Summary
우리는 어떻게 zebrafish의 인격에 영향을 미치는 물 전류 및 약한 자기장에 그들의 응답을 평가 하도록 행동 프로토콜을 설명 합니다. 동일한 인격과 물고기는 그들의 탐험 행동에 따라 구분 됩니다. 그런 다음, 수영 터널 낮은 흐름 속도 다른 자기 조건에 그들의 rheotactic 오리엔테이션 행동 관찰 됩니다.
Abstract
그들의 환경에서 스스로 방향, 동물 다양 한 성격 등의 여러 내부 요소와 상호 작용 하는 외부 신호를 통합 합니다. 여기, 우리가 여러 외부 환경 단서, 특히 물과 자기장 방향 반응에 zebrafish 개성의 영향의 연구를 위한 행동 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 여부 사전 이해 하는 것을 목표로 또는 반응 zebrafish 다른 rheotactic 임계값을 표시 (즉, 있는 물고기 상류 수영 시작 흐름 속도) 주변 자기장의 방향을 변경 하는 때. 식별 하려면 zebrafish 같은 성격으로, 물고기 탱크의 절반 연결 밝은 반에 좁은 개방 된 어둠 속에서 소개 된다. 만 사전 물고기 탐구 소설, 밝은 환경. 반응 물고기 탱크의 어두운 절반을 종료 하지 마십시오. 낮은 흐름 율을 가진 수영 터널 rheotactic 임계값을 결정 하는 데 사용 됩니다. 우리 지구의 자기장 강렬의 범위에서 터널에 자기장을 제어 두 설정 설명: 흐름 방향 (1 차원)와 자기장의 3 축 제어를 허용 하는 자기장을 제어 하는 하나. 물고기는 다른 자기장 아래 터널에서 흐름 속도의 stepwise 증가 경험 하는 동안 촬영. 방향 동작에 대 한 데이터는 비디오 추적 절차를 통해 수집 하 고 rheotactic 임계값 결정 수 있도록 로지스틱 모델에 적용. 우리 보고 대표 결과 zebrafish shoaling에서 수집된 합니다. 특히, 이러한 사전 물고기 자기장 변화에 응답 하지 않는 동안 자기장의 방향에 변화 하는 때만 반응, 신중한 물고기 rheotactic 임계값의 변화를 보여 보여 줍니다. 이 방법론은 자기 감도의 연구 및 많은 수생 종, 독방을 표시 또는 수영 전략 shoaling의 rheotactic 행동에 적용할 수 있습니다.
Introduction
현재 연구에서 우리는 물고기 물고기 물 전류 및 자기장 등 외부 방향 신호를 shoaling의 방향 응답에 개성의 역할을 조사 하는 범위를가지고 실험실 기반의 행동 프로토콜을 설명 합니다.
동물의 orienting 결정 다양 한 감각 정보를 무게에서 유래한 다. 결정 과정 탐색 하는 동물의 능력에 의해 좌우 된다 (예를 들어, 선택 하 고 방향 유지 용량), 그것의 내부 상태 (예: 먹이 또는 생식 요구), 이동 (예를 들어, 운동 역학), 그리고 몇 가지 추가 하는 기능 외부 요인 (예, 하루, conspecifics와의 상호 작용의 시간)1.
내부 상태 또는 방향 동작에서 동물 개성의 역할은 종종 제대로 이해 하거나2탐험 하지. 추가적인 사회 수생 종, 수시로 조정 수행 하 고 그룹 운동 동작3편광의 방향 연구에서 발생 한다.
물은 물고기의 오리엔테이션 과정에서 핵심 역할을 한다. 생선과 물이 전류는 unconditioned 응답 이라고 rheotaxis4, 될 수 있는 긍정적인 (즉, 상류 지향) 또는 네거티브 (즉 하류 지향)을 통해 방향을의 최소화를 구하고에서 배열 하는 다양 한 행사를 위해 사용 된다 에너지 비용5,6. 또한, 문학의 성장 시체 보고 많은 물고기 종 방향 및 탐색7,,89지자기의 필드를 사용 합니다.
물고기에서 rheotaxis 및 수영 성능 연구는 일반적으로 흐름 챔버 (flume), 어디 생선에 노출 되는 흐름 속도의 stepwise 증가에서 높은 속도, 낮은 소모 (라는 중요 한 속도)10까지 자주 수행 11. 다른 한편으로, 이전 연구에서 아직도 물12,13동물의 수영 동작의 관찰을 통해 방향 자기장의 역할 조사. 여기, 우리가 물 전류와 자기장을 조작 하는 동안 물고기의 동작을 연구 하는 연구자 수 있도록 실험실 기술을 설명 합니다. 이 방법은 주변 자기장의 조작 rheotactic 임계값 (즉, 최소한의 물 속도 결정 하는 결론으로 이어지는 우리의 이전 연구에서 shoaling zebrafish (Danio rerio)에 처음으로 이용 되었다 어떤 shoaling 물고기 동양 상류)14. 이 메서드는 느린 흐름 flume, 지구의 자기장 강렬의 범위 내에서 자기장을 제어 하도록 설계 되었습니다 설치와 결합 된 flume 챔버의 사용을 기반으로 합니다.
