Neuroscience

軸索抑制と再生を研究するラットモデルにおける顔面神経外科

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/59224

Syed Ahmed Ali¹, Aaron W. Stebbins¹, John E. Hanks¹, Robbi A. Kupfer¹, Norman D. Hogikyan¹, Eva L. Feldman², Michael J. Brenner¹

¹Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Michigan Medicine, ²Department of Neurology, Michigan Medicine

Summary

このプロトコルは、様々な傷害パターンの記述を含む、ラットモデルにおける顔面神経手術への再現可能なアプローチを記述する。

Abstract

このプロトコルは、ラット顔面神経損傷モデルにおける軸索再生および阻害を研究するための一貫した再現可能な方法を記述する。顔面神経は、頭蓋内セグメントから経時的な経過まで、その全長に沿って操作することができる。神経損傷には、神経クラッシュ、切除、神経ギャップの3つの主なタイプの再生特性の実験的研究に使用されます。可能な介入の範囲は、神経の外科的操作、神経活性試薬または細胞の送達、および中央または末期器官操作を含む広大である。神経再生を研究するためのこのモデルの利点は、単純さ、再現性、種間の一貫性、ラットの信頼性の高い生存率、およびマウスモデルに対する増加解剖学的サイズが含まれる。その制限は、マウスモデルに対するより限定的な遺伝子操作とラットの最上級の再生能力を含み、顔面神経科学者は回復のためのタイムポイントを慎重に評価し、結果をより高い動物およびヒト研究に翻訳するかどうかを決定しなければならない。顔面神経損傷のラットモデルは神経再生の解釈および比較のための機能的、電気生理学的および組織形態学的変数を可能にする。それによって、人間の患者における顔面神経損傷の壊滅的な結果の理解と治療を促進するための大きな可能性を誇る。

Introduction

頭頸部および頸部領域における頭蓋神経損傷は、先天性、感染性、特発性、外因性、外傷性、神経学的、腫瘍学的、または^全身病因に二次的であり得る。頭蓋神経VII、または顔面神経は、一般的に影響を受ける。顔面神経機能障害の発生率は^、毎年10万人当たり20〜30人に影響を及ぼすため、有意である。顔面神経の主な運動枝は、側頭、接合、頬、辺縁、頸部、頸部、および頚部である。関係する枝に応じて、その結果は、口腔の無能またはよだれを垂らしたり、角膜乾燥、下垂に続く視野閉塞、ジサルトリア、または顔面非対称性²^2、3³を含むことができる。長期罹患率には、異なる顔の筋肉群の自発的収縮を試みたシンキネシス、または1つの顔の筋肉群の不随意運動の現象が含まれる。口腔内シンキネシスは、顔面神経損傷の後遺症として異常な再生の最も一般的であり、機能的障害、恥ずかしさ、自尊心の低下、および生活の質の低下を引き起こす^3。個々の枝への傷害は選択的に妥協される機能を指示する。

顔面神経損傷の臨床治療は、よく標準化されておらず、結果を改善するためのさらなる研究が必要です.ステロイドは急性顔面神経腫脹を緩和することができます, 一方、ボトックスは、シンキネティック運動の温度に有用である;しかし、開業医の軍備の主要な再建オプションは、神経修復、置換、または再アニメーション³^{3、4、5、6}⁴^,⁵を介した外科的介入^を⁶伴う。顔面神経損傷の種類に応じて、顔面神経外科医は多くの選択肢を利用し得る。単純な切除では、神経再吻合は有用であるのに対し、ケーブル移植片修復は神経欠損に適している。機能の回復のために、外科医は静的または動的な顔の再アニメーション手順のいずれかを選択することができる。顔面神経損傷とその後の修復の多くの場合、経験豊富な顔面神経外科医の手の中でも、最良の結果はまだ持続的な顔面非対称性と機能的妥協^7.

これらの最適でない結果は、顔面神経再生に関する広範な研究に拍車をかけた。関心の広いトピックは、神経修復技術の完成と革新、様々な神経再生因子の効果を決定し、およびシンキネシス^{8、9、10、11}⁹^,の長期的な結果と戦うのに役立つ特定⁸の神経阻害剤の可能性を評価する。¹⁰^,¹¹in vitroモデルは、成長促進因子または阻害因子の特徴を評価するために使用することができますが、この主題に関する真の翻訳研究は、翻訳可能な動物モデルを介して行われるのが最善です。

