Summary
Vi beskriver en metod för att skapa och förstärka genetiskt modifierade respiratory syncytial virus (RSVs) och en optimerad plack analys för RSVs. Vi illustrerar detta protokoll genom att skapa två rekombinanta virus som respektive möjliggör kvantifiering av RSV replikering och live analys av RSV inkludering organ och organ i inkludering-associerade granulat dynamics.
Abstract
Användning av rekombinanta virus har blivit avgörande i grundforskning eller tillämpad virologi. Omvänd genetik har visat sig vara en extremt kraftfull teknik, både att dechiffrera virusreplikation mekanismer och att studera antivirala medel eller ge utvecklingsplattformen för vacciner. Konstruktion och manipulation av en omvänd genetiska system för en negativ-strand RNA virus såsom en respiratory syncytial virus (RSV), men fortfarande är känsliga och kräver särskilda know-how. RSV genomet är en singel-strand, negativ-känsla RNA av ca 15 kb som fungerar som en mall för både viral RNA replikation och transkription. Vår omvänd genetik system använder en cDNA kopia av RSV lång stam humangenomet (HRSV). Detta cDNA, as well as cDNAs kodning virala proteiner av polymerasen komplexa (L, P, N och M2-1), placeras i enskilda uttryck vektorer under T7 polymeras kontroll sekvenser. Transfection av dessa element i BSR-T7/5 celler, som stabilt express T7-polymeras, tillåter den cytoplasmiska replikation och transkription av rekombinant RSV, ger upphov till genetiskt modifierade virioner. En ny RSV, som finns på cellens yta och i kultur supernatanten BSRT7/5, samlas för att infektera mänskliga HEp-2 celler för viral förstärkning. Två eller tre omgångar av förstärkning behövs för att få viral spad innehållande 1 x 106 till 1 x 107 plaque-forming enheter (PFU) / mL. Metoder för optimal skörd, frysning, och titrering av viral bestånd beskrivs här i detalj. Vi illustrera protokollet presenteras här genom att skapa två rekombinanta virus respektive uttrycker gratis grönt fluorescerande protein (GFP) (RSV-GFP) eller viral M2-1 smält till GFP (RSV-M2-1-GFP). Vi visar hur du använder RSV-GFP för att kvantifiera RSV replikering och den RSV-M2-1-GFP att visualisera viral strukturer, samt virala protein dynamics i levande celler, med hjälp av video mikroskopi tekniker.
Introduction
Mänskliga RSV är den främsta orsaken till sjukhusvård för akut luftvägsinfektion i spädbarn i världen1. Dessutom, är RSV associerade med en betydande sjukdomsbördan hos vuxna jämförbara med influensa, med de flesta sjukhusvård och dödlighet börda i äldre2. Det finns inga vacciner eller specifika antivirala läkemedel tillgängliga ännu mot RSV, men lovande nya läkemedel är i utveckling3,4. Komplexiteten och tyngden av teknikerna av kvantifiering av RSV multiplikation hindra sökandet efter antivirala läkemedel eller vacciner trots nuvarande betydande ansträngningar. Kvantifiering av RSV multiplikation in vitro-bygger i allmänhet på mödosamma, tidskrävande och dyra metoder, som består mestadels i analysen av de cytopatisk effekten av mikroskopi, immunfärgning, plack minskning analyser, kvantitativa omvänt transkriptas (qRT)-polymeras-kedjereaktion (PCR) och glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analys tester. Virus med modifierade arvsmassan och uttrycka reporter gener, såsom de som kodar för GFP, är mer lämpade för sådana föreställningar. Kopplat till användningen av automatiserade plattan läsare, kan reporter gen-carrying rekombinanta virus göra dessa analyser mer lämpade för standardisering och hög genomströmning.
RSV är ett höljebärande, nonsegmented negativ-sense RNA-virus som tillhör släktet Orthopneumovirus av Pneumoviridae familj, ordning Mononegavirales5. RSV genomet är en singel-strand, negativ-känsla RNA ca 15 KB, som innehåller en icke-kodande regionen på 3' och 5' extremiteter kallas ledare och Trailer och 10 transkriptionell enheter kodning 11 proteiner. Generna är ordnade enligt följande: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (kodning för M2-1 och M2-2 proteiner) och L-5'. Genomisk RNA är ordentligt förpackad av nucleoprotein N. med encapsidated genomisk RNA som mall, viral RNA-beroende RNA-polymeras (RdRp) kommer att säkerställa transkription och replikering av viral RNA. Viral RdRp består av stora protein L som bär nukleotid polymeras aktiviteten i sig, dess obligatoriska kofaktor i phosphoprotein P och M2-1 protein som fungerar som en viral transkription faktorn6. I infekterade celler inducerar RSV bildandet av cytoplasmisk inneslutningar kallas integration organ (IBs). Morfologiskt liknande cytoplasmiska inneslutningar har observerats för flera Mononegavirales7,8,9,10. Nyligen genomförda undersökningar om rabies, vesikulär stomatit virus (VSV), ebolaviruset, och RSV visade att viral RNA-syntes förekommer i IBs, som kan således betraktas som viral fabriker8,9,11, 12. virus fabrikerna koncentrera den RNA och virala proteiner krävs för viral RNA-syntes och även innehålla cellproteiner13,14,15,16, 17. IBs uppvisar en funktionell subcompartment kallas IB-associerade granulat (IBAGs), som koncentrerar sig på nya synthetized begynnande virala mRNA tillsammans med proteinet M2-1. Genomisk RNA och L, P och N identifieras inte i IBAGs. IBAGs är små dynamiska sfäriska strukturer inuti IBs som uppvisar egenskaper för flytande organeller12. Trots den centrala rollen som IBs i viral multiplikation, är mycket lite känt om naturen, intern struktur, bildandet och driften av dessa virala fabriker.
