Generation, amplifiering och titrering av rekombinant respiratoriska Syncytial virus

Användning av rekombinanta virus är en kraftfull teknologi både för att dechiffrera virusreplikationsmekanismerna och för att tillhandahålla utvecklingsplattformar för vacciner. Likaså är generering av viralt lager av god kvalitet avgörande för varje viral studie från den mest grundläggande forskningen till de tillämpade studierna. Räddning av rekombinanta virus, optimal skörd, frysning, och titrering av RSV-bestånd är kritiska metoder för alla virologiska studier.

De kan betraktas som traditionella men förblir känsliga och kräver särskild expertis. Dagen före transfektion, avbryta BSR-T7/5 celler i komplett medium på 0,5 miljoner celler per milliliter koncentration. Fördela två milliliter av cellupphängningen per brunn i en sex-brunnsplatta.

Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid tills de når 80-90% konfluency nästa dag. För att rädda varje virus, först blanda tinade omvänd genetik vektorer i ett rör, sedan vidare till transfection, efter transfection reagens tillverkarens protokoll. Nästa lägga 250 mikroliter av den reducerade serum medium till de blandade vektorer.

I ett annat rör, späd 10 mikroliter av detta transfektionsreagens i 250 mikroliter av det reducerade serummediet. Virvel försiktigt båda rören och vänta i fem minuter. Blanda innehållet i båda rören och vänta i 20 minuter vid rumstemperatur.

Under tiden skölj BSR-T7/5 celler med en milliliter av den reducerade serum medium och distribuera 1,5 milliliter av minsta väsentliga medier antibiotika gratis kompletteras med 10%fetala kalv serum per brunn. Inkubera vid 37 grader Celsius vid behov i 5%koldioxidmiljö. Efter 20-minuters inkubation, tillsätt 500 mikroliter av transfection mix i varje brunn.

Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid miljö i tre dagar. För att övervaka räddningseffektiviteten, observera vid GFP fluorescens under ett inverterat fluorescensmikroskop vid 20X förstoring en gång per dag. På den tredje dagen av transfektion, skrapa celler i varje brunn av transfected BSR-T7/5 sex-väl plattan.

Överför celler och supernatant av varje brunn i en steril två-milliliter microcentrifugrör. För att frigöra det räddade viruset från cellmembranen, virvel varje rör kraftigt i minst 30 sekunder. För den första förstärkningen av de räddade virusen, ta först bort odlingsmediet från HEp-2-plattan som är seedade dagen innan, tillsätt sedan snabbt 500 mikroliter per brunn av den färska passage-zero viral suspension.

Placera HEp-2-plattan på 37 grader Celsius på en gungbräda rocker för mjuk agitation i två timmar. För att producera den första passagen av de räddade virusen, kassera 500 mikroliter av inokulat och tillsätt två milliliter MEM med 2%FCS. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid i tre dagar.

För att övervaka infektionen under en inverterad fluorescens mikroskop vid 20X förstoring, observera GFP fluorescens av HEp-2 celler infekterade med passage-noll suspensionen en gång per dag. Under ett ljusfält mikroskop, observera utseendet på små syncytia och cell lossnar, som återspeglar RSV cytopatisk effekt. För att förstärka de räddade virusen, späd först ut den virala suspensionen av FCS-fri MEM för att få en tre-milliliter suspension vid 50, 000 PFU per milliliter, sedan ta bort mediet från HEp-2 kolven.

Tillsätt snabbt den tre milliliter viral suspension och inkubera kolven på 37 grader Celsius på en gungbräda rocker för mjuk agitation i två timmar. Nästa ta bort och kasta inokulat och tillsätt 15 milliliter MEM med 2%FCS. Inkubera vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid i två till fyra dagar.

För att uppskatta rätt tid att skörda virusen, kontrollera cellmorfologi och GFP fluorescens under en inverterad fluorescens mikroskop vid 20X förstoring. Observera att detta är oftast när 50%till 80%av HEp-2 celllagret lösgörs på grund av RSV cytopatisk effekt som uppstår mellan 48 och 72 timmar efter infektion. Nästa skrapa alla celler med hjälp av en cell skrapa.

Samla både cellerna och supernatanten tillsammans och för över dem till ett centrifugrör på 50 milliliter. Lägg till 1/10 av volymen för 10X RSV-bevarandelösningen. Vortexa rören kraftigt i fem sekunder och centrifug i fem minuter vid 200 gånger g för att klargöra suspensionen.

Överför supernatanten till ett 50-milliliterrör. Vortex kort och alikvot suspensionen i kryogena rör märkta med alkoholresistenta taggar. Sänk röret i färdigkyld, minus 80 grader-Celsius alkohol i minst en timme och förvara dem på minus 80 grader Celsius.

För att utföra en plakett titrering analys, först göra 2X minsta väsentliga medium genom att späda kommersiella 10X MEM med sterilt vatten och lägga L-glutamin, 1, 000 enheter per milliliter penicillin, och ett milligram per milliliter streptomycin. Skaka utspädningen kraftigt och förvara den i fyra grader Celsius och tillsätt sedan 900 mikroliter av FCS-fria MEM till sex rör. Tina viruset alikvoter och virvel dem kraftigt i fem sekunder.

För att göra serieutspädningar, först lägga 100 mikroliter av viruset till 900 mikroliter av mediet i det första röret. Sätt locket på röret och blanda dess innehåll genom att vortexa i några sekunder, tillsätt sedan 100 mikroliter av den första utspädningen till 900 mikroliter av mediet i det andra röret. Sätt locket på röret och virveln.

Upprepa denna procedur tills det sjätte röret. Skriv virusnamnet och de fullständiga spädningarna på HEp-2 12-brunnsplattorna. Lägg till ett märke för att matcha plattan och dess omslag eftersom de kan vara separerade under färgningen.

Ta bort mediet från plattorna och fördela 400 mikroliter med en spädning per brunn. Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i två timmar för virus adsorption. Under viruset adsorption, förbereda mikrokristallin cellulosa överlägg genom att först justera pH i 2X MEM till runt 7,2 med en steril natriumbikarbonat lösning på 7,5%efter färgindikatorn.

För att få 100 milliliter av överlagringen, tillsätt 10 milliliter 2X MEM, 10 milliliter 2,4%monokristallina cellulosa suspension, och 80 milliliter av MEM kompletteras med 2%FCS och blanda kraftigt. I slutet av den två timmar långa inkubationen, tillsätt två till tre milliliter av överlagringen till varje brunn av 12-brunnsplattorna utan att ta bort inokulatet. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid i sex dagar.

För att färga cellerna med kristallviolett lösning, skaka först försiktigt plattorna för att ta av mikrokristallin cellulosaöverlägg. Ta bort supernatanterna och tvätta cellerna två gånger med 1X PBS, tillsätt sedan en till två milliliter av kristallviolettlösningen och vänta 10 till 15 minuter. Ta bort lösningen, som kan återanvändas för efterföljande plåt-färgning.

Slutligen beräkna viruset titers som en bråkdel av antalet synliga plack i brunnarna i de torra plattorna och inokulat volym och utspädning. Utför en plakett analys på den negativa kontrollen, transfected med endast uttrycket plasmider av N, P, L och M2-1 visade ingen plakett på den lägsta utspädning. Titersna som erhölls från de transfected cellerna förväntades för att vara över 100 PFU per milliliter, om räddningsaktionen var effektiv.

Titersna ökade över passagerna för att nå en miljon till 10 miljoner PFU per milliliter vid passage ett eller två. Tack vare dessa fluorescerande virus kan hämning av RSV-uttryck genom att siRNA rikta in sig på proteinet N och det cellulära proteinet IMPDH lätt observeras och mätas. Däremot observerades och mättes en stark GFP-signal på kontrollceller som transfekterats med icke-inriktning på siRNA eller celler som transfekterades med siRNA mot cellproteinet GAPDH.

Jämväl dessa virus möjliggjorde enkel observation av hämningen av RSV multiplikation av en antiviral läkemedelsförening. Spåra fluorescerande proteinet M2-1 i HEp-2-infekterade celler visade IBs och IB-associerade granulat som mycket dynamiska strukturer. IBs observerades som mobila och sfäriska strukturer kunna säkring och att bilda större sfäriska inneslutningar.

IB-associerade granulat genomgick kontinuerlig montering-demontering cykler med bildandet av små IB-associerade granulat som växte, smält till stora IB-associerade granulat, och sedan försvann. Protokollet av plack titrering av RSV med hjälp av mikrokristallin cellulosa överlagring kan lätt anpassas till andra celler och/eller andra virus. Det kommer att kräva justering av koncentrationen av mikrokristallin cellulosa.