Summary
Descreveremos um protocolo comportamental destinado a avaliar como personalidades do zebrafish influenciam sua resposta à água correntes e campos magnéticos fracos. Peixes com as mesmas personalidades são separados com base no seu comportamento exploratório. Em seguida, observa-se seu comportamento de orientação rheotactic em um túnel de natação com uma baixa taxa de fluxo e sob diferentes condições magnéticas.
Abstract
Para orientar-se no seu ambiente, animais integram uma grande variedade de pistas externas, que interagem com diversos fatores internos, tais como personalidade. Aqui, descrevemos um protocolo comportamental concebido para o estudo da influência da personalidade de zebrafish na sua resposta de orientação para múltiplas pistas ambientais externas, especificamente as correntes de água e campos magnéticos. Este protocolo tem como objetivo entender se pró-ativa ou reativa zebrafish exibir diferentes limiares de rheotactic (ou seja, a velocidade de fluxo em que o peixe Comece nadando contra a corrente) quando o campo magnético circundante altera sua direção. Para identificar o zebrafish com a mesma personalidade, peixes são introduzidos no escuro metade de um tanque conectado com uma abertura estreita ao meio brilhante. Só proativa peixe explorar o romance, o ambiente luminoso. Peixe reativa não sair a metade escura do tanque. Um túnel de natação com taxas de fluxo baixo é usado para determinar o limiar de rheotactic. Descrevemos duas configurações para controlar o campo magnético no túnel, na faixa de intensidade do campo magnético da terra: uma que controla o campo magnético ao longo da direção de fluxo (uma dimensão) e que permite um controle três-axial do campo magnético. Peixes são filmados enquanto experimenta um aumento gradual da velocidade do fluxo no túnel sob diferentes campos magnéticos. Dados sobre o comportamento de orientação são coletados através de um procedimento de controle de vídeo e aplicados a um modelo logístico para permitir a determinação do limiar rheotactic. Nós relatamos resultados representativos recolhidos de empolamento zebrafish. Especificamente, estes demonstram que o peixe apenas reativo, prudente mostra variações do limiar rheotactic quando o campo magnético varia em sua direção, enquanto peixes proativas não responder a alterações de campo magnético. Esta metodologia pode ser aplicada para o estudo da sensibilidade magnética e rheotactic comportamento de muitas espécies aquáticas, ambos exibindo solitária ou empolamento estratégias de natação.
Introduction
No presente estudo, descrevemos um protocolo baseado em laboratório comportamental que tem o escopo de investigar o papel da personalidade de peixe sobre a resposta de orientação do cardume de peixes para pistas de orientação externa, como correntes de água e campos magnéticos.
As orientador decisões dos animais resultam pesando várias informações sensoriais. O processo de decisão é influenciado pela capacidade do animal para navegar (por exemplo, a capacidade de selecionar e manter uma direção), seu estado interno (por exemplo, necessidades de alimentação ou reprodução), sua capacidade de movimento (por exemplo, biomecânica da locomoção) e vários adicionais fatores externos (por exemplo, hora do dia, interação com coespecíficos)1.
O papel do estado interno ou personalidade animal no comportamento orientação é muitas vezes mal compreendido ou não explorado2. Surgem desafios adicionais no estudo da orientação de espécies aquáticas sociais, que muitas vezes executam coordenada e polarizada de comportamento de movimento de grupo3.
Correntes de água desempenham um papel chave no processo de orientação de peixe. Peixe orientar-se para as correntes através de uma resposta de unconditioned chamado rheotaxis4, que pode ser positivo (ou seja, montante orientada) ou negativo (ou seja, a jusante de orientação) de água e é usado para várias atividades, que variam de forrageamento para a minimização de despesas energético5,6. Além disso, um crescente corpo de literatura relata que muitas espécies de peixes usam o campo geomagnético para orientação e navegação7,8,9.