研究者は、羊などの大型動物と小動物モデル(マウス^12,13など)の両方を利用しているので、どの動物モデルを利用するかの決定は困難であり^得¹³る。大型動物モデルは理想的な解剖学的可視化を提供するが、その使用は、容易または容易に利用できない特殊な機器や人員を必要とします。さらに、効果を実証するための研究を行うことは、非常にコストが高く、潜在的に多くの科学センターの実現可能な範囲内にありません。したがって、小動物モデルが最も頻繁に利用される。マウスモデルは、顔面神経手術に関連する結果の数を評価するために利用することができます;しかし、神経の限られた長さは、大きなギャップ傷害¹⁴のような特定のパターンをモデル化する科学者の能力を制限することができます。

したがって、ラットマウスプロトタイプは、科学者が革新的な外科的処置を行うか、阻害または成長促進因子を利用し、幅広い結果パラメータにわたる効果を評価できる役馬モデルとして出現した。ラット顔面神経解剖学は、再現可能な方法で予測可能かつ容易に接近する。マウスモデルと比較して、その大きなスケールは、外科的欠陥の広い範囲のモデリングを可能にし、5 mmのギャップ^15、16^,¹⁶に至るまで。これにより、因子の局所配置、因子の神経内注入、およびアイソグラフトまたはブリッジ^,^,17、18、19、20、21、22、23を含む、欠陥部位での複雑な介入の適用をさらに可能にする。¹⁷^,¹⁸²³²⁰^,²¹^,²²^,¹⁹

ラットの従順な解剖学、および効果的な神経再生のためのその傾向の教義的性質は、傷害²⁴の前述の外科的パターンに応答して多くの結果尺度の収集を可能にする。²⁶^,ラットモデルを介して、顔面神経科学者は、免疫組織化学、ビブリサルパッドの動きを追跡し、眼閉鎖を評価することによって機能的な結果を介して傷害、神経および筋肉組織学的結果に対する電気生理学的反応を評価することができ、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡による微小および巨微小的な変化、とりわけ11、22、23、25、27、¹¹^,²²^,²³^,²⁵^,²⁹^27、^{27、 29。}^,^,したがって、以下のプロトコルは、ラット顔面神経および誘発され得る傷害パターンに対する外科的アプローチを概説する。

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Protocol

すべての介入は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに厳密に従って行われました。実験議定書は、実施前にミシガン大学の制度的動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認された。10週齢の成虫雌のスプレイグ・ドーリーラットを利用した。

1. 手術日の前

手術日の前に、殺菌された手術器具、鎮痛薬、麻酔薬、酸素の適切な在庫を確保してください。完全なリストについては、資料一覧を参照してください。

2. 術前セットアップ

少なくとも2人の個人(外科医と助手)のためのスペースを含む、十分な作業スペースを確保してください。
メモ:専用の手術台、麻酔装置のセットアップのためのスペース、滅菌およびバックアップ用品のための十分な記憶スペースが必要です。
手順中に使用するために操作顕微鏡を較正します。外科医がハンドル/ボタンの上に殺菌されたカバーを置くことによって顕微鏡およびズーム/フォーカスボタンのハンドルを調節する機能を持っていることを確認しなさい
注:ハンドル/ボタンの上に滅菌アルミニウム箔を利用しました。

3. 麻酔と準備

動物を麻酔室に入れ、1.8%のイオブルランと0.9 L/分酸素を介して全身麻酔を誘発する。
1. 自発呼吸の評価と、つま先ピンチに対する動物の悲惨な反応を評価することによって、意識の評価を通じて麻酔の十分な平面を確認する。
角膜刺激や乾燥から守るために、眼の潤滑剤を二国間に塗布してください。
カミソリまたは自動クリッパーで操作部位を剃ります。
1. この時点で、耳札またはテールラベル/マーキングを介して、ラットの識別方法を確立します。
術後疼痛に対する予防のために、動物の背中に沿って0.05mg/kgブプレノルフィンの皮下注射を投与する。