Uttrycket av genomet hos ett poliovirus från en cDNA aktiverat produktion av den första smittsamma virus klonen i 198118. För enkelsträngat negativa RNA-virus var det inte förrän 1994 att produktionen av ett första rabiesvirus efter transfection av plasmider i celler19 ägde rum. Den första plasmid-baserade omvänd genetiska systemet för RSV publicerades 199520. Omvänd genetik har lett till stora framsteg inom virologi. Möjligheten att införa särskilda ändringar i det virala genomet har gett viktiga insikter i replikering och patogenesen av RNA-virus. Denna teknik har också underlättat utvecklingen av vacciner genom att låta specifika dämpning genom riktade rad ändringar. Genomet ändringar möjliggör en snabb kvantifiering av viral multiplikation kraftigt förbättrat antivirala screening och studie av deras verkningssätt.
Även om tidigare beskrivits, fortfarande att erhålla genetiskt modifierade RSVs känslig. Här, detalj vi ett protokoll för att skapa två typer av rekombinant HRSV, respektive uttrycker RSV-GFP eller RSV-M2-1-GFP. I detta protokoll beskriver vi de transfection villkor behövs för att rädda de nya rekombinanta virus, liksom deras förstärkning få viral bestånd med hög titer, lämpade för reproducerbara experimenterande. Byggandet av omvänd genetik vektorer beskrivs i sig inte här. Vi beskriva metoder för optimal skörd och frysning av viral bestånd. Den mest exakta metoden att kvantifiera infektiösa viruspartiklar förblir plack assay. Celler infekterade med seriespädningar av analyserade upphängning och inkuberas med ett överlägg som förbjuder diffusionen av fria viruspartiklar i supernatanten. Under sådana förhållanden kommer viruset endast infektera sammanhängande celler bildar ett ”plack” för varje inledande infektiös partikel. I konventionella RSV titrering analysen, är plack avslöjade genom immunfärgning och räknade under mikroskopisk observation. Denna metod är dyra och tidskrävande. Här har vi beskrivit ett mycket enkelt protokoll för en RSV plack analys använder mikrokristallin cellulosa overlay som gör att bildandet av plack som är synliga för blotta ögat. Vi visar hur RSV-GFP kan användas till åtgärd RSV replikering och, således, att kvantifiera effekterna av antivirala läkemedel. Kombinera omvänd genetik och levande bildteknik, visar vi hur RSV-M2-1-GFP tillåter forskare att visualisera M2-1 i levande celler och följa dynamiken i intracellulära viral strukturer, såsom IBs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. materiella beredning
- Köpa cell media (minskad serum media, minsta nödvändiga media [MEM], 10 x MEM och Dulbecco ändrade örnens medium [DMEM]), transfection reagens och mikrokristallin cellulosa (se Tabell för material).
- Få följande vektorer för omvänd genetik: den genomiska vector(s) och uttryck vektorer kodning N proteinet och de polymeras komplexa proteinerna. Genomisk vektorer innehåller full cDNA genomet av RSV-GFP (p-RSV-GFP) och 1GFP-RSV-M2 (p-RSV-M2-1GFP) nedströms från Promotorn bacteriophage T7 RNA-polymeras (T7 pol). Uttryck vektorer (betecknas som p-N, p -P, p-L och p-M2-1) innehåller den kodande sekvensen av N, P, L eller M2-1 nedströms den T7 pol (se Rincheval et al.12 och Rameix-Welti et al.21 för detaljer om plasmiden konstruktioner).
- Förbered för en cellkultur i en steril miljö och för transfection och infektion. Användning DMEM med 2 mM L-glutamin kompletteras med 10% fetalt kalvserum (FCS), 1 000 enheter/mL penicillin och 1 mg/mL streptomycin (eller utan antibiotika) och MEM med 2 mM L-glutamin kompletteras med 0%, 2% eller 10% FCS 1 000 enheter/mL penicillin och 1 mg/mL streptomycin, betecknas som ”komplett medium” i följande protokoll.
- Skaffa BSRT7/522 celler och göra bestånd i komplett medium kompletteras med 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) på 1 till 2 x 106 celler/mL. Bevara de cell-lagren i flytande kväve. Få HEp-2 celler. Kultur BSRT7/5 i komplett DMEM och HEp-2 celler i komplett MEM vid 37 ° C och 5% CO2 i en steril miljö.
- Bered en 10 x RSV bevarande (0,5 M HEPES och 1 M MgSO4 [pH 7,5] i vatten) i en steril miljö.
- Skaffa en inverterad fluorescens Mikroskop kompatibel med GFP fluorescens mätningar och kompatibel med levande imaging om det är nödvändigt att övervaka en infektion. Hämta en microplate reader kompatibel med GFP fluorescens mätningar för kvantitering av RSV-GFP replikering.
2. räddning och första passagen av rekombinanta Virus
Obs: Utför alla följande steg i en steril miljö, använda en klass II säkerhetsskåp.
- Dagen innan transfection, gör en suspension av BSRT7/5 cell linje på 5 x 105 celler/mL i komplett medium. Fördela 2 mL cellsuspension per brunn i en 6-bra platta. Förbereda en brunn per virus som kommer att räddas och en extra väl för negativ kontroll. Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2. Kontrollera att cellerna är på en 80 – 90% confluence nästa dag.
- Frigöra den omvänd genetik vektorer (från steg 1.2) p-RSV-GFP och p-RSV-M2-1-GFP, samt p-N, p -P, p-L och p-M2-1. Mix, för varje virus att rädda, 1 µg p-N och p -P, 0,5 µg av p-L, 0,25 µg p-M2-1 och 1,25 µg p-RSV (GFP eller M2-1 GFP) i ett rör.
Obs: Olika uttryck vektorer för N, P, L och M2-1 kan användas; förhållandet mellan proteinerna har dock upprätthållas. Utföra den negativa kontrollen genom att ersätta p-RSV vektorn med en tom vektor. -
Gå vidare till transfection, följande transfection reagens tillverkarens protokoll (se tabell för material).
- Tillsätt 250 µL minskade serum medium i blandade vektorer. I en annan tube, späd 10 µL av transfection reagens i 250 µL av minskade serum medium. Försiktigt vortex både rör och vänta i 5 min. Blanda innehållet i både rör och vänta i 20 min i rumstemperatur.