O estudo do desempenho rheotaxis e natação no peixe geralmente é conduzido em câmaras de fluxo (calha), onde peixes são expostos ao aumento gradual da velocidade do fluxo, de baixa para alta velocidade, muitas vezes até a exaustão (chamada velocidade crítica)10, 11. Por outro lado, estudos anteriores investigaram o papel do campo magnético na orientação através da observação do comportamento de natação dos animais em arenas com água parada12,13. Aqui, descrevemos uma técnica de laboratório que permite aos pesquisadores estudar o comportamento dos peixes enquanto manipular tanto as correntes de água e o campo magnético. Este método foi utilizado pela primeira vez em cardume de peixe-zebra (Danio rerio) em nosso estudo anterior, levando à conclusão de que a manipulação do campo magnético circundante determina o limite de rheotactic (ou seja, o mínimo de água velocidade em que cardume de peixe orient montante)14. Este método baseia-se o uso de uma câmara de calha com fluxos lentos, combinados com uma configuração projetada para controlar o campo magnético no canal da, dentro da escala de intensidade do campo magnético da terra.
O túnel de natação utilizado para observar o comportamento de zebrafish é descrito na Figura 1. O túnel (feito de um cilindro de acrílico de nonreflecting com um diâmetro de 7 cm e 15 cm de comprimento) é conectado a uma configuração para o controle do fluxo taxa14. Com esta configuração, a gama de caudais no túnel varia entre 0 e 9 cm/s.
Para manipular o campo magnético no túnel de natação, usamos duas abordagens metodológicas: a primeira é unidimensional e o segundo é tridimensional. Para qualquer aplicação, esses métodos manipulam o campo geomagnético para obter condições magnéticas específicas em um volume definido de água — assim, todos os valores de intensidade de campo magnético relatados neste estudo incluem o campo geomagnético.
No que se refere a unidimensional abordagem15, o campo magnético é manipulado ao longo da direção do fluxo de água (definida como o eixo x) usando um solenoide enrolado no túnel de natação. Isto está ligado a uma unidade de energia, e ele gera o uniforme de campos magnéticos estáticos (Figura 2A). Da mesma forma, no caso a abordagem tridimensional, o campo geomagnético no volume que contém o túnel de natação é modificado usando bobinas de fios elétricos. No entanto, para controlar o campo magnético em três dimensões, as bobinas tem o desenho de três pares de Helmholtz ortogonais (Figura 2B). Cada par de Helmholtz é composto de duas bobinas circulares orientadas ao longo de três direções ortogonais do espaço (x, ye z) e equipado com um magnetômetro três-axial, trabalhando em condições de circuito fechado. O magnetômetro trabalha com intensidades de campo comparáveis com o campo da terra natural, e está localizado próximo ao centro geométrico do conjunto de bobinas (onde está localizado o túnel de natação).
Implementamos as técnicas descritas acima para testar a hipótese de que os traços de personalidade dos peixes compondo um cardume influenciam a maneira que eles respondem a campos magnéticos16. Podemos testar a hipótese de que indivíduos com personalidade proativos e reativos17,18 respondem de forma diferente quando expostos à água flui e campos magnéticos. Para testar isso, primeiro resolvemos o zebrafish usando uma metodologia estabelecida para atribuir e os indivíduos do grupo que são proativa ou reativa17,19,20,21. Em seguida, avaliamos o comportamento rheotactic do zebrafish nadando em cardumes, composta por apenas indivíduos reativos ou composta por apenas proativos indivíduos no tanque calha magnética, que apresentamos como dados de amostra.
O método de classificação baseia-se a tendência diferente dos indivíduos proativos e reativos para explorar novos ambientes21. Especificamente, nós usamos um tanque dividido em um brilhante e um lado negro17,19,20,21 (Figura 3). Animais são aclimatados ao lado negro. Quando o acesso para o lado positivo é aberto e proativo indivíduos tendem a sair rapidamente a metade escura do tanque para explorar o novo ambiente, enquanto o peixe reativo não deixe o tanque escuro.
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Protocol
O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comitê de uso da Universidade de Nápoles Federico II, Nápoles, Itália (2015) e institucionais Cuidado Animal.
1. animal manutenção
- Use tanques de pelo menos 200 L para hospedar um cardume de no mínimo 50 indivíduos de ambos os sexos em cada tanque.
Nota: A densidade dos peixes no tanque tem que ser um animal por 2 L ou inferior. Sob essas condições, o zebrafish exibirá empolamento de comportamento normal. - Definir as condições de manutenção, como segue: temperatura 27 – 28 ° c; condutividade a < 500 μS; pH 6,5-7,5; Não há3 no < 0,25 mg/L; e um fotoperíodo de luz: escuro a 10 h:14 h.