4. 外科的アプローチと傷害パターン

動物を手術台に移し、ノセコンを介してガスの流れを続ける。温暖化パッドが動物の下に置かれていることを確認し、その体温を維持するために無菌フィールド。
ラットのネックロールとして使用するために殺菌されたガーゼ(巻き上げ、テープで留めた)を置きます。これは外科分野の高められた露出を提供する。動物の適切な位置決めは、効率的な神経同定および解剖のために最も重要であることに注意してください。
処置のために動物の顔の皮膚を準備する。クロルヘキシジンまたはヨウ素系溶液を使用して、手術部位3xをスクラブし、70%エタノールと交互に、消毒を確実にする。
必要に応じて、外科的切開を計画し、マークします。前後方向にイプシラテリアを操作して、心房後皮膚の自然な折り畳みを決定します。
鋭い虹彩はさみまたは番号15刃を使用して、耳介後の折り目に4〜5mmの切開をファッション。これは、必要に応じて、手順の後半で拡張することができます。
即時皮下筋膜を通してぶっきらぼうに解剖し、露出を高めるためにマイクロワイトラナーレトラクタを置く。この領域には小口径血管がある可能性があることに注意してください;これらは、ヴァイトラナーレトラクターを介して優れたまたは劣った退避によって避けるのが最善です。
頭蓋骨の基部に沿って挿入に向かって劣った方向から優れた方向に移動する前の筋を識別します。
1. 挿入ポイントに沿って筋肉腹を通して穏やかに広がり、前部筋の腱を明らかにする。腱は、頭蓋骨の基部に固体挿入を有する筋肉から発せられるフィルム状の白いプロセスとして現れる。
前部筋と腱を同定した後、さらに筋肉の腹を引っ込めるためにワイトラナーレトラクターを調整します。なお、その後の露出領域は、顔面神経の主幹が位置する立体空間であることに注意してください。
注:この領域は、頭蓋骨の基部によって優れた内側に境界され、後方は前部の筋、外耳道による後心、および表在側側動脈を含む首の構造によって劣っている。
十分な暴露の後、頭蓋骨の基部から左回筋を出るジガスト筋肉の腱の下から劣って移動する顔面神経の主幹を特定する。神経は、動物の耳下腺腫性マセセリック筋膜に包まれた真珠の白いコードとして現れる。さらに神経を露出させる場合は、次の理由により注意を払ってください。
1. ストレッチ媒介性神経障害を防ぐために、積極的な解剖、または垂直な広がりを避けてください。
2. これは外科分野に中耳の植物相を導入する可能性がありますので、外耳道の上に薄い組織の違反を防ぐために積極的な後部および内側方向の解剖を避けてください。
3. 広い内側と劣った指示された解剖を通して表面的な側頭動脈を損傷することは避けてください。傷害は、活発で脈動性の出血によって識別されることに注意してください。
  1. 動脈が損傷した場合は、綿先端のアプリケーターまたは鉗子を介して滅菌ガーゼで迅速な圧力を加えます。止血剤または液体フィブリンシーラントは近接して配置することができます。動物は、流体安定化のために0.9%の無菌生理食動物の皮下注射を必要とする場合があることを覚えておいてください。
主幹を遠位にトレースし、神経に沿って下方向に解剖し、スティロマストイドの口腔の出口から遠位にする。
1. 元の切開を拡張して、神経とその枝の完全な露出を可能にします。これは術後シアロセレをもたらす可能性がありますので、耳下腺の破壊を避けるために注意してください。
目的の傷害パターンを以下のように誘導する。
1. クラッシュ傷害のために、滑らかな表面の宝石商の鉗子を使用して神経をしっかりとつかみ、^それを9.に圧縮する。適切なクラッシュ傷害を確実にするために、30 sの期間神経に一定の再現性の圧力を適用します。
2. 単純なトランセクションの場合は、神経の上に筋膜、または直下の上耳神経を細かい歯の鉗子でつかみ、鋭利なマイクロシザーを使用して、1回の切り口で所望のポイントで神経をきれいにトランセクトします。鉗子で神経に余分な牽引を避けるように注意してください。
3. 神経ギャップモデルの場合は、単純な横断損傷と同様の方法を使用して、所望の神経ギャップを作成します。綿状のアプリケータカットの滅菌シャフトを、所望の神経ギャップの長さに切り取り、動物間の傷害パターンの類似性を確保します。

5. 創傷閉鎖

滅菌生理的な状態で傷を灌漑し、滅菌ガーゼで乾燥させます。
吸収性縫合糸を持つ単純な、サブカットの方法で皮膚の縁を近似するか、傷の閉鎖のためにも許容される皮膚の接着剤または傷のクリップを使用する。1つの皮膚の端の深い表面的な咬傷を取り、その後、反対側の皮膚の端の表面的から深い一口を取ることによって、埋もれたステッチを置きます。