수영 터널 이용 zebrafish의 동작을 관찰 하는 그림 1에 설명 되어. (Nonreflecting 아크릴 실린더 7 cm 직경 및 길이 15 cm의 만든) 터널 흐름 속도14의 컨트롤에 대 한 설치 프로그램에 연결 됩니다. 이 설치 터널에서 흐름 율의 범위는 0과 9 cm/s 사이의 다릅니다.
수영 터널에서 자기 필드를 조작 하려면 사용 하는 두 방법 론 적 접근: 처음 1 차원 이며 두 번째는 3 차원. 모든 응용 프로그램에 대 한 이러한 방법은 정의 된 양의 물에 특정 자기 조건을 얻기 위해 지자기의 필드 조작-따라서,이 연구에서 보고 하는 자기장 강도의 모든 값 포함 지자기 분야.
1 차원에 관한 접근15, 자기장 (x 축으로 정의 되는) 물 흐름 방향을 따라 조작 수영 터널 감싸 솔레노이드를 사용 하 여. 이것은 전원 장치에 연결 하 고 그것은 균일 한 정적 자기장 (그림 2A)을 생성 합니다. 마찬가지로 3 차원 접근의 경우 수영 터널을 포함 하는 볼륨에 지자기의 필드 전기 철사의 코일을 사용 하 여 수정 됩니다. 그러나, 3 차원에서 자기장을 제어 하려면 코일 3 개 직교 헬름홀츠 쌍 (그림 2B)의 디자인이 있다. 각 헬름홀츠 쌍은 3 개의 직교 공간 방향 (x, y및 z)에 따라 동쪽으로 향하게 하는 2 개의 원형 코일의 구성 하 고 폐쇄 루프 조건에서 일 하는 3 축 자력을 갖춘. 자력 지구의 자연적인 분야와 유사한 분야 농도 함께 작동 그리고 그것은 (수영 터널이 위치한) 코일 집합의 기하학 센터에 가깝습니다.
우리는 물고기는 얕은 구성의 성격 특성 그들은 자기장16에 응답 하는 방법에 영향 가설 테스트를 위에서 설명한 기술을 구현 합니다. 우리는 사전 및 사후 성격17,18 개인 응답 다르게 물 흐름과 자기장에 노출 되 면 가설을 테스트 합니다. 이 테스트 하려면 우리는 먼저 zebrafish 할당을 설립 방법과 사전 또는 사후17,19,,2021그룹 개인을 사용 하 여 정렬 합니다. 다음, 우리는 떼 반응 개인만의 구성 또는 예제 데이터로 선물이 자기 수조 탱크에 적극적인 개인만의 구성에서 수영 zebrafish의 rheotactic 행동을 평가 합니다.
정렬 방법 탐구 소설 환경21개인 사전 및 사후의 다른 경향을 기반으로 합니다. 특히, 우리는 밝고 어두운 측면17,19,,2021 (그림 3)으로 분할 하는 탱크를 사용 합니다. 동물 어두운 면에 acclimated 됩니다. 밝은 면에 대 한 액세스는 열려, 사전 개인 반응 물고기 어두운 탱크 두지 않는다 동안 새로운 환경을 탐구 하는 탱크의 어두운 절반을 신속 하 게 종료 하는 경향이.
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Protocol
다음 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 대학의 나폴리 페데리코 II, 나폴리, 이탈리아 (2015)의 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1. 동물 유지 보수
- 적어도 200 L 탱크를 사용 하 여 각 탱크에 남녀의 적어도 50 개인의 떼를.
참고: 탱크에 있는 물고기의 밀도 한 동물 2 L 당 또는 더 낮은 있다. 이러한 조건에서 zebrafish 정상 shoaling 행동을 표시 됩니다. - 다음과 같이 유지 관리 조건 설정: 27-28 ° C에서 온도 전도도에 < 500 Μs; pH 6.5-7.5; 3 에서 < 0.25 mg/L; 그리고 빛: 다크 photoperiod 10 h:14 h.
참고: 동일한 보유 조건은 혼합된 인구와 분리 된 사전 및 사후 인구에 사용 되어야 한다.
2. 성격 선택 제 브라에서
- 준비 하 고 유지 보수 탱크에 사용 같은 물과 조용한 방 (그림 3)에서 성격 선택 탱크를 배치.
- 위 또는 탱크의 측면에서 비디오 카메라를 배치 합니다. 지역에 있는 모니터를 컴퓨터에 카메라를 연결 탱크와 시각적 접촉입니다.
- 선택 9 유지 보수 탱크에서 무작위로 물고기 고 knotless 그물을 사용 하 여 성격 선택 탱크의 어두운 면에 그들을 전송.
참고: 탱크와 최소한 가능한 시간에 물고기와 상호 작용을 제한 하려고 합니다. 잡음과 빠른 움직임을 피하십시오. 필요한 경우 전송 지주 탱크에서 물으로 (약 2 리터) 탱크를 운반 작은 볼륨에서 동물. 동물의 공기 노출을 피하기 위해, 250ml 비 커를 사용 하 고 부드럽게 입력 비 커를 동물을 유도 합니다. 캡처 시간 최소화, 동물에 물리적 손상이 발생할 수 있습니다 하 고 이러한 요소 스트레스를 증가 수 있습니다 그물에 몇 초 동안 물고기를 보유 하지 않습니다 여러 물고기를 수집 하지 않도록 하려고 합니다. 물고기 실험 탱크를 전송 하기 전에 ad libitum 먹여야 합니다. 이 음식을 찾는 행동의 다른 성향에 영향을 개인의 동작 다음 실험22동안 가능성을 제한 합니다. 하루 중 같은 시간에 복제 실험을 실시 합니다. 이 가능한 circadian 리듬23기인 실험 그룹의 행동에 변화를 최소화 합니다. - 순응의 1 시간 후 슬라이딩 도어를 엽니다.
참고: 구멍에서 종료 10 분 이내 탱크의 밝은 면을 탐험 하는 개인이 능동적21간주 됩니다. - 10 분 후 부드럽게 탱크에서 사전 개인을 제거 하 고 사전 유지 보수 탱크에 그들을 전송.
- 15 분 후 반응21여겨지는 어둠 상자에 남아 있는 물고기를 수집 하 고 사후 유지 보수 탱크에 그들을 전송.
참고: 10 분21후 탱크의 밝은 면을 이동 하는 물고기를 삭제 합니다. 섹션 5에서에서 설명 하는 테스트에 필요한 사전 및 사후에 해당 하는 물고기의 원하는 수 수집 될 때까지 한 번에 9 개의 물고기와 성격 테스트를 수행 합니다. 사전 및 사후 개성의 일관성 정기적으로 동일한 접근을 사용 하 여 확인할 수 있습니다.
3. One-dimensional 자기장 조작27 와 자기장의 설정
- 전원 장치 (그림 2A)에 전환.
- Rheotactic 프로토콜 있을 것입니다 위치에 코일된 터널을 배치 수행된 (5 절)만 수영 기구 (그림 2A)에서 분리. 터널 내부 가우스/Teslameter와 연결 된 자석 조사 놓고 터널의 주요 축을 따라 선택 된 자기장 값을 얻기 위해 필요한 어떤 전압을 확인 합니다.
참고: 솔레노이드의 자기 특성, 필드 이므로 합리적으로 터널; 내 유니폼 이 가로 세로로 프로브를 천천히 이동 하 여 확인할 수 있습니다. - 프로브를 분리 하 고 수영 기구를 흐름 터널을 연결.
- Rheotactic 프로토콜 (5 절)로 시작 합니다.
4. 3 차원 자기장 자기장의 설정 조작27
- CPU, DAC, 그리고 코일 드라이버 (그림 2B)에 전환.
- 3 축 (x, y, 및 z)의 각 하나에 선택한 자기 분야를 설정 합니다.
- 헬름홀츠 쌍 집합의 센터에서 터널을 놓습니다.
- Rheotactic 프로토콜 (5 절)로 시작 합니다.
5. 테스트의 흐름 챔버에 제 브라 Rheotaxis
- 1-5 물고기 흐름 터널 측면 및 하단 가려진 2 L 탱크를 사용 하 여 전송.
- 펌프를 켜고 터널 1.7 c m/s 흐름 속도 설정.
참고: 천천히 움직이는 물이 산소 터널에 물을 유지 됩니다 그리고 그것은 동물의 복구를 촉진 한다. - 1 시간 수영 터널에 적응 하는 동물을 보자.
- 터널에서 물고기의 동작의 비디오 녹화를 시작 합니다.
참고: 우리는 원격 제어 (예: Bluetooth) 카메라 (예: 이순신 4 K 작업)을 사용 하 고.mpg (30 프레임/s)로 비디오를 저장. - 선택한 실험 프로토콜 (1.3 c m/s;이 연구에 따르면 흐름 율의 stepwise 증가 시작 그림 4)입니다.
참고: 이 프로토콜을 사용 하 여 zebrafish에 대 한 범위는 0에서 2.8 BL (몸 길이)는 낮은 흐름 속도 / s. 이러한 흐름 속도 zebrafish (3%-15%의 중요 한 수영 속도 [U크리])24연속 지향된 수영을 유도 하는 흐름 율의 낮은 범위에 있습니다. 낮은 흐름 율 (다음 브렛의 프로토콜25)를 사용 하 여가이 종 물 존재의 독자적인 행동 특성에 연결 된다. Zebrafish 챔버, 물 flow, 존재도 자주, 선회의 주요 축을 따라 수영 하 고 업스트림과 다운스트림24,26수영 하는 경향이 있다 경향이 있다. 이 동작이 비교적 높은 속도에서 사라지고 물 flow 속도 의해 영향을 (> 8 BL/s)26, 동물 지속적으로 업스트림 (전체 긍정적인 rheotactic 응답)를 직면 하 고 수영 하는 때. 수직 및 횡단 변위 매우 드물다입니다. -
형태학 챔버에 물고기의 사진에 (섹스와 총 길이 [TL], 포크 길이 [FL], 또는 BL) 동물의 morphometry를 수행 합니다.
- 적절 한 그림을 선택 합니다.
- ImageJ에 그림을 엽니다.
- 동물의 섹스의 (남성 zebrafish 슬림 하 고 여성 더 반올림 파란색과 흰색 colorings 하는 경향이 동안 노란, 경향이).
- 분석 을 클릭 > 설정 규모 와 설정 센티미터, 참고로 터널의 전체 가로 길이 사용 하 여 이미지의 규모.
- 분석 을 클릭 > 측정 및 기록 동물의 선형 길이.
- 그것의 몸 무게 (BW)를 계산 합니다.
참고: BW 섹스-플로리다-BW 관계 이전 실험실에서 내장 또는 메타 데이터에서 계산 됩니다. 모든 절차는 동물에 대 한 조작 스트레스를 방지합니다.
6입니다. 비디오 추적
- 추적기 4.84 비디오 분석 및 모델링 도구와 비디오 파일을 엽니다.
참고: 필요한 경우, 관점 및 방사형 왜곡 filters를 사용 하 여 비디오 왜곡을 수정 합니다. - 상단 메뉴에서 좌표계 에 클릭 하 고 초에 시간 단위를 센티미터 길이 단위를 설정.
- 클릭 파일 > 가져오기 > 비디오 및 추적기 4.84에 동영상 오픈 중.
- "좌표 축"에 클릭 하 고 터널 따라 x 축으로 시간이 지남에 따라 물고기의 위치를 추적 하기 위해 참조 시스템 설정. 다운스트림 결말 (에서 물 출구) 벽의 낮은 모서리에 원점을 설정 합니다.
- 트랙 을 클릭 > 새로 만들기 > 질량의 포인트 와 한 번에 하나의 물고기를 추적 하는 시작. 물고기 각 유량에서 보낸 각 스텝의 마지막 5 분을 추적 합니다.
- 5 프레임으로 비디오를 수동으로 사전 (0.5 s) 각 업스트림-다운스트림 차례 (UDt, 그림 5에 빨간 점)에 고 각 다운스트림 업스트림 차례 (DUt, 그림 5에서 파란색 점)에서 동물의 위치와 시간을 표시 하 고.
참고: fish 눈 위치를 사용 하 여 fish의 위치에 대 한 참조로. 점 질량을 사용 하 여 동물의 위치를 추적 합니다. 추적에서 제외-지향 수영 (즉, 작전 시간)의 기간. - 각 추적 세션의 끝에 x 값을 선택 하 고 소프트웨어 윈도우의 오른쪽 하단 모서리에 테이블의 값을 시간. 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 데이터를 복사 를 클릭 하십시오 > 전체 정밀도.
- 총 업스트림 시간 (Udt와 Dut 간의 모든 간격의 합)와 총 다운스트림 시간 (Dut와 UDt 사이 간격의 합계), 뿐만 아니라 값을 계산 하는 템플릿 스프레드시트 파일에 시간 값과 모든 전환 위치의 x 값을 저장 비율 (RI %)의 rheotactic 인덱스의 각 흐름에 대 한 단계 ( 그림 5참조).
참고: Rheotactic 동작의 물고기 상류 직면 지출 총 지향된 시간 비율에 의해 계량 (수영 또는 거의 동결 [즉, 그들은 아직도 터널의 하단에 머물]27). 이 비율 RI % (그림 5)로 정의 됩니다.
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Representative Results
예제 데이터로 선물이 결과 사전 및 사후 shoaling zebrafish16 그림 2A (프로토콜의 섹션 3 참조)에 표시 된 설정을 사용 하 여 물 흐름 방향 따라 자기장을 제어. 이러한 결과 어떻게 설명된 프로토콜 응답 서로 다른 개성 가진 물고기에 자기장에 있는 차이 강조할 수를 보여 줍니다. 이러한 실험의 전반적인 개념 물 흐름에 상대적으로 자기장의 방향을 shoaling zebrafish14에 rheotactic 임계값에 영향을 찾는에 의존 합니다. 따라서, 자기장에 있는 변화는 rheotaxis를 변조, 자기장에 zebrafish의 응답28그들의 사전 또는 사후 성격 따라 다른 경우 평가 하이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
그림 3에서 같이 어두운/밝은 탱크를 사용 하 여 처음 zebrafish의 사전/사후 성격에 따라 다른 그룹으로 분할 했다. 이러한 테스트에 따라 같은 성격으로 5 물고기의 여울목 다음 솔레노이드 수영 터널 (그림 1 및 그림 2A)에서 테스트 되었습니다. 20 물고기의 총 시험 되었다: 두 떼로 구성 된 5 반응 물고기의 각 (10 반응 물고기)와 두 떼로 구성 된 5 사전 물고기의 각 (10 사전 물고기).
한 번에 한 떼 비디오 터널에서 수영 하는 동안 기록 이었고 현재 물 개요로 그림 4에 표시 된 유량의 증가 단계적으로 가속 되었다. 물고기는 터널에서 1 시간 두었던 허용 되었다. 그 후, 우리는 고전적인 브렛 프로토콜25에 따라 유량의 stepwise 증가 사용 하 여 rheotactic 동작의 정량화에 대 한 프로토콜 적용. 특히, 유량 증가 0.4 BL/s 7 연속 단계 (그림 4)의 총에 대 한 모든 10 분. 제 브라의 동작은 터널 (70 분), 실행의 전체 기간 동안 기록 된 하 고 각 단계에서 RI 값 계산 (프로토콜 단계 6.8 참조).
수영 터널에서 실행 하는 동안 자기장 다음 두 가지 조건 중 하나에 설정: 50 μT 하류 (즉, 자기장의 [축] 가로 구성 했다 물 흐름의 동일한 방향) 및 50 μT 상류 (즉,에서 자기장의 가로 구성 요소 했다 물 흐름에 대해 반대 방향으로)16. 축 y 및 z에 따라 강도 했다 영향을 받지, 총 강도 및 자기장 벡터의 성향. 5 물고기의 각 떼만 두 자석 조건 중 하나에 노출 되었다. 예를 들어 사전 물고기, 고려 한 사전 얕은 하류 감독 자기장 졌고 다른 사전 얕은 자기장 상류 지시 했다.
비디오 다음 비디오 추적 소프트웨어 (단원 6 프로토콜)와 함께 분석 했다. 물고기 수영 터널에서 실행의 전체 기간 동안 기록 된 비디오 했다. 그러나, 각 10 분 긴 stepwise 증가 유량 (그림 4)의 마지막 5 분만 추적 했다. 추적된 기간 동안, 각 유량에 각 물고기의 회전 강조 했다 (그림 5, 빨간색과 파란색 데이터 포인트). 이들은 다음 RI 각 각 흐름의 속도 (그림 5)의 계산을 참조로 사용 되었다. RI 인덱스 0%와 100% 사이의 범위. 때 50% 미만, RI 인덱스 표시 됨을 나타냅니다 물고기 부정적인 rheotaxis (다운스트림 수영의 퍼짐); RI 50% 보다 높은 경우에, 그것은 동물 rheotactic 응답 (업스트림 수영의 보급) 했다 보여줍니다. 크게 다르지 않은 50%는 RI rheotactic 응답의 부재를 나타내는 것 이다. 한 떼의 모든 5 물고기의 RI %의 값 다음 각 유량에 평균 했다. 이러한 평균된 데이터 아크사인 변형 및 그림 6A에 표시 하는 곡선에 맞게 사용 했다. 따라서, rheotactic 인덱스 증가 sigmoidally 물 속도 증가, 간단한 수학적 방법으로는 rheotaxis의 정량화를 허용 됩니다. RI와 유량의 관계 다음 자형 로지스틱 모델에 적합 될 수 있다.
세 가지 매개 변수 및 그들의 가변성 맞는 곡선에서 파생 될 수 있습니다. RI고원 최대한 경향이 동물의 실험에 사용 되는 흐름 속도의 범위에서 상류 방향을 측정 한다. RI하단 물 흐름의 부재에 RI 값 이며, 가설적으로, 50%에서 다 안 한다. Rtr 은 유량 곡선의 최대 경사 발생 이며 rheotactic 임계값6의 측정으로 사용할 수 있습니다.
결과는 zebrafish의 rheotactic 임계값 (Rtr)은 매우 낮은 경우, 초당 몇 센티미터의 범위를 나타냅니다. 자기장의 변화에 적극적으로 물고기의 Rtr 영향을 주지 않습니다 ( t자기장의 영향을 주지 않습니다-테스트, P > 0.05). 반대로, 자기장 변화 반응 zebrafish의 rheotactic 행동에 뚜렷한 영향을. 수영 터널을 따라 자기 필드 구성 요소는 하류 지시 했다 때 Rtr 이며 매우 낮은 사전 물고기 비슷합니다. 임계값 때 상당히 높은 자기장 상류 지시 했다 (t-테스트, P < 0.01).
반응 동물의 RI고원 값 때 훨씬 낮은 자기장 상류 지시 했다 (t-테스트, P < 0.01). 이 결과이 조건 반응 물고기 전체 긍정적인 rheotactic 응답 도달할 것 이라고 나타냅니다 (RI = 100%) 매우 높은 흐름 속도에. 따라서,이 결과 강조, Rtr에 비해, RI고원 물고기의 수영 동작에 대 한 더 적은 정보를 제공 합니다. 사실, 강한 차이 사후 리고원 두 자기 조건에 따라, 우리 수 상태, 업스트림 지향 자기장에서 반응 동물 아마 전체 rheotactic 응답에 표시 높은 물 흐름입니다.
리하위 값 (비록 크게 하지) 높은 경향이 50%와 하류 지향 자기장에 노출 반응 동물 사전 동물에서 보다. 이 때문에 매우 낮은 임계값이 특징인 동물 새 환경 순응 동안 경험된 흐름 방향을 기억 하 고 있습니다 프로토콜에 바이어스를 나타낼 수 있습니다. 적절 한 프로토콜이이 가능성을 테스트를 고안 수 있습니다.
그림 1: 는 수영의 간체 표현 터널 현재 연구에 활용 하는 장치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마그네틱 필드 컨트롤에 대 한 설치. (A) 터널 내에서 정적, 자기장의 유도 솔레노이드와 수영 터널의 렌더링. 솔레노이드 (0.83 회전/cm) 전원 장치에 연결 하 고 그것은 밀리볼트 µT (지구 자기장 범위를 포함 하는 강도 범위)의 범위에 필드를 생성 합니다. 오른쪽 측면에서 수영 장치에 연결 된 솔레노이드 터널의 사진 표시 됩니다. 터널은 아크릴 만들었고 그것은 두 개의 구멍이 아크릴 플레이트 물 입구에 가까이 층 류 흐름을 보장 하는. (B) 다이어그램 및 3 개의 직교 헬름홀츠 쌍의 사진 농도의 지자기 범위에서 자기장의 컨트롤에 대 한 설정합니다. 자기장 프로브, CPU, 디지털-아날로그 컨버터 및 루프를 종료 하는 데 사용 하는 코일 드라이버도 표시 됩니다. 코일의 각 쌍은 30cm, N 의 반경 (r)와 2 개의 원형 코일의 구성 = 50 AWG 14의 구리 와이어. 선택 가능한 규모 (810 µT ±를 ± 88 µT)와 3 축 자력 (센서) 코일 집합의 옆에 배치 됩니다. 센서 범위 ±130 µT 값으로 설정 됩니다. 이 값 또한 대표적인 결과에서 설명 하는 측정을 위해 사용 되었다 (이러한 조건에서 공칭 센서 해상도 대해 0.1 µT)입니다. 자기장의 방향과 강도 디지털 의견 시스템으로 제어 됩니다. 센서 (3 축), 자기장 벡터의 세 가지 구성 요소를 측정 하 고 해당 오류 신호 추출 됩니다. 다음, 수정 신호는 간단한 통합 필터에 의해 생성 됩니다. 디지털 보정 신호는 디지털-아날로그 변환기에 의해 전압으로 변환 되며 적당 한 코일 드라이버에 의해 증폭. 이 마지막 신호는 헬름홀츠 쌍을 운전 하는 데 사용 됩니다. 샘플링 주파수 5 Hz에 고정 하 고 루프의 단일 이득 주파수는 약 0.16 Hz. 전류는 코일의 헬름홀츠 쌍에 설정 되 면 전체 자기장 변화 중앙 큐빅 볼륨에 평균 강도 값에서 2% 미만 (가장자리 [L] = 10 cm) 코일의. 측정, 동안 자기장 rms 미만 0.2 µT 이다. 설정 (패널 A 와 B)에 정적 전기 분야는 자기장16을 생산 하는 코일에서 전류에 의해 생성 됩니다. 전기장의 강도 때 0.4 V/m에 대 한 최대 전류 적용 됩니다; 이 값은 자연 또는 인공 정적 필드 누구의 강도 1 kV/m17의 질서는 환경에 비해 무시할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 는 탱크의 도식 표현 (40 cm x 40 cm x 40 cm)에 따라 레이 외.21(규모)에 반응 zebrafish 개인 사전 분리 하는 데 사용. 성격 선택 탱크의 볼륨은 50 L. 절반 탱크의 탱크의 밝은 절반을 직면 하는 상자의 측에 직경 5 cm의 구멍이 있는 어둠 상자에 의해 점령 되었다. 구멍은 그 오프닝 서명 선택 재판의 시작 (표시 되지 않음), 슬라이딩 도어에 의해 덮여 있었다. 탱크의 어두운 면 이동식 덮개 손 그물의 액세스를 허용 해야 합니다. 이 행동 실험 전후 배치 또는 잡기 생선 용이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 테스트 중 zebrafish의 rheotactic 임계값을 결정 하는 데 사용 하는 유량의 다이어그램. 1 시간 새 환경 순응 기간 동안 흐름 동물에 적절 한 산소 공급을 보장 하기에 충분 했다. 그것은,이 디자인으로, 산소 공급이 결코 흐름 0 첫걸음 10 분에도 제한 추측 될 수 있다. 실제로, 콘텐츠로 산소 물 약 7.9 mg/L의 27 ° C 및 1 mg/h.g의 동물 산소 소비 (zebrafish 산소 소비 [Uliano 외.29] 일상적인 조건 및 저속 수영에 대 한 초과 근사 [Palstra 외 알.30]), 계산, 흐름의 부재에는 수조에 포2 안 줄어 동물, 중요 한 포2 (zebrafish 약 40 torr) 이상 남은 당 2% 이상 가능 하다. 이 그림은 Cresci 외.14에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 터널 및 RI의 계산에서 동물 행동. 그래프는 유량의 값을 세 개에 300 s 레코드 중 x 축 따라 개별 동물의 위치를 제시. 빨간 점 대표 하류-상류 회전, 블루 도트 업스트림-다운스트림 회전. 하류에 동물에 의해 소비 하는 간격을 시간 또는 상류는 또한 보고, 해당 고 RI 값을 계산할 수 하는에서 총 업스트림 및 다운스트림 번 보고 됩니다. 그것은 관찰 될 수 있다 그 때 업스트림 시간 흐름 속도 증가 하 고 RI 값 증가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 대표 결과. 흐름을 따라 두 개의 자기장 조건에서 사전 및 사후 shoaling zebrafish의 유량과 아크사인 변형 RI 값 (RI는 물고기 상류 직면 지출 총 지향 시간의 비율) (A) 관계 평가 방향 (1 차원 제어). 각 데이터 요소는 각 유량에 얕은 작성 5 물고기의 RI 값의 평균입니다. 곡선 사이의 중요 한 차이는 자승 합 F통해 테스트-테스트 (알파 = 0.05)14. (B) 자기장 축과 물의 방향 터널에 흐름. 이 연구에 사용 된 두 개의 자기장 조건에서 자기 벡터의 3 차원 표현을 표시 됩니다. 실험실에서 자기장 (40 ° N, 14 ° E) 했다: F = 62 μT; 나 = 64 °; D = 44 °. 이 그림은 Cresci 외.16에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서 설명 하는 프로토콜 수 과학자와 같은 2 개의 외부 신호 (물 현재 및 지자기 분야)와 동물의 하나의 내부 요소 간의 통합에서 발생 하는 수생 종의 복잡 한 방향 응답 척도를 성격입니다. 전반적인 개념 서로 다른 개성의 개인을 분리 하 고 별도로 제어 또는 동시에 외부 환경 신호 하는 동안 그들의 오리엔테이션 행동을 조사 하는 과학자를 허용 하는 실험적인 디자인을 만드는 것입니다.
Rheotactic 인덱스 (RI)의 수학적 정의 함께이 연구에서 설명 하는 프로토콜 수영 터널에서 zebrafish의 동작의 예비 관찰을 따라 설계 되었다. 터널에 배치,이 동물 행동 패턴, 모두 부재 또는 물 flow의 존재에 두 가지 유형의 표시: 수영 하 고 작전을 지향. 그들은 중심 시간의 대부분을 보내고 (일반적으로, 물고기 했다 비디오는 시간의 95% 이상 기록) 터널을 따라 수영 (즉, 각도 45 ° 보다 낮은로 긴 축을 따라 중심), 앞 뒤로, 선회 끝 벽과 자주 쉬 thigmotaxis (즉, 터널의 벽 가까이 수영)27때문.
성공 하려면이 프로토콜에 대 한 동물의 스트레스에 관심을 지불 하는 실험을 수행 하는 누구 든 지 중요 하다. 실험 설정 사이의 물고기의 교통 관리와 함께 실행 되어야 합니다. 손 그물의 사용 가능한, 그리고 실제 실험으로 zebrafish 좋습니다 하기 전에 훈련은 빠른 수영 빠르고 하드 탱크에서 잡으려고 해야 합니다. 스트레스 극적으로이 동물의 동작에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 zebrafish, 경우 그것은 그들의 수영을 변경할 수 있습니다 크게 행동27. 이 것이 아마 영향을 결과, 물고기 활동적인 동작을 표시 하 고 물 흐름과 자기장 변화에 덜 민감한 수 있습니다. 실험적인 체제에서 동물과 접촉으로 신속 하 고 가능한 한 짧게 해야 합니다. 행동 분석 연습 필요 원격 관찰을 필요 합니다. 또한, 그것은 맹목적으로 (즉, 프로토콜 및 치료 알고) 없이 비디오를 분석 하는 것이 중요입니다.
물고기의 많은 종족의 rheotactic 동작을 사용 하 여 공부 하고있다 수영 터널5,10,,1131. 수많은 이전 연구에 초점을 맞춘 수영 속도의 추정 물고기 피로, 생리 및 생태 가설11,32, 테스트를 주로 U크리로 정의 되는 때까지 유지할 수 있는 33.이 연구에서 설명 하는 방법에 초점을 맞추고, 대신, 낮은 흐름 속도에서 rheotactic 동작. 이 연구의 목적은 물고기, 긍정적인 rheotaxis의 유명 하 고 강력한 방향 동작의 관찰을 통해 자기장 처럼 미묘 하 고 약한 큐에 감도 평가 하는 것 이므로이 선택이 되었다. 여기에서 보고 된 대표적인 결과에서 zebrafish 매우 낮은 rheotactic 임계값 (초당 몇 센티미터만) 표시. 이 관측 환경 어디 물 속도 크게 다를 수 있습니다 서식이 종족에 대 한 생태학적으로 관련 될 수 있습니다. Zebrafish 라이브 모두 사나운 강34 에서 물 시체 물 천천히 이동 하는 어디에, 논, 연못, floodplains35등. 물이 천천히 이동 하는 때 능력을 감지 하 고 낮은 흐름 속도 (낮은 rheotactic 임계값)에서 동양 가능 수 유리, rheotactic 응답 다운스트림 표류 먹이36 을 기회를 증가 하 고 제공 마이그레이션37의 방향 자극
이러한 관측 수 없습니다 높은 금리 흐름을 사용 하 여 만들 수 있습니다. 이 의존 하는 것이 더 많은 신체 조건과 높은 수영 공연 자기장 같은 외부 신호 보다는 동물의 강한 locomotory 응답을 이끌어내는 것 이다. 여기에 제시 된 프로토콜 zebrafish에 적용 했다 하지만 어떤에 대 한 적합 한 이동 환경에 서식 하는 민물 또는 해양 종 물 고 실험실 조건에서 처리 될 수 있습니다.
그러나,이 프로토콜에는 몇 가지 제한이 선물 한다. 종 나 자기장에 nonsensitive 인지 명확 하 게 강조, 하는 동안 그것는 동물 운동 결정에 대 한 자기장을 사용 하는 방향 메커니즘을 공개할 수 없습니다. 수생 종에서 자석 방향 메커니즘을 조사 하기 위하여 원형 경기장 및 아직도 물7,,3839 또는 미로13 설정 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 물고기 (와 일반적으로 수생 동물)에 거주 하지 않는 전류는, 제시 방법은 유비 쿼터 스 방향 신호를 통합 행동 응답을 조사 하는 첫 번째 시도 환경 물 흐름 처럼이 고 자기 필드입니다. 이 프로토콜의 또 다른 한계는 수동 비디오 추적. 자동 추적 소프트웨어와 통합 하는이 설치 전체 데이터 분석 프로세스의 타이밍을 향상 시킬 것 이다.
여기에 제시 된 실험 프로토콜은 자기 감도 및 rheotaxis 동물 개성의 영향을 조사 하기 위해 설계 된 첫 번째. 이 주제 문학에서 간과 되어 그리고 더욱 탐구 될 필요가 있다. 같은 종에서 또는 인구 또는 작은 그룹 (예: 물고기 떼) 내 에서도 개인 다른 성격 특성22,40, 철새에 대 한 연구에 중요 한 요소가 될 수 있는 특징은, 탐험, 탐색 및 방향 동작입니다. 모든 개인이 같은 방식으로 환경 신호를 통합합니다. 따라서, 계정 내부 요인으로 복용, 성격, 등 수 줄이는 데 도움이 데이터 변화는 운동 생태16에 대 한 연구에 일반적으로 관찰 되는.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
연구는 물리학의 기본 연구 설립 및 나폴리 대학 페데리코 II의 생물학과 의해 지원 되었다. 저자는 통계 지원에 대 한 닥터 클 라우 디 아 Angelini (연구소의 적용 미적분학, Consiglio 나치오날레 델 Ricerche [CNR], 이탈리아) 감사합니다. 저자에 대 한 그들의 기술 수집 데이터, 그리고 설계 및 실험적인 체제의 실현에 그들의 숙련 된 지원에 대 한 부서별 기술자 F. Cassese, G. Passeggio, 및 R. 코 마르티나 Scanu와 실비아 Frassinet 감사 합니다. 우리가 감사로 라 이방인 도움 비디오 촬영 하는 동안 실험을 실시. 우리 다이애나 로즈 Udel Alessandro Cresci의 인터뷰 문을 촬영 마이애미 대학에서에서 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9500 G meter | FWBell | N/A | Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT |
| AD5755-1 | Analog Devices | EVAL-AD5755SDZ | Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter |
| ALR3003D | ELC | 3760244880031 | DC Double Regulated power supply |
| BeagleBone Black | Beagleboard.org | N/A | Single Board Computer |
| Coil driver | Home made | N/A | Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI) |
| Helmholtz pairs | Home made | N/A | Coils made with standard AWG-14 wire |
| HMC588L | Honeywell | 900405 Rev E | Digital three-axis magnetometer |
| MO99-2506 | FWBell | 129966 | Single axis magnetic probe |
| Swimming apparatus | M2M Engineering Custom Scientific Equipment | N/A | Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback |
| TECO 278 | TECO | N/A | Thermo-cryostat |
References
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