3D analyse af multi-cellulære svar til Chemoattraktant gradienter
Summary
Vi beskriver en metode til at konstruere enheder til 3D-kultur og eksperimenter med celler og fler cellulære organoider. Denne enhed gør det muligt at analysere cellulære reaktioner på opløselige signaler i 3D-mikromiljøer med definerede chemoattraktant gradienter. Organoider er bedre end enkeltceller ved påvisning af svage støjende indgange.
Abstract
Forskellige begrænsninger af 2D cellekultur systemer har udløst interesse i 3D cellekultur og analyseplatforme, som ville bedre efterligne den rumlige og kemiske kompleksitet af levende væv og efterligne in vivo vævs funktioner. De seneste fremskridt inden for mikrofabrikations teknologier har lettet udviklingen af 3D in vitro-miljøer, hvor cellerne kan integreres i en veldefineret ekstracellulær matrix (ECM) og et defineret sæt af opløselige eller matrix associerede biomolekyler. De teknologiske barrierer har imidlertid begrænset deres udbredte anvendelse i forskningslaboratorier. Her beskriver vi en metode til at konstruere simple enheder til 3D-kultur og eksperimenter med celler og flercellede organoider i 3D-mikromiljøer med en defineret kemoattraktant gradient. Vi illustrerer brugen af denne platform til analyse af respons af epitheliale celler og organoider til stigninger i vækstfaktorer, såsom epidermal vækstfaktor (EGF). EGF-gradienter var stabile i enhederne i flere dage, hvilket førte til direkte forgrenings dannelse i bryst organoider. Denne analyse gjorde det muligt for os at konk drage, at kollektiv gradient sensing efter grupper af celler er mere følsom vs. enkeltceller. Vi beskriver også fabrikations metoden, som ikke kræver photolithografi faciliteter eller avancerede Soft litografi teknikker. Denne metode vil være nyttigt at studere 3D cellulære adfærd i forbindelse med analysen af udvikling og patologiske tilstande, herunder kræft.
Introduction
I fysiologisk miljø er cellerne indlejret i en ekstracellulær matrix (ECM) og eksponeret for et væld af biomolekyler. Interaktioner mellem celler og det omgivende mikromiljø regulerer intracellulære processer, der kontrollerer forskellige fænotyper, herunder migration, vækst, differentiering og overlevelse1,2. Meget er blevet lært om cellulære adfærd i en konventionel 2D cellekultur. Men med fremkomsten af intravital Imaging og eksperimenter med celler indlejret i 3D hydrogels, vigtige forskelle i celle adfærd er blevet anerkendt i den forenklede 2D in vitro-kulturer vs. 3D vævs lignende miljøer. Mens cellerne interagerer med ECM-fibre og fornemmer deres mekaniske egenskaber i 3D-matrixen, er gelen ikke en helt uafhængig variabel i et 2D in vitro-system. Dimensionaliteten ændrer fokale vedhæftnings dannelse, hvilket resulterer i forskellige cellers morfologi og opførsel. Desuden er celler på en 2D-overflade udsat for færre signalering signaler end celler åbne for alle retninger i 3D.
Disse begrænsninger har øget interesserne for 3D-systemer, der repræsenterer den rumlige og kemiske kompleksitet af levende væv og bedre forudsige in vivo vævs funktioner. De er blevet udviklet i mange former fra organoider som selv-samle cellulære mikrostrukturer til celler tilfældigt afbrudt i ECM3,4. Nylige fremskridt inden for mikrofabrikation teknologier har lettet fremkomsten af forskellige typer af 3D-kultur systemer5,6,7,8,9 for at studere fænotypiske ændringer og cellulære reaktioner på opløselige signaler; teknologiske barrierer begrænser imidlertid den udbredte anvendelse i forskningslaboratorier. I mange tilfælde kræver fremstillingsprocessen photolitografi teknikker og baggrundsviden for Soft litografi. Desuden skal forskellige faktorer styres for at kunne bygge en anordning og for at opnå en optimal funktion af enheden over en lang periode.
Vores metode beskriver, hvordan man konstruerer en 3D PDMS-enhed til at inkorporere celler og fler cellulære organoider i et 3D-mikromiljø med definerede chemoattraktant gradienter og derefter analysere epitel svar til EGF10. Vores data afslører, at kapaciteten af organoider til at reagere på lavvandede EGF-gradienter skyldes intercellulære kemiske kobling gennem Gap vejkryds. Det antyder potentialet af organoider for mere præcis påvisning af svage og støjende rumligt graduerede indgange. Fremstillingsprocessen kræver ikke en renrum facilitet eller photolitografi teknikker. Men, 3D PDMS enhed omfatter nødvendige faktorer af 3D fysiologiske miljø. Denne metode vil være nyttigt at studere 3D cellulære adfærd og det har stor forskningspotentiale med forskellige celletyper, chemoattraktanter, og ECM kombinationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremstillingen af PDMS forme blev udført ved hjælp af en kommerciel 3D trykning service, men kan også opnås ved en høj ende 3D printer in-House. Blandt forskellige 3D fabrikation metoder, stereolitografi anbefales til høj opløsning skimmeldannelse. Da PDMS-hærdning forekommer ved høj temperatur (80 °C), skal materialerne være tilstrækkeligt varmebestandige, hvilket udtrykkeligt bør specificeres, hvis udskrivningen er outsourcet. En termisk post-kur kan diskuteres med trykkeriet selskab til at øge den termis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud til AJE (NSF PD-11-7246, brystkræft forskningsfonden (BCRF-17-048) og NIC U54 CA210173) og AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