6. 術後回復

非ステロイド性抗炎症鎮痛薬(例えば、ブプレノルフィンの0.05mg/kgおよび0.5mg /kgカルプロフェン)の皮下注射を投与して術後疼痛制御を行う。動物の背中に沿って注射を置きます。
麻酔薬の投与を中止し、動物が酸素を1分間吸入できるようにします。
動物を(ヒートランプを介して)暖かく、偶発的な摂取を避けるために寝具材を欠いた無菌ケージに置きます。動物は通常、1〜2分以内に回復の兆候を示し、後肢機能の遅れた回復で、混乱しているように見えることがあることに注意してください。
動物を適切な住宅ユニットのケージに戻し、術後の日に術後鎮痛薬を投与#1痛みに対する継続的な予防を確実にします。
動物を1日2倍に監視して、栄養失調、角膜刺激、または外科的部位感染の兆候を評価し、適切な外科ログを維持する。
1. 有意な体重減少がある場合は、皮下の方法で0.9%の無菌生理食糸を投与する。
2. 動物のまばたき反射が再確立されるまで、潤滑眼軟膏を毎日塗布してください。

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Representative Results

最初の外科的処置に続いて、結果の測定の2つの主要なタイプがある:生きている動物の連続測定および動物を犠牲にする必要がある測定。連続測定の例としては、化合物筋肉作用電位測定³⁰などの電気生理学的アッセイ、レーザーアシストまたはビデオ撮影手段⁹を介した顔面筋運動の評価、あるいは蛍光トランスジェニック動物^31,32^,³²における顔面神経の再増殖の反復的な生画像化が含まれる。図1は、成人トランスジェニックThy1-GFPラットにおける顔面神経の主幹の生画像化を示す。最初のペスの分岐点に約2〜3mm遠位の限界下顎枝にクラッシュ傷害が行われている。MetaMorphイメージングソフトウェアを活用して、顔面神経の経過に沿った任意の時点で蛍光強度を定量化することができました。特に、傷害部位に近位および遠位の蛍光を定量することができ、それによって神経再生のためのマーカーとしての蛍光の復帰を逐次評価する。図2は、Thy1-GFPラットの1、2、3、および4週間のタイムポイントにおける蛍光の徐々な戻り(単純な切除部位を横切る近位蛍光の比として測定される)を示す。

神経の適切なまたは筋肉の組織形態学的分析は、グループ間で所望の効果を実証するために所定の時間の時間後に動物を犠牲にする必要があります。図3は、限界下顎除算の断面画像を示す。この技術は、様々なグループ間の組織形態分析を可能にするために、慎重な組織の取り扱い、貯蔵、準備、切除、染色を必要とします。適切に行えば、この技術は軸索直径、破片の量、神経線維、神経の割合、および密度測定の定量を可能にする。

図1:顔面神経解剖学は、足下顎骨神経でのクラッシュ傷害の1週間後にThy1-GFPラットで示された。 クラッシュ傷害の部位は白い矢印によって示される。神経の部分は、MT(主幹)、B(頬骨)、およびMM(限界下顎)枝としてラベル付けされる。スケールバーは1.5 mmを表します。

図2:トランセクション損傷に近い部位の強度に対する断面損傷に対する直ちに遠位部位の蛍光強度の比率としての蛍光の戻り量の定量化。4匹の動物を研究し、クラッシュ傷害をモデル化した。グラフは平均の平均比率±標準誤差としてプロットされる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:トルイジンブルーによる染色後のラット顔面神経の限界下顎枝の軸断面。スケールバーは100 μmを表します。

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Discussion

このラット顔面神経損傷モデルは、外科的アクセス性、分岐パターン、および^,生理学的意義^,27、29、33、34、35、36²⁷^,²⁹^,³³による神経栄養因子の評価のための最も汎用性の高いシステムとして登場した。³⁵^,³⁶³⁴ビデオデモとトランスジェニック動物データの応用の組み合わせは、神経再生現象の科学的研究のための新しい可能性を開きます。このモデルは、外傷、神経栄養学的影響、免疫調節作用、および微小環境の他の側面に対する神経応答の体系的かつ詳細な特徴付けを可能にする。臨床的な顔面神経研究の主な目的は、モトニューロン機能の回復に関連しているが、モデルはまた、神経筋接合部での事象、軸索輸送のニュアンス、および軸索-グリアの影響の相互作用を理解するために使用^,することができる27、36、37、38、39、40、41、42、43、44。²⁷^,³⁶³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴顔面神経を用いた機械学的研究は、アルツハイマー病やパーキンソン病^45、46、47^,⁴⁶^,⁴⁷などの中枢炎症および神経変性疾患に関する重要な洞察を逆説的に導いた。そこでは、このモデルで行われた作業の医学的影響は、支持細胞と神経組織の両方に影響を与える末梢神経系および中枢神経系障害に苦しむ患者の臨床ケアをより良く理解し、最終的に改善するための顕著な意味を持つ。