Nota: Condições de exploração idêntico devem ser usadas tanto para a população mista e as populações separadas proativas e reativas.
2. personalidade seleção no Zebrafish
- Prepare-se e coloque o reservatório de seleção de personalidade em um quarto silencioso (Figura 3) com a mesma água usada nos tanques de manutenção.
- Coloque uma câmera de vídeo acima ou ao lado do tanque. Conectar a câmera a um computador com um monitor localizado em uma área onde não há nenhum contato visual com o tanque.
- 9 selecione aleatoriamente de peixes do tanque de manutenção e transferi-los para o lado negro do tanque personalidade seleção, usando uma rede sem nós.
Nota: Tente limitar as interações com os tanques e o peixe para o mínimo de tempo possível. Evite barulho e movimentos rápidos. Se necessário, transferi os animais em um pequeno volume de transporte de tanque (cerca de 2 L) com água do respectivo depósito. Para evitar a exposição de ar de animais, use um copo de 250 ml e suavemente induzir o animal a entrar o copo. Tente minimizar o tempo de captura, evitar coletar vários peixes, que podem causar danos físicos aos animais e não segurar peixe por mais de alguns segundos na net como estes fatores podem aumentar o stress. Peixes devem ser alimentados ad libitum, antes da transferência para o tanque experimental. Isso limita a possibilidade de que diferentes tendências de comportamento de busca de alimento afetaria o comportamento dos indivíduos durante o experimento seguinte22. Realizar experimentos de replicar a mesma hora do dia. Isso minimiza a variabilidade no comportamento dos grupos experimentais causadas por possíveis ritmos circadianos23. - Depois de 1h de aclimatação, abra a porta de correr.
Nota: Os indivíduos que saem do buraco, explorando o lado positivo do tanque dentro de 10 min, são considerados proativa21. - Depois de 10 min, suavemente remover os indivíduos proativos do tanque e transferi-los para o tanque de manutenção proativa.
- Depois de 15 min, recolher os peixes que permanecem na caixa escura, que são consideradas reativas21e transferi-los para o tanque de manutenção reativa.
Nota: Descarte de peixes que se movem para o lado positivo do tanque após 10min21. Realize o teste de personalidade com nove peixes de cada vez até que o número desejado de peixe proativos e reativos necessários para os testes descritos na seção 5 é coletado. Consistência da personalidade pró-ativa e reativa pode ser verificada regularmente, usando a mesma abordagem.
3. configurar do campo magnético com a manipulação de campo magnético One-dimensional27
- Liga a unidade de potência (Figura 2A).
- Coloque o túnel espiral no local onde o protocolo rheotactic será realizada (secção 5), mas mantê-lo desconectado do aparelho de natação (Figura 2A). Coloque uma sonda magnética conectada com um Gauss/Teslameter dentro do túnel e verifique se a tensão que é necessário para obter o valor do campo magnético escolhido ao longo do eixo principal do túnel.
Nota: Por causa das propriedades magnéticas de um solenoide, o campo é razoavelmente uniforme dentro do túnel; Isto pode ser verificado, movendo lentamente a sonda, tanto horizontal como verticalmente. - Desconecte a sonda e conectar o túnel de fluxo para o aparelho de natação.
- Começar com o protocolo rheotactic (secção 5).
4. ajuste do campo magnético com campo magnético tridimensional manipulação27
- Liga o CPU, DAC e drivers de bobina (Figura 2B).
- Defina o campo magnético escolhido em cada um dos três eixos (x, y e z).
- Coloque o túnel no centro do conjunto de pares de Helmholtz.
- Começar com o protocolo rheotactic (secção 5).
5. teste do Zebrafish Rheotaxis na câmara de fluxo
- Transferência de peixes de um a cinco anos para o túnel de fluxo usando um tanque de 2 L, com os lados e no fundo obscurecido.
- Ligue a bomba e definir a taxa de fluxo no túnel a 1,7 cm/s.
Nota: Esta água lento irá manter a água no túnel oxigenado e facilitará a recuperação do animal. - Deixe os animais se aclimatar ao túnel de natação por 1h.
- Inicie a gravação de vídeo do comportamento dos peixes no túnel.
Nota: Usamos uma câmera (por exemplo, ação de Yi 4K) com controle remoto (por exemplo, Bluetooth) e salva o vídeo como. mpg (30 quadros/s). - Iniciar o aumento gradual da taxa de fluxo de acordo com o protocolo experimental escolhida (1,3 cm/s neste estudo; A Figura 4).
Nota: Para este protocolo, usamos taxas de baixo fluxo, que, para o peixe-zebra, no intervalo de 0 a 2,8 BL (comprimentos corporais) / s. Estas velocidades de fluxo são na faixa de baixa das taxas de fluxo que induzem contínua natação orientada no zebrafish (3 – 15% da velocidade crítica de natação [Ucrit])24. O uso de taxas de baixo fluxo (protocolo25) de Brett seguir está ligado às características comportamentais específico desta espécie na presença de correntes de água. Zebrafish tendem a nadar ao longo do eixo maior da câmara, girando frequentemente, mesmo na presença de água flow e tendem a nadar a montante e a jusante24,26. Esse comportamento é afetado pela taxa de flow de água, desaparecendo a velocidades relativamente elevadas (> 8 BL/s)26, quando os animais nadam continuamente virada para montante (resposta rheotactic total positiva). Deslocamentos verticais e transversais são muito raros. -
Execute morfometria dos animais (sexo e o comprimento total [TL], comprimento do garfo [FL] ou BL) em fotos de peixe em uma câmara de morfometria.
- Selecione a imagem apropriada.
- Abra a imagem no ImageJ.
- Tome nota do sexo do animal (zebrafish masculino são delgado e tendem a ser amarelada, enquanto as fêmeas são mais arredondadas e tendem a ter colorações azuis e brancas).
- Clique em analisar > Definir escala e definir a escala da imagem em centímetros, usando o comprimento inteiro horizontal do túnel como referência.
- Clique em analisar > medida e registro o comprimento linear do animal.
- Calcule o peso do seu corpo (BW).
Nota: BW é calculado a partir de relações de sexo-FL-BW anteriormente construídas no laboratório ou metadados. Todo o procedimento evita o estresse da manipulação dos animais.
6. vídeo monitoramento
- Abra o arquivo de vídeo com análise de vídeo 4.84 Tracker e ferramenta de modelagem.
Nota: Se necessário, corrigi qualquer distorção de vídeo usando a perspectiva e distorção radial inaladas. - Clique em sistema de coordenadas no menu superior e definir as unidades de comprimento para centímetros e as unidades de tempo de segundos.
- Clique em arquivo > importar > vídeo e abrir um dos vídeos em 4.84 Tracker.
- Clique em "Eixos coordenados" e definir o sistema de referência para controlar a posição do peixe ao longo do tempo, com o eixo x ao longo do túnel. Defina a origem no canto baixo da jusante terminando a parede (para a tomadade água).
- Clique na faixa > nova > ponto de massa e iniciar o acompanhamento de um peixe de cada vez. Acompanhar o último 5 min de cada passo que o peixe passou a cada taxa de fluxo.
- Avance o vídeo manualmente em intervalos de cinco-quadro (0,5 s) e marcar o tempo e a posição do animal em cada turno de montante-jusante (UDt; pontos vermelhos na Figura 5) e em cada turno a jusante-upstream (DUt; pontos azuis na Figura 5).
Nota: Use a posição do olho de peixe como referência para posição dos pesqueiros. Controle a posição do animal usando uma ponto de massa. Excluir o controle de qualquer período de natação não orientado (ou seja, tempo de manobra). - No final de cada sessão de rastreamento, selecione os valores de x e tempo valores da tabela no canto inferior direito da janela do software. Botão direito do mouse sobre os dados e clique em copiar dados > precisão total.
- Salvar os valores de tempo e valores de todas as posições de giro x em um arquivo de modelo de planilha para calcular o tempo de montante total (soma de todos os intervalos entre UDts e poeiras) e o tempo total de jusante (soma dos intervalos entre poeiras e UDt), bem como os valores do índice de rheotactic, em percentagem (%) de RI) para cada fluxo passo (ver Figura 5).
Nota: O comportamento rheotactic é quantificado pela proporção do tempo total orientada para que os peixes passam virada para montante (natação ou raramente congelamento [ou seja, eles ficam ainda no fundo do túnel]27). Esta proporção é definida como a % de RI (Figura 5).
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Representative Results
Como dados de exemplo, apresentamos resultados obtidos controlando o campo magnético ao longo da direção do fluxo de água em proativos e reativos empolamento zebrafish16 usando a configuração mostrada na Figura 2A (ver secção 3 do protocolo). Esses resultados mostram como o protocolo descrito pode destacar as diferenças nas respostas ao campo magnético em peixes com personalidades diferentes. O conceito global desses ensaios depende da constatação de que a direção do campo magnético em relação ao fluxo de água afeta o limite de rheotactic em cardume zebrafish14. Assim, como alterações no campo magnético modulam o rheotaxis, este protocolo pode ser usado para avaliar se a resposta do zebrafish para campos magnéticos são diferentes de acordo com sua personalidade pró-ativa ou reativa28.
Em primeiro lugar, usando o tanque escuro/brilhante, como mostrado na Figura 3, o zebrafish foram divididos em grupos diferentes de acordo com sua personalidade pró-ativa/reativa. Após um teste, cardumes de cinco peixes com a mesma personalidade então foram testados no túnel de natação de solenoide (Figura 1 e Figura 2A). Um total de 20 peixes foram testadas: dois cardumes composto de cinco peixes reativas cada (10 peixes reativas) e dois cardumes composto de cinco peixes proativas cada (10 peixes proativas).
Um cardume de cada vez foi vídeo gravado enquanto nadava no túnel e a água corrente foi acelerada com um aumento gradual da taxa de fluxo, como mostrado esquematicamente na Figura 4. Os peixes foram autorizados a se aclimatar por 1h no túnel. Depois disso, aplicamos o protocolo para a quantificação do comportamento rheotactic, usando um aumento gradual da taxa de fluxo de acordo com o clássico Brett protocolo25. Especificamente, a taxa de fluxo aumentou 0,4 BL/s cada 10 min para um total de sete etapas consecutivas (Figura 4). O comportamento do zebrafish foi gravado ao longo de toda a duração do percurso no túnel (70 min), e o valor de RI a cada passo foi calculado (ver protocolo passo 6.8).
Durante as execuções no túnel de natação, o campo magnético foi fixado em uma das duas condições seguintes: 50 μT a jusante (ou seja, o componente horizontal do campo magnético [ao longo do eixo x] tinha a mesma direção do fluxo de água) e 50 μT montante (ou seja, o componente horizontal do campo magnético teve uma direção oposta em relação ao fluxo de água)16. A intensidade ao longo de eixos y e z não foram afetados, bem como a intensidade total e a inclinação do vetor campo magnético. Cada cardume de cinco peixes foi exposto a apenas uma das duas condições magnéticas. Por exemplo, considerando o peixe proativa, um cardume proativa tinha campo magnético dirigido a jusante e o outro cardume proativo tinha campo magnético dirigido contra a corrente.
Os vídeos foram então analisados com o software de controle de vídeo (seção 6 do protocolo). Os peixes foram vídeo gravado para toda a duração do percurso no túnel de natação. No entanto, somente o último 5 min. de cada 10 min de duração de aumento gradual da taxa de fluxo (Figura 4) foram rastreados. Durante o tempo controlado, foram destacadas as voltas de cada peixe em cada taxa de fluxo (Figura 5, os pontos de dados de vermelho e azul). Estes foram então usados como referências para calcular o RI de cada peixe e cada velocidade de fluxo (Figura 5). O índice de RI varia entre 0% e 100%. Quando abaixo de 50%, índice RI indica que os peixes exibido rheotaxis negativo (prevalência de natação a jusante); Quando o RI for superior a 50%, mostra que o animal tinha uma resposta positiva de rheotactic (prevalência de nadar rio acima). Um RI não é significativamente diferente de 50% indicam uma ausência de resposta rheotactic. Em seguida foram a média dos valores de RI % de todos os cinco peixes em cardume em cada taxa de fluxo. Estes dados em média eram arco seno transformado e usado para caber as curvas exibidas na figura 6A. Assim, o índice rheotactic sigmoidally aumenta quando aumenta a velocidade da água, permitindo a quantificação do rheotaxis com um método simples de matemático. A relação entre o RI e a taxa de fluxo pode ser equipada com o seguinte modelo logístico-sigmoidal.
Três parâmetros e sua variabilidade podem ser derivadas a partir da curva de ajuste. O RIplanalto mede a tendência máxima dos animais para orientar a montante no intervalo de taxas de fluxo usado no experimento. RIinferior é o valor de RI na ausência de fluxo de água e, hipoteticamente, não deve diferir 50%. Rtr é a é a taxa de fluxo no qual ocorre a inclinação máxima da curva, e pode ser usada como uma medida do limiar rheotactic6.
Os resultados indicam que o limite de rheotactic (Rtr) de zebrafish é muito baixo, na faixa de alguns centímetros por segundo. Variações do campo magnético não afetam a Rtr de peixe proativa (nenhum efeito do campo magnético, t-test, P > 0,05). Oposta, alterações de campo magnético têm um efeito pronunciado sobre o comportamento rheotactic do zebrafish reativo. Quando o componente do campo magnético ao longo do túnel de natação foi dirigido a jusante, o Rtr é muito baixo e semelhante do peixe proativa. O limite foi significativamente maior quando o campo magnético foi dirigido contra a corrente (t-test, P < 0,01).
O valor doplanalto RI dos animais reativos foi significativamente menor quando o campo magnético foi dirigido contra a corrente (t-test, P < 0,01). Este resultado indica que com estas condições, peixe reativa atingiria a resposta rheotactic total positiva (RI = 100%) Só em taxas de fluxo muito elevado. Assim, este resultado evidencia que, comparado a Rtr, RIplanalto fornece menos informação sobre o comportamento de natação dos peixes. De fato, baseado na diferença forte no RI reativaplanalto entre as duas condições magnéticas, podemos afirmar que, sob o campo magnético orientado a montante, os animais reativos provavelmente exibirá uma resposta completa rheotactic em uma água mais elevada fluxo.
Valores de RIinferior tendem a ser mais elevado (embora não significativa) de 50% nos animais proativos e nos reativos animais expostos a um campo magnético orientado a jusante. Isso pode indicar um viés no protocolo, desde que os animais caracterizados por um limiar muito baixo podem lembrar a direção do fluxo experiente durante a aclimatação. Um protocolo adequado poderia ser concebido para testar essa possibilidade.
Figura 1: Representação simplificada de natação túnel aparelhos utilizados no presente estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Setup para controle de campo magnético. (A) processamento do túnel natação com um solenoide para a indução de um campo magnético estático, horizontal dentro do túnel. O solenoide (0,83 voltas/cm) é conectado a uma unidade de energia e gera campos no intervalo de ±250 µT (escala de intensidade que inclui intervalo de campo magnético da terra). No lado direito, é mostrada uma foto do túnel solenoide conectado ao aparelho de natação. O túnel é feito de acrílico e tem duas placas acrílicas perfuradas colocadas na entrada de água, que garantem o fluxo para estar perto de laminar. (B) diagrama e a foto de três pares de Helmholtz ortogonais de conjunto para o controle do campo magnético na faixa geomagnético das intensidades. A sonda de campo magnético, a CPU, o conversor digital-analógico e os drivers de bobina usados para fechar o ciclo também são mostrados. Cada par de bobinas é composto de duas bobinas circulares com um raio (r) de 30 cm e N = 50 voltas do AWG-14 fios de cobre. Um magnetômetro de três eixos (sensor) com escala selecionável (± 88 µT para ± 810 µT) é colocado perto do centro do conjunto de bobina. A escala do sensor é definida como valores que variam de ±130 µT. Esses valores também foram utilizados para as medições descritas nos resultados representativos (nestas condições, a resolução do sensor nominal é sobre 0,1 µT). A intensidade e a direção do campo magnético são controlados com um sistema de realimentação digital. O sensor mede os três componentes do vetor campo magnético (três eixos), e os correspondentes sinais de erro são extraídos. Em seguida, os sinais de correção são gerados por um filtro simples integrador. Os sinais de correção digital são convertidos em tensão por um conversor analógico-digital e amplificados por um driver apropriado da bobina. Estes sinais são usados para conduzir os pares de Helmholtz. A frequência de amostragem é fixo de 5 Hz e a frequência de ganho de unidade das argolas é cerca de 0,16 Hz. Uma vez que as correntes nos pares de bobinas de Helmholtz são definidas, o campo magnético total varia de menos de 2% de seu valor de intensidade média no volume cúbico central (com borda [L] = 10cm) das bobinas. Durante as medições, o rms de campo magnético é menos de 0,2 µT. Em ambas as configurações (painéis A e B) um campo elétrico estático é gerado pela corrente nas bobinas produzir o campo magnético de16. A intensidade do campo elétrico é aproximadamente 0,4 V/m, quando a corrente máxima é aplicada; Esse valor é insignificante comparado ao naturais ou artificiais campos estáticos presentes no ambiente cuja intensidade é da ordem de 1 kV/m17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação esquemática do tanque (40 x 40 cm x 40 cm) usado para separar proativa de indivíduos reativos zebrafish (não em escala), de acordo com Rey et al.21. O volume do tanque de seleção a personalidade é 50 que l. metade do tanque foi ocupada por uma caixa escura com um buraco de 5 cm de diâmetro na lateral da caixa virada para a brilhante metade do tanque. O buraco foi coberto por uma porta de correr (não mostrada), cuja abertura assinado o início de um processo de seleção. O lado negro do tanque precisa uma tampa removível para permitir o acesso de redes de mão. Isso facilita a colocação ou captura de peixes antes e após os testes comportamentais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diagrama das taxas de fluxo usado durante os ensaios para determinar o limiar rheotactic de zebrafish. O fluxo durante o período de aclimatação de 1h foi suficiente para garantir um suprimento de oxigênio adequado para os animais. Pode-se supor que, com este projeto, fornecimento de oxigênio nunca é um limite, até mesmo na primeira etapa 10 min com fluxo de 0. De fato, com um teor de oxigénio da água a 27 ° C, de cerca de 7,9 mg/L e um consumo de oxigênio animais de 1 mg/h.g (uma aproximação em excesso para o consumo de oxigênio de zebrafish tanto sob condições rotineiras [Uliano et al.29] e em baixa velocidade natação [Palstra et Al.30]), é possível calcular que, na ausência de fluxo, o Po2 no canal da não diminuirá mais de 2% por animal, permanece bem acima da crítica Po2 (cerca de 40 torr para zebrafish). Esta figura foi modificada de Cresci et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comportamento animal no túnel e o cálculo do RI. Os gráficos apresentam a posição de um animal individual ao longo do eixo x durante um registro s 300 em três valores de taxa de fluxo. Os pontos vermelhos representam as curvas de jusante para montante, o azul os pontos das curvas de montante para jusante. O correspondente tempo intervalos gastos pelos animais a jusante ou montante são também relatados, e os tempos totais de upstream e downstream são relatados, de que pode ser calculado um valor de RI. Observa-se que ao aumentar a taxa de fluxo, o tempo de montante e aumentam os valores de RI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Resultados representativos. (A) relação entre valores de RI arco seno-transformadas (RI é a porcentagem do tempo total orientada que peixe passa virada para montante) e a taxa de fluxo para proativo e reativo zebrafish empolamento sob duas condições de campo magnético ao longo do fluxo direção de taxa (controle de uma dimensão). Cada ponto de dados é a média dos valores de RI dos cinco peixes compondo o cardume, em cada taxa de fluxo. Diferenças significativas entre as curvas foram testadas através de uma soma de quadrados F-teste (alfa = 0,05)14. Eixos de campo magnético (B) e a direção da água fluam no túnel. Uma representação tridimensional dos vetores magnéticos nas condições dois campo magnético utilizados neste estudo também é mostrada. O campo magnético no laboratório (40 ° N, 14 ° E) era: F = μT 62; Eu = 64°; D = 44°. Esta figura foi modificada de Cresci et al16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito neste estudo permite aos cientistas quantificar respostas de orientação do complexo de espécies aquáticas, resultantes da integração entre as duas pistas externas (campo de água corrente e geomagnético) e um fator interno do animal, tais como personalidade. O conceito geral é criar um projeto experimental que permite aos cientistas separar indivíduos de personalidade diferente e investigar o comportamento de orientação enquanto controlando separadamente ou simultaneamente as pistas ambientais externas.