- Skölj BSRT7/5 cellerna med 1 mL minskade serum medium och fördela 1,5 mL MEM med 10% FCS utan antibiotika per brunn. Om nödvändigt, inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 tills ruvning beskrivs i steg 2.3.1 är slutförd.
- Tillsätt 500 µL av transfection mixen bereddes i steg 2.3.1 till en brunn när 20 min inkubationstiden är över. Placera cellerna i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 i 3 dagar. Ändra inte odlingssubstratet celler under transfection.
- Iaktta god Jordbrukarsed fluorescens (excitation vid 488 nm) och utsläpp vid 515 – 535 nm under en inverterad fluorescens Mikroskop 20 x förstoring 1 x per dag för att övervaka rescue effektivitet, med hjälp av GFP filtrera.
- Den andra dagen efter transfection, utsäde cellerna för första passagen av de rädda virus. Bered en suspension av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplett medium. Fördela 2 mL cellsuspension per brunn i en 6-well platta (en brunn per virus räddning och en negativ kontroll).
- På den tredje dagen av transfection, scratch celler i varje brunn Skyltens transfekterade BSRT7/5 6-well, använda en annan skrapa för varje brunn. Överföra varje väl innehåll (celler och supernatanten) till en steril 2 mL mikrocentrifug rör. Vortex varje rör kraftigt i minst 30 s att släppa räddade viruset från cellmembranen.
Obs: Detta motsvarar tidens 0 (P0) räddade viruset (figur 1). -
Använd färska viral P0 suspensionen för att utföra den första förstärkningen av de rädda virus.
- Ta bort odlingssubstratet från HEp-2 6-väl plattan seedade dagen innan (se steg 2.5) och snabbt tillsätt 500 µL av P0 upphängning (från steg 2,6) per brunn. Placera HEp-2 plattan vid 37 ° C i en se-såg rocker för mjuka agitation för 2 h.
- Ta bort och kassera den 500 µL av inokulatet och tillsätt 2 mL av MEM med 2% FCS. Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 i 3 dagar. Detta kommer att producera den första tidens (P1) räddade virus (figur 1).
- Tillsätt 1/10 av volymen 10 x RSV bevarande lösning (0,5 M HEPES och 1 M MgSO4 [pH 7,5]) i den återstående P0-suspensionen (från steg 2,6). Vortex mikrorör kraftigt i 5 s och alikvot innehållet i kryogena rör märkta med alkoholresistent Taggar. Sänk rören för minst 1 h i alkohol förhandskyld vid-80 ° C och lagra dem vid-80 ° C.
- Titrera P0 beståndet (se steg 2,6) av varje räddade virus (se avsnitt 4 för mikrokristallin cellulosa titrering).
- Iaktta god Jordbrukarsed fluorescens (excitation vid 488 nm) och utsläpp vid 515 – 535 nm HEp-2 celler infekterade med P0 fjädring under en inverterad fluorescens Mikroskop 20 x förstoring 1 x per dag för att övervaka infektionen. Observera i brightfield Mikroskop uppkomsten av små syncytia och cell avlossning som återspeglar den RSV cytopathogenic effekten (CPE) (se figur 2).
- Observera att rädda har misslyckats om varken fluorescens eller CPE syns efter 2 – 3 dagar.
- Samla in första passagen (P1) på dag 3 eller 4 som beskrivs i steg 2,6. I korthet skrapa cellerna, samla in celler och supernatanten tillsammans, vortex dem, lägga till bevarande lösningen som beskrivs i steg 2,8, alikvotens provet och frysa den.
- Titrera (se avsnitt 4 för titrering analysen) och förstärka första passagen (se avsnitt 3 för förstärkning).
3. förstärkning av de rädda virus
Obs: Följande protokoll beskriver förstärkningen av de rädda virus i en 75 cm2 kolv. Anpassa kolv storlek till den volym som behövs och krävs multiplicityen av infektion (MOI). Tabell 1 anger volymer för olika kolvar. Utför alla följande steg i en steril miljö i en klass II säkerhetsskåp.
- Bered en suspension av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplett medium, dagen innan förstärkning. Fördela 15 mL cellsuspension per 75 cm2 kolv och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2kolvar. Förbereda en kolv per virus att förstärka.
- Dagen efter början av ruvning, kontrollera att cellerna är 80 – 100% konfluenta.
- Späd den virala avstängning från steg 2.12 i MEM utan FCS att erhålla en 3 mL suspension på 50.000 PFU/mL (motsvarande en MOI av 0,01 PFU/cell).
- Ta bort mediet och snabbt lägga till 3 mL viral suspensionen. Placera kolven vid 37 ° C i en se-såg rocker för mjuka agitation för 2 h.
- Ta bort och kassera inokulatet och tillsätt 15 mL MEM med 2% FCS. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 2 – 4 dagar.
- Kontrollera Cellmorfologi och god Jordbrukarsed fluorescens (excitation vid 488 nm) och utsläpp vid 515 – 535 nm under en inverterad fluorescens Mikroskop 20 x förstoring för att uppskatta rätt tid att skörda virus. Observera att detta är vanligt när 50 – 80% av lagrets HEp-2 celler är fristående på grund av RSV CPE som uppstår mellan 48 och 72 h angripen (PI) (se figur 3).
- Skrapa alla celler med hjälp av en cell-skrapa. Samla både celler och supernatanten och överföra dem till en 50 mL centrifugrör.
- Lägg till 1/10 av volymen av 10 x RSV bevarande lösning (0,5 M HEPES och 1 M MgSO4 [pH 7,5]). Vortex rören kraftigt i 5 s och förtydliga suspensionen genom en 5 min centrifugering vid 200 x g.
- Överför supernatanten till en 50 mL tub. Vortex kort och alikvot suspensionen i kryogena rör märkta med alkoholresistent Taggar. Sänk ner rören i förhandskyld-80 ° C alkohol för minst 1 h och lagra dem vid-80 ° C.
- Låsa upp en av de alikvoter att titrera viral suspensionen (se avsnitt 4).
4. plack titrering test
- Förbereda 12 brunnar för titrering dagen innan titrering analysen utförs (sex brunnar måste kunna titrera en tub virus). Kärna ur brunnarna med 1 mL av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplett medium.
-
Nästa dag, förbereda en steril mikrokristallin cellulosa suspension (2,4% [volymvikt] i vatten) (se tabell för material).
- Skingra 2,4 g mikrokristallin cellulosa pulver i 100 mL destillerat vatten med en standard magnetisk omrörare, tills fullständig upplösning av pulvret (oftast 4 – 12 h). Autoklav suspensionen vid 121 ° C i 20 min och förvara den i rumstemperatur före användning.
Obs: Under sådana förhållanden är suspensionen stabil för 1 år. - Efter öppnandet lösningen i en steril miljö, lagra den på 4 ° C i 6 månader. Blanda alltid suspensionen före användning (genom handen skakar eller vortexa) för att se till att det är homogent.
- Skingra 2,4 g mikrokristallin cellulosa pulver i 100 mL destillerat vatten med en standard magnetisk omrörare, tills fullständig upplösning av pulvret (oftast 4 – 12 h). Autoklav suspensionen vid 121 ° C i 20 min och förvara den i rumstemperatur före användning.
- Förbereda 2 x MEM i en steril miljö. Späd kommersiella MEM 10 x med sterilt vatten och lägga till L-glutamin, 1 000 enheter/mL penicillin och 1 mg/mL streptomycin. Skaka utspädningen kraftigt och förvara den vid 4 ° C.
Obs: Utför steg 4,4 – 4.10 i en steril miljö använder en klass II säkerhetsskåp. - Förbereda sex rör som innehåller 900 µL av MEM utan FCS per virus titreras (titrering rören). Tina de virus alikvoter, vortex dem kraftigt i 5 s och överföring 100 µL till första titreringen tube.
- Utföra en tiofaldig utspädning 6 x, enligt följande. Tillsätt 100 μL av virus till 900 μL av medium i första tuben, lägga locket på tuben, och blanda innehållet genom vortexa för några sekunder. Ändra spetsen på pipetten, tillsätt 100 µL av den första utspädningen till 900 µL av medium i det andra röret, lägga locket på röret och vortex. Upprepa proceduren tills sjätte röret.
Obs: Det är mycket viktigt att ändra spetsen för varje spädning. - Skriv viruset namn och vik spädningarna på HEp-2 12-väl plattorna. Lägg till en markering för att matcha plattan och omslaget eftersom de kan avskiljas under färgning (steg 4,9). Ta bort mediet från plattorna och fördela 400 µL en utspädning per brunn. Inkubera plattorna vid 37 ° C i 2 h, för virus adsorption.
Obs: Ändra pipettspetsen mellan varje inokulum eller fortsätta från lägsta till högsta koncentrationen med samma tips. Inokulera en begränsad serie av plattor (1 till 2) samtidigt för att undvika cellerna torkning. -
Förbereda överlägget mikrokristallin cellulosa under virus adsorption (temporeframställning). För att få 100 mL av overlay, blanda 10 mL 2,4% mikrokristallin cellulosa suspension, 10 mL 2 x MEM och 80 mL MEM med 2% FCS.
- Justera pH-värdet av 2 x MEM till cirka 7,2 med en steril natriumbikarbonatlösning på 7,5%, efter indikatorn färg. Tillsätt mikrokristallin cellulosa fjädringen och MEM och blanda kraftigt.
- I slutet av 2 h ruvning, tillsätt 2-3 mL av overlay till varje brunn av 12-väl plattorna utan att ta bort inokulatet. Var noga med att undvika kontaminering av angränsande brunnarna med hög viral titer inoculums. Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 i 6 dagar. Flytta inte plattan och inte flytta inkubatorn under inkubation.
-
Fortsätt att färga cellerna, med kristallviolett lösning (8% kristallviolett [v/v], 2% formaldehyd [v/v] och 20% etanol [v/v] i vatten).
- Skydda ytan med arbete av biosäkerhet skåp med en plåt (kristallviolett starkt färgar ytbehandlar).
- Skaka försiktigt plattorna att ta av överlägget mikrokristallin cellulosa. Ta bort supernatanterna och tvätta cellerna 2 x med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Hantera plattorna en efter en för att undvika cellerna torkning. Tillsätt 1-2 mL av kristallviolett lösningen och vänta 10-15 min. ta bort den lösning som kan återanvändas för efterföljande plattan färgning.
- Doppa plattorna och lock i färska blekmedel i några sekunder och sedan tvätta dem med kranvatten. Observera att tallrikar och täcker är dekontamineras av blekmedel.
- Sätt plattorna och lock på hushållspapper och låt dem torka. Torka plattorna vid en omgivningstemperatur efter sköljning i vatten och förvara dem i rumstemperatur. För lång lagringsperioder (månader), hålla plattorna skyddas från ljus att skydda färgen. Observera att om cellerna förlorar deras färg, de kan färgas igen med kristallviolett.
- Beräkna virus titrar. Räkna plack i brunnarna av torr pläterar, som är synliga för blotta ögat. Kontrollera att antalet plack av de olika spädningarna är sammanhängande (faktor 10 mellan varje utspädning). Välj den brunn som plack är lättast att räkna. Bedöma antalet plack kontra inokulum volymen och utspädning.
Obs: På exemplet i figur 4, räknas 21 plack med 10-5 utspädning. Dessa motsvarar en titer av
5. användning av HRSV-GFP rekombinanta Virus att övervaka virusreplikation i celler behandlas med små störande RNA eller antivirala medel
Obs: Utföra alla steg utom 5.1 och 5.2.5 i en steril miljö använder en klass II säkerhetsskåp.
-
Övervaka effekten av cellulära nedtystning på RSV multiplikation
Obs: Protokollet transfection beror på reagens (se Tabell för material).- Förbereda 96 brunnar för god Jordbrukarsed mätning. Två dagar innan analysen, för med tanke på små störande RNA (siRNA), bereda en lösning av minskade serum media som innehåller siRNA vid en koncentration på 100 nM och en siRNA transfection reagens utspätt till 1/500. Inkubera lösningen för 30 min i rumstemperatur.
- Lägga till 25 µL av lösningen i brunnar i plattan beredd i 5.1.1 (i tre exemplar). Utsäde brunnarna med 75 µL av en suspension av A549 celler på 4 x 105 celler/mL i komplett medium utan antibiotika för att få en sista cell koncentration på 3 x 105 celler/mL. Inkubera plattan för 48 h vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: Den slutliga siRNA koncentrationen är 25 nM och slutliga transfection reagens volymen är 0,5 µL per brunn). - Infektera cellerna som följer. Ta bort mediet från brunnarna. Tillsätt 100 µL av RSV-GFP suspensionen på 50.000 PFU/mL och Inkubera under 2 timmar vid 37 ° C och 5% CO2. Ta bort viral fjädringen och tillsätt 100 µL av DMEM med 2% FCS och utan fenolrött. Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2.
- På 24 h och 48 h p.i., mäta fluorescensen, med en spectrofluorometer ställa att magnetiseringen och utsläpp våglängder av 488 och 520 nm, respektive (fluorescens uttrycks i relativa fluorescens). Använda noninfected A549 celler som standarder för fluorescens och bakgrund nivåer.
Obs: Cellerna måste vara fast med 4% paraformaldehyd (PFA) innan du mäter dem utan locket på plattan.
-
Bedömning av drogen hämning med RSV-GFP
- Förbereda 96 brunnar för god Jordbrukarsed mätning. Dagen innan analysen, utsäde brunnarna med 100 µL av en suspension av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplett medium utan fenolrött.
- Bered en seriell utspädningen av de testade droger (AZ4316 i det här exemplet) i MEM kompletteras med 2% FCS och antibiotika (50 µL per brunn). Förbereda en viral suspension på 10.000 PFU/mL i MEM utan stromal vaskulär faktor (SVF) och fenolrött (50 µL per brunn).
- Ta bort mediet från 96 brunnar HEp-2 tallrik och tillsätt 50 µL av den drog suspensionen och 50 µL av den virala suspensionen (i tre exemplar). Utföra en mock infektion parallellt som kontroll.
Obs: De drog utspädning och viral suspension kan blandas innan du lägger dem på cellerna, eller de kan läggas sekventiellt. - Inkubera plattan för 48 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Mäta den fluorescens, med en spectrofluorometer som beskrivs i steg 5.1.4. Använda mock-infekterade HEp-2 celler som standarder för fluorescens bakgrundsnivåerna.
6. karakterisering av M2-1 Localization In Vivo med RSV-M2-1-GFP rekombinanta Virus
Obs: Utför steg 6.1 och 6.2 i en steril miljö, använda en klass II säkerhetsskåp.
- Bered en suspension av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplett medium. Utsäde 1,5 mL cellsuspension i en 35 mm petriskål diffusionskoefficient till CO2 och har anpassats för live imaging.
- Utför infektionen dagen efter sådd med RSV-M2-1-GFP virus på MOI 1, som beskrivs i steg 3.3 – 3,5 (ta bort mediet, tillsätt 500 µL 1 ml av inokulatet, och inkubera provet vid 37 ° C medan du försiktigt skaka för 2 h; ta bort inokulatet och tillsätt 1,5 mL MEM med 2 % FCS). Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 i önskad tid (IBs startar visas från 10 h p.i.).
- Förvärma inkubation kammaren av ett inverterat Mikroskop med 40 x 100 x mål vid 37 ° C, före utsläppande petriskål som innehåller de infektera cellerna på scenen. Öppna CO2 leverans och vänta för fokus stabilisering.
- Utföra imaging med GFP-kompatibel filter, under en låg excitation intensitet och bild frekvens (från 1 till 0.1 bild per min) för att minimera fototoxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta arbete beskrev vi ett detaljerat protokoll för att producera rekombinant RSV virus uttrycker en fluorescerande protein (figur 2). PRSV-GFP introducerades den GFP-genen mellan P och M generna, som beskrivs för Cherry-genen i tidigare publicerade arbete21. I den pRSV-M2-1-GFP, M2 genen var lämnas orörd och en extra gen som kodar för M2-1-GFP sattes in mellan SH och G gener12. Det första steget, motsvarande till undsättning av viruset i BSRT7/5 celler, visas i figur 2A. Små kluster av grön fluorescerande celler var synliga 72 h posttransfection i brunnar motsvarar RSV-GFP och RSV-M2-1-GFP räddning. Fluorescerande signalen kunde observeras i både cytoplasma och kärnor i RSV-GFP-infekterade celler, motsvarar uttrycket av den gratis GFP. Däremot i RSV-M2-1-GFP räddning, kunde små fluorescerande cytoplasmiska punkter observeras, motsvarar M2-1-GFP ackumulering i IBs. Vanligtvis iakttas ingen CPE (syncytia, fristående celler) i detta steg. Omvänt, under det andra steget, motsvarande virus amplifiering (första passage) på HEp-2 celler, CPE var synlig i infekterade celler på 72 h p.i. (figur 2B). Figur 3A B visar stark CPE av RSV-infektion, kännetecknas av stora syncytia, fristående eller inte, och många flytande celler. Både syncytia och celler utställda ljusa grön fluorescens. Figur 3A visar utvecklingen av cytopatisk effekt mellan 24 och 72 h p.i. i celler som infekterats av RSV-M2-1-GFP-viruset. Några spridda fluorescerande celler var synlig vid 24 h p.i. utan en detekterbar CPE. Små syncytia (kluster av fluorescerande celler) och några fristående celler/syncytia börjat dyka upp på 48 h p.i. stor fluorescerande syncytia och flytande celler var klart synliga på 72 h p.i.
Bilder av plack titrering test och viral titrar motsvarar hela processen av RSV produktion visas i figur 5. Utför analysen plack på den negativa kontrollen, transfekterade med endast uttryck plasmidsna av N, P, L och M2-1, avslöjade inga plack med lägsta utspädning. De titrar som erhållits från de transfekterade cellerna förväntades vara över 100 PFU/mL om undsättning var effektiv, som visas i figur 5. Sedan var titrarna ökat passagerna, att nå 106– 107 PFU/mL vid passage 1 eller 2. Observera att de virala titrarna var liknande mellan de två rekombinanta virus.
Cellerna var transfekterade med siRNA inriktning mRNA av en viral protein (N) eller två cellulära proteiner (inosin-5'-monofosfat dehydrogenas [IMPDH] och glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas [GAPDH]). Cellerna var också transfekterade med nontargeting siRNA. Figur 6 visar övervakningen av RSV multiplikation med RSV-GFP virus på siRNA-behandlade celler. En stark signal om GFP observerades (figur 6A) och uppmätt (figur 6B) på kontroll celler transfekterade med nontargeting siRNA eller celler transfekterade med siRNA mot GAPDH mRNA. Däremot minskade GFP uttrycket i infekterade celler som uttrycker siRNA inriktning N eller IMPDH. Observera att vi verifierat att GFP fluorescerande signalen i RSV-GFP-infekterade celler på 48h p.i. var korrelerade med den virala dosen som tidigare visats för en liknande rekombinant RSV uttrycker Cherry (RSV-Cherry)21. För att bedöma drog effektivitet på RSV multiplikation, var HEp-2 celler infekterade med RSV-GFP för 48 h i närvaro av olika läkemedelskoncentrationen. Vi observerade en stark minskning av signalen GFP, som nådde bakgrundsljud (det fanns en signal som observerats på oinfekterade celler), i närvaro av ett ökat narkotikamissbruk koncentration, som visas i figur 7. Observerade IC50 för AZD4316 var ca 4 nM, liknar publicerade EC50 på cirka 2 – 40 nM mot olika HRSV stammar23. Analys av dynamiken i IBs och IBAGs i levande celler, tack vare RSV-M2-1-GFP, visas i figur 8 och figur 9 (och film 1 och film 2). IBs visas som mobila sfäriska strukturer kunna säkring, bildar en större sfäriska inkludering. IBAGs är mycket dynamisk. De genomgår kontinuerlig montering-demontering cykler med bildandet av små IBAGs som växer, säkring i stora IBAGs, och sedan försvinner.
| Platta eller kolv | HEp-2 celler att vara seedad dagen innan | Medelhög volym (mL) | Virus inokulum volym (mL) |
| 150 cm2 kolv | 15 x 106 | 30 | 5 |
| 75 cm2 kolv | 7,5 x 106 | 15 | 3 |
| 25 cm2 kolv | 2,5 x 106 | 5 | 1 |
| 6-well plate | 1 x 106 | 2 | 0,5 |
Tabell 1: Antal celler och inokulum volym att använda i olika kolvar.
Figur 1: Schematisk bild av räddnings- och förstärkning steg. Transfection vektorns uttryck av N, P, L, M2-1 och RSV antigenomic RNA i BSRT5/7 celler (räddning). Uttryck av antigenomic RSV RNA och mRNA av N, P, L och M2-1, av den T7 RNA-polymerasen. N, P, L och M2-1 proteinerna replikera och transkribera genomisk RNA, inleda en viral multiplikation cykel. Nya viruspartiklar produceras och multiplicera, ger upphov till P0. Viruset skördas från räddning (P0) förstärks sedan på HEp-2 celler att producera en högre titer viral suspension (P1) (förstärkning). Detta förstärks sedan för att få viral bestånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CPE och mönstret av fluorescens observeras under räddningsaktionen av RSV-GFP och RSV-M2-1-GFP. (A) BSRT5/7 celler var transfekterade med omvänd genetik vektorer som anges, och faskontrast och fluorescens bilder togs på 72 h posttransfection. Den negativa kontrollen (Neg Ctrl) motsvarar celler transfekterade med uttrycket vektorerna av N, P, L och M2-1 utan omvänd genetiska vektorn. (B) HEp-2 celler var infekterade med viruset skördas från transfekterade BSRT5/7 celler (noll passagen, 72 h posttransfection) och bilder togs 72 h avsett. Bilderna som visas är representativa områden; Skalstapeln = 100 µm. Det inramade området omsluter celler visas i förstoring; Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Evolution av CPE och fluorescensen observerats under förstärkning av rekombinant RSV. HEp-2 celler smittades på en MOI av 0,01 PFU och celler för 72 h med första passagen av (A) RSV-M2-1-GFP eller (B) RSV-GFP. Fas-kontrast och fluorescens bilder togs på 24 h, 48 h och 72 h avsett. Bilderna som visas är ett representativt område; Skalstapeln = 100 µm. Det inramade området omsluter celler visas i förstoring; Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: bestämning av RSV titer med plakett analys. (A) resultaten av plack titrering analysen i en 12-bra platta. Sex brunnarna infekterade med seriespädningar av en viral lager visas. Spädningar anges i en 10-logaritmen. Celler som smittats med de tre första utspädningarna är alla fristående. Plack siffrorna observerats med de 10-4, 10-5, och 10-6 utspädningar är konsekvent. (B) Illustration av plack uppräkning (gula siffror). Den gröna stjärnan visar repor på det cell-lagret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: titrering av en räddade och förstärkt virus. Plack fenotyper av RSV-GFP och RSV-M2-1-GFP på olika passager analyseras på HEp-2 celler i en 12-well platta (bilderna visar helheten av brunnarna). Titrarna av de efterföljande avsnitt visas i tabellen. Representativa uppgifter visas. Utspädningar av viral bestånden anges i en 10-logaritmen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: hämning av RSV-GFP uttrycket av siRNA inriktning RSV N eller IMPDH. A549 celler behandlades med kontroll nontargeting siRNA (NT) (ljusblå bar) eller siRNA inriktning GAPDH (blå stapel), RSV N (orange bar) eller IMPDH2 (grön bar) för 48 h och då infekterad med RSV-GFP på en MOI av 0,05 PFU/cell. Den gröna fluorescensen lästes på 48 h angripen. (A) representativa bilder av RSV-GFP-infekterade celler vid 48 h p.i., behandlas med siRNA som kan ses på bilderna. Skalstapeln = 100 µm. (B) uppgifterna är det medelvärde ± SD av två oberoende experiment som utförs i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: hämning av RSV-GFP multiplikation av AZD4136 sammansatta. HEp-2 celler i 96 brunnar var infekterade med RSV-GFP på en MOI av 0,05 PFU/cell i närvaro av seriespädningar av AZD4316 sammansatta eller kontroll DMSO. Den gröna fluorescensen lästes på 48 h p.i. Data är medelvärde ± SD av två oberoende experiment som utförs i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: analys av dynamiken i IBs genom att spåra det fluorescerande proteinet M2-1-GFP i HEp-2-infekterade celler av time lapse mikroskopi. På 18 h p.i., var celler avbildade varje 5 min för 5 h med fluorescens Mikroskop, i en kammare som värms upp vid 37 ° C. IBs är fluorescerande (grön) eftersom de värd M2-1-GFP och atomkärnor färgas med Hoechst (blå). De vita pilarna visar IBs genomgå fusion. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 9: analys av dynamiken i IBAGs i RSV-M2-1-GFP-infekterade celler av time lapse mikroskopi. På 18 h p.i., var celler avbildas med fluorescens Mikroskop, i en kammare som värms upp vid 37 ° C. Proteinet M2-1-GFP var visualiserat av grön fluorescens. De vita pilarna visar IBs som genomgår en fusion av IBAGs. Skalstapeln = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Film 1: In vivo analys av dynamiken i IBs i RSV-M2-1-GFP i HEp-2-infekterade celler. På 18 h p.i., var celler avbildade varje 5 min för 5 h med fluorescens Mikroskop, i en kammare som värms upp vid 37 ° C. Skalstapeln = 10 µm. Den resulterande filmen visar 7 bildrutor/s (fps). Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Movie 2: In vivo analys av dynamiken i IBAGs i RSV-M2-1-GFP-infekterade celler. På 18 h p.i., var celler avbildade varje 5 min för 3 h och 40 min med fluorescens Mikroskop, i en kammare som värms upp vid 37 ° C. Skalstapeln = 2 µm. Den resulterande filmen visar 4 fps. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en metod för räddning av rekombinant RSVs från fem plasmider och deras förstärkning. Förmågan att manipulera genomet hos virus har revolutionerat virologi forskning för att testa mutationer och uttrycka en extra gen eller en taggad virala protein. RSV har vi beskrivs och används som ett exempel i den här artikeln är ett virus som uttrycker en reporter gen, RSV-GFP (opublicerade) och uttrycker ett M2-1 protein smält till en god Jordbrukarsed tag12. RSV räddning är utmanande och kräver övning. Transfection effektiviteten är kritiska, beroende på ett klokt urval av transfection reagens och en tidigare optimering av protokollet transfection. Användning av celler som uttrycker den bacteriophage T7 pol är obligatorisk eftersom den viral cDNA placeras nedströms T7 pol arrangören i de flesta av omvänd genetiska vektorn. Ett alternativ är att uttrycka den T7 pol från vaccinia helper virus. Men användningen av celler som stabilt uttrycker den T7 pol undviker nödvändigheten av att separera de två virus och förhindrar eventuell inblandning av vaccinia med undsättning. Det är viktigt att utföra första passagen av den omvända genetiska (P0 till P1) utan att frysa inokulatet för att säkerställa maximal rescue effektivitet. Detta innebär att MOI inte kontrolleras. Dock vid detta steg fortfarande var titrarna mycket låg, vilket resulterar i en låg MOI för första passagen. För att erhålla RSV bestånd med hög smittsamma titrar (106– 107 PFU/mL), är det viktigt att vänta på en stark CPE och skrapa cellerna för att samla de viruspartiklar som bifogas cellerna. I denna studie ökade inte titrar efter 96 h p.i. Snabb kylning av viral suspensionen är viktigt att upprätthålla höga titrar. I stället kan för genom en nedsänkning i alkohol förhandskyld vid-80 ° C, detta även uppnås genom nedsänkning i en torris/etanol blandning eller i flytande kväve. Tillägg av bevarande lösningen kommer att säkerställa en längre stabilitet virus suspensionen vid-80 ° C. Lagring vid-80 ° C är kritisk, eftersom viruset kommer att snabbt förlora sin smittsamhet när lagras vid-20 ° C eller i flytande kväve. Vi beskrev RSV förstärkning på HEp-2 celler, som är den mest populära cellinje växa RSV, men det är också kunna växa effektivt på många andra cellinjer in vitro. Observera dock att tillväxten på Vero-celler kan leda till en förändring i G uttryck24.
Vi beskrivit ett mycket enkelt protokoll av plack titrering av RSV använder en mikrokristallin cellulosa överlägg. När det gäller alla titrering analyser är det känslig för kontaminering med hög titer suspensioner, som kräver noggrann manipulation. Konventionella RSV titrering analyserna använder agaros eller natriumkarboximetylcellulosa cellulosa (CMC) överlägg och kräver immunfärgning och mikroskopiska observationer för titerbestämning. Ett protokoll som använder immunodiffusion grade agar har beskrivits för den direkt visualiseringen av plack utan immunfärgning25. HEp-2 celler är dock mycket känsliga för en uppvärmd agar overlay, vilket försvårar detta protokoll att använda för flera virus titreringar (t.ex. en för varm överlägg förstör det cell-lagret); Däremot, när det är inte tillräckligt varmt, stelnar det efter den första platta spridningen. Användning av mikrokristallin cellulosa för ett plack assay har först beskrivits av Matrosovich et al. för en influensa A virus titrering assay26. Tack vare dess låga viskositet är överlägget mikrokristallin cellulosa lätt att dosera och ta bort från plattan brunnar, vilket gör den kompatibel med 96 brunnar. Det är således särskilt anpassas till serologiska studier och drog känslighetsanalyser. Observera att eftersom mikrokristallin cellulosa inte behöver värmas, drogerna kan enkelt införlivas i overlay. Det är dock viktigt att plattorna är helt stilla under ruvningen; annars bildar stora komet-formade foci i stället för runda plack. Plack uppenbarelse med kristallviolett är billig och enkel, men denna lösning är giftigt och har ska omhändertas korrekt. Återvinning av lösningen begränsar avfallsproduktionen. Dessutom är metoden känslig för enskiktslager cellskador som skulle visas som falska vita fläckar som inte är viral plack. Ett exempel visas i figur 4 (grön stjärna). För att förhindra denna bias, 1) celler måste hanteras med försiktighet för att undvika repor eller spolning av cell enskiktslager, 2) aspiration och dispensering alltid har gjort på samma plats att begränsa skadorna på ett känt område 3) falska vita fläckar kan identifieras Tack vare sin form (inte sfäriska), sina skarpa kanter och deras position. Vi använde först Avicel RC 581, som tidigare publicerade21,26. Men den RC 581 finns inte längre, och vi ersatt framgångsrikt det med RC 591. För att anpassa denna analys till andra cell/virus par, har koncentrationen av mikrokristallin cellulosa skall fastställas beroende på viruset och cellerna. För mycket mikrokristallin cellulosa kan vara giftiga för celler och leda till små plack, för lite kommer att leda till spridning av viruset i mediet.
Vi beskrivs två exempel på användning av RSV-GFP viruset att övervaka RSV multiplikation: i närvaro av ett antiviralt läkemedel eller när tysta en cellulär protein. Vi visat att god Jordbrukarsed signalen är korrelerad med viral multiplikation. Metoden presenteras här tillåter enkel utvärdering av viral multiplikation i realtid. Det gör forskare att avgöra enkelt IC50 för ett antiviralt läkemedel, som visas i figur 7. Viktigast av allt, är denna mätning anpassningsbar för användning i medium eller bredband, särskilt för screening av kemiska bibliotek. Detta reporter-uttryckande virus kan också vara användbart för att bedöma effekten på virus multiplikation av en modulering av cellulära proteiner. RNA-interferens är en biologisk process där en specifik mRNA bryts efter dess särskilt erkännande av siRNA, vilket minskar eller, helst avskaffa uttrycket av de motsvarande protein27. I de exempel som ges här, genom att övervaka GFP signalintensitet i RSV-GFP-infekterade celler, bedömde vi effekterna av den tystande av den virala nucleocapsid (N) mRNA eller mottagande IMPDH mRNA på RSV multiplikation. IMPDH2 är en purin biosyntetiska enzym som katalyserar en hastighetsbegränsande steget mot de novo biosyntesen av guanin nukleotider från IMP28. Det är thus en regulator av intracellulära guanin nukleotid poolen. IMPDH-hämmare, såsom ribavirin, utöva hämmande effekter på RNA virus, inklusive RSV-infektion29,30,31. Som visas i figur 6, försämrar hämning av IMPDH uttryck viral multiplikation som indikeras av minskningen av signalen GFP, imitera effekterna av ribavirin på RSV tillväxt. Jämväl, viral multiplikation nästan avskaffas i närvaro av siRNA inriktning viral N proteinet. Detta resultat förväntades eftersom siRNA inriktning proteinet N förväntades att förhindra viral nucleocapsid församling och har visat sig kraftigt försämra virusreplikation32. Administrationen av dessa siRNA av nebulisering hämmade efterföljande infektion av RSV hos friska vuxna33. Effekten av N eller IMPDH siRNA är specifika sedan hämning av GAPDH uttrycket, valt som en kontroll-gen, försämra inte viral multiplikation jämfört med den nontargeting siRNA. Observera att ingen cell toxicitet har identifierats i alla förhållanden. Dessa resultat sammantaget och validera den strategi som presenteras här, som kunde vara upp skalas till high-throughput screening med siRNA bibliotek eller andra knockout metoder, såsom CRISPR-Cas9-teknik34.
Rekombinanta virus uttrycker en fusion fluorescerande protein utgör kraftfulla verktyg att studera virusproteiner och viral strukturer dynamics. RSV uttrycker en fluorescerande M2-1-protein gör observationen av dynamiken av IBs och IBAGs. IBs, som kan betraktas som RSV viral fabriker, visas som sfäriska dynamiska strukturer. De har möjlighet att smälta samman att bilda större sfäriska strukturer (figur 8 och film 1). Dessa data tyder på att RSV IBs är flytande organeller, liknar vad som har beskrivits för rabies virus35. IBAGs representerar en subcompartment inuti IBs, där virala mRNA och M2-1 koncentrat, som genomisk RNA, nucleocapsid och polymerasen, finns bara i resten av IBs12. Video mikroskopi experiment visar att IBAGs är mycket dynamiska strukturer uppvisar flytande egenskaper (figur 9 och Movie 2). De kan betraktas som flytande fack följd vätska-vätska fasövergång.
Möjligheten att genetiskt manipulera virus är fortfarande ett verktyg för val att studera båda mekanismerna bakom deras multiplikation och deras känslighet för läkemedel. Omvänd genetik kan betraktas nu som en del av de ”klassiska” metoderna för virologi. Det är dock fortfarande mödosam för vissa virus, som RSV. Det är därför det här protokollet beskriver i detalj hur du framgångsrikt rädda och förstärka rekombinant RSVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Qin Yu från AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, för att tillhandahålla den AZD4316 drogen. Författarna är tacksam till Cymages plattform för tillgång till ScanR Olympus mikroskopet, som stöddes av bidrag från regionen Ile-de-France (DIM en hälsa). Författarna erkänner stöd från INSERM och Versailles Saint-Quentin universitetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
| BSRT7/5 | not commercially available | See reference 22. Buchholz et al. 1999 | |
| Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
| Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
| Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
| MEM (10x), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmids | not commercially available | See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014 | |
| See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 |
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 |
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
| Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
- DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
- DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
- Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
- Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
- Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
- Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
- Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
- Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
- Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
- Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
- Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
- Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
- Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
- Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
- Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
- Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
- Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
- Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
- Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
- Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
- McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
- Novina, C. D., Sharp, P. A.
- Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
- Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
- Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
- Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
- Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
- DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).