ラットモデルで顔面神経手術を行う初期学習曲線がある。科学者が外科的に訓練される必要はありませんが、手術顕微鏡の下で働き、双眼鏡ビジョンを利用して快適であるべきです。科学者は、反側手のWeitlanerリトラクタで引き込みを調整すると、視覚化を大幅に改善できるため、非支配的な手で作業を快適にする必要があります。これは、初心者の外科医がランドマークを失い、神経が頭蓋骨の基部を出る3次元空間で混乱する可能性があるため、顔面神経の主幹を特定する場合に特に当てはまります。しかし、経験が得られ、外科医が一貫して筋の腱を識別できるようになると、手順は非常に簡単です。神経の簡単な切除術は、科学者が最初に学習しているときに30分もかかる可能性がある場合、経験豊富な外科医の手では、切開から創傷閉鎖まで5分ほど便宜的であり得る。動物の準備と麻酔を管理する経験豊富なアシスタントと、必要に応じて物資を補充する - それは一度に複数の動物に操作することが可能です。立体的な神経内注入のような複雑な術中操縦が行われると、必要な時間が長くなります。

このグループは、大人のルイスとスプレイグ・ドーリーラットと大人のThy1-GFPラットと一緒に働いた経験があります。これらのモデルは、術中および術後の両方で、印象的な回復力を実証しています。移植後にあまりにも早く動作すると過度のストレスや術後の健康状態が悪くなる可能性があるため、NIH実験動物のケアと使用ガイドによって義務付けられている別の施設から命じられた場合、動物の順応(通常は1週間)の時間を確保することが賢明であろう。一方的な顔面神経損傷では、ラットは栄養失調や角膜刺激の術後の兆候を示さない。さらに、以前のプロトコルは最終的な犠牲までウィスカー機能の復帰の連続電気生理学的分析を要求してきたので、彼らは麻酔の反復期間をかなりよく⁴⁸に許容する。オペレータは、彼らの能力を最大限に術中の無菌を維持しようとするべきであるが、我々は操作された動物のいずれかと術後の感染症を指摘していない。時折、動物は切開部位に傷をつけようとします。しかし、通常、術後1〜2週間以内に毛髪の再成長を伴うベースライン状態に戻る。耳下腺が負傷したり、誤って除去された場合、シアロセレが生じ、排液のために麻酔を繰り返す必要があります。

変更は、怪我の場所、傷害の種類、または実行された介入に対して行うことができます。損傷は、顔面神経の経過に沿った任意の時点で、頭蓋内顔面神経切除部から主幹またはその末梢枝⁴⁹のいずれかに対する傷害まで誘発することができる。怪我の広範なパターンには、クラッシュ傷害、修復の有無にかかわらず簡単な横断、および修理またはブリッジ¹¹の有無にかかわらずギャップ欠陥が含まれる。可能な介入の範囲は網羅的です。簡単に言えば、介入は神経の適切な¹⁷のレベルで、傷害²³の部位で、または筋肉の終わり器官⁵⁰で行うことができる。可能な結果パラメータのリストも同様に長くなります。働く組織形態測定パラメータには、神経数の軸ベースの定量化、神経密度、および神経の割合などが含まれます。追加の対策には、再生の程度を示す縦断の組織学的分析および神経筋接合量の定量を示し、対象の顔面筋肉⁵¹の再インナーブを示す。結果を評価する新しい方法は^、22を開発し続ける。例えば、ハドロックらは、香りまたはパフ誘発反応を介して独立した顔面ゾーンの拘縮を評価するための複雑な方法を実証した。これは、面倒なシンキネティック再生¹¹の評価と最終的な治療の可能性を秘めています。

他の動物モデルと同様に、結果をヒト患者に翻訳することには限界があります。マウスとラットのモデルは、げっ歯類の神経系に内在する優れた再生電位を示します。このプロパティは、げっ歯類が人間と高等動物²⁴で達成できなかった再生結果を実証することができます。したがって、顔面神経科学者は、神経の再生と回復の評価のための適切なタイムポイントを慎重に選択する必要があります。長時間のタイムポイントを選択すると、実験群が信頼できる機会の狭いウィンドウは、そのユニークな介入から効果を実証する可能性があります²⁴.

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

S.A.A.は、米国顔面形成外科アカデミーレスリーバーンスタイングランツプログラムによって資金提供されています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic