansluten till mikroliters sprutor19, 20. även om användningen av slangsystem för att frigöra läkemedel i närheten av lukt epitel är en potentiellt lämplig metod, det orsakar irritation eller nasal inflammation vid upprepad administrering. Dessutom begränsar den lilla storleken av näshålan denna metod, särskilt hos möss som kan övervinnas genom att upprepa, samt av läkemedelsberedningar som kvarstår i nässlemhinnan. Ett annat alternativ är i administrationen av Therapeutics till vaken möss10. Men detta tillvägagångssätt kräver skickliga procedurer för djurhantering under inympning. Dessutom, det orsakar djur stress och, därför, är inte idealisk för sjukdomsmodeller, särskilt infektionssjukdomar modeller. Dessutom, inkonsekvent dosering kan lätt resultera från drog dränering i lungorna eller magen på grund av ofullkomliga djur gripande. Det tillvägagångssätt som presenteras här gör det möjligt för forskarna att övervinna dessa tekniska hinder. Huvudet ner-och-framåt position minskar risken för drog läckage från näsan till lungorna medan inandning, gynnar direkt och selektiv siRNA leverans till hjärnan. VID leverans med hjälp av musen positionering enheten inte kräver någon specialiserad teknik för hantering eller gripande djuren under inympning. Fyra djur i taget kan behandlas under minst 30-45 min. Förfarandet kan skalas upp genom att inkludera en extra fyra-stolen bar, vilket möjliggör enkel hantering av upp till åtta möss i samma experimentella session. Därför kan en enda operatör, efter denna metod, inducera tillförsel av läkemedel till hjärnan hos stora grupper av djur under längre tidsperioder.
Den anatomiska strukturen i näshålan påverkar starkt näsan till hjärnan leverans (som granskats av Merkus et al.11 och RUIGROK och de Lange21). Den relativa ytan av näshålan i möss är 15 gånger större än för människor och den relativa ytan av lukt epitel är 6 gånger större. Även om det finns betydande skillnader i anatomi näshålan hos människor till gnagare, det finns cirka 45 kliniska prövningar pågår med hjälp av IN-metoden för att behandla flera hjärnsjukdomar (www.clinicaltrials.gov). Den studie som presenteras här indikerar att när man använder vid leverans av Therapeutics, forskare bör överväga flera faktorer, såsom huvud position, sova, och korrekt leverans agenter.
Vi har visat en effektiv och specifik avsättning av Fluorescent märkt siRNA till mus hjärnan. Dessutom, den betydande minskningen av SOD1 genuttryck observerats efter i siRNA leverans bekräftade funktionella effekter. Vi visade tidigare konsekvent att den i administrationen av RVG9R-siRNA komplex som riktar sig mot West Nile-viruset (WNV) RNA utövar en stark terapeutisk effekt på WNV encefalit15. Särskilt, näsa-till-hjärna siRNA leverans krävs en cell-inriktning ligand (RVG) och en positivt laddad molekyl (9R) till komplexa siRNA. I avsaknad av dessa element, molekyler rensades genom den systemiska kretsen och lymfkärl 48 h uppföljnings (figur 3a)15. Därför, i den experimentella installationen som beskrivs här, har vi undersökt peptid/siRNA lokalisering 48 h efter inympning till bilden endast de nivåer som behålls specifikt i hjärnan. Detta tillvägagångssätt kan lätt implementeras för leverans av andra molekyler, såsom proteiner, peptider, och nanopartiklar, eller andra Therapeutics, för behandling av ett antal hjärnrelaterade sjukdomar.
Disclosures
P.K. och S.K.L. är dem av Signet Biotech. P.K. är i av patent PCT/US07/12152, som delvis omfattar fordringar som hänför sig till RVG9R. IE, K.C., P.K. och S.K.L. listas som coinventors av ett inlämnat patent (PCT/KR2016/014220), som omfattar påståenden om en mus positionering enhet.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Korea ministeriet för hälso-& välfärd (HI17C1046) till S.K.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial assays | |||
| iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
| RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
| SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
| Dyes | |||
| Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
| Mouse strain | |||
| Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
| Oligonucleotides and primers | |||
| Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
| siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
| GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
| SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
| Peptides | |||
| RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
| RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
| Software, algorithms and devices | |||
| FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
| Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
References
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).
- Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route. Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).
- Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases. The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).
- Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting. Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).
- Agrawal, M., et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs. Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).
- Van Woensel, M., et al. Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM. Cancers. 5, 1020-1048 (2013).
- Kulkarni, A. D., et al. Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review. Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).
- Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice. Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).
- Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).
- Zeller, S., et al. Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA. Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).
- Kim, J., et al. Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39 (2007).
- Beloor, J., et al. Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus. Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).
- Ullah, I., et al. Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA. Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).
- Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).
- Mittal, D., et al. Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective. Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).
- Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway. Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).
- Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).
- Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans. The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).