O protocolo descrito neste estudo, juntamente com a definição matemática do índice rheotactic (RI), foi projetado seguindo observações preliminares do comportamento de zebrafish no túnel de natação. Quando colocado em um túnel, estes animais exibem dois tipos de padrões de comportamento, tanto na ausência ou presença de água flow: orientada para a natação e manobras. Eles passam a maior parte do tempo orientado (geralmente, os peixes eram vídeo gravado para mais de 95% do tempo) nadando ao longo do túnel (ou seja, orientado ao longo do eixo com um ângulo inferior a 45°), e para trás, girando na proximidade das paredes final e muitas vezes Soares devido a thigmotaxis (ou seja, natação perto das paredes do túnel)27.
Para este protocolo para ser bem sucedido, é importante que quem executa a experiência presta atenção ao stress dos animais. O transporte dos peixes entre as configurações experimentais deve ser executado com cuidado. O uso de redes de mão deve ser tão rápido quanto possível e algum treinamento antes que a experiência é altamente recomendada como zebrafish são nadadores rápidos e difíceis de pegar num tanque. Estresse pode afetar drasticamente o comportamento destes animais, e no caso de zebrafish, pode mudar significativamente sua natação comportamento27. Isso provavelmente afetaria os resultados, como o peixe pode exibir comportamento hiperativo e ser menos sensível aos fluxos de água e alterações de campo magnético. Contato com os animais na instalação experimental deve ser tão rápido e curto possível. A análise comportamental requer observação remota, que também requer prática. Além disso, é importante analisar os vídeos cegamente (i.e., sem saber os protocolos e tratamentos).
O comportamento rheotactic de muitas espécies de peixes foi estudado usando túneis de natação5,10,11,31. Numerosos estudos anteriores centrou-se a estimativa da velocidade natação que pode sustentar o peixe até a exaustão, que é definido como Ucrit, principalmente para testar hipóteses fisiológicas e ecológicas11,32, 33. o método descrito neste estudo centra-se, em vez disso, o comportamento rheotactic em velocidades de fluxo baixo. Esta escolha foi feita porque o objetivo deste estudo é avaliar a sensibilidade para uma sugestão sutil e fraca como o campo magnético através da observação de um comportamento de orientação bem conhecida e robusta de peixe, o rheotaxis positivo. Nos resultados do representante aqui relatados, zebrafish exibido um limiar muito baixo rheotactic (apenas alguns centímetros por segundo). Esta observação pode ser ecologicamente relevante para esta espécie, que habita ambientes onde a velocidade das correntes de água pode variar significativamente. Zebrafish viver tanto em rios turbulentos34 e em corpos d'água onde a água se move lentamente, como arrozais, lagoas e várzeas35. Quando a água se move lentamente, a capacidade de detectar e orientar-se em velocidades de fluxo baixo (um baixo limiar rheotactic) poderia ser vantajosa, como a resposta rheotactic aumenta as chances de interceptar a jusante-deriva de rapina36 e fornece estímulos direcionais para migração37.
Estas observações não poderiam ser feitas usando fluxos com taxas elevadas. Estas seriam eliciar uma forte resposta locomotora isso depende mais das condições de corpo e natação de alta performances de animais, ao invés de sinais externos, como o campo magnético. O protocolo aqui apresentado foi aplicado no zebrafish, mas é provável, adequado para qualquer espécie de água doce ou marinho que habitam ambientes com móveis de água e pode ser tratada em condições de laboratório.
No entanto, este protocolo apresenta algumas limitações. Enquanto ele claramente destaca-se uma espécie é sensível ou nonsensitive a campos magnéticos, ele não pode revelar os mecanismos de orientação, através do qual o animal usa campos magnéticos para as decisões do movimento. A fim de investigar os mecanismos de orientação magnética em espécies aquáticas, configurações com arenas circulares e água parada7,38,39 ou labirintos13 são comumente usadas. No entanto, peixe (e dos animais aquáticos em geral) não vivem em ambientes onde as correntes estão ausentes, e o método apresentado é uma primeira tentativa de investigar a resposta comportamental Integrativa ao onipresente pista fiável, como a água flui e magnético campos. Outra limitação deste protocolo é o procedimento manual de controle de vídeo. Integrar esta configuração com um software de rastreamento automático iria melhorar o calendário do processo de análise de dados.
O protocolo experimental apresentado aqui é o primeiro desenhado para investigar a influência da personalidade do animal na sensibilidade magnética e rheotaxis. Este tópico tem sido negligenciado na literatura e precisa ser mais explorado. Indivíduos da mesma espécie, ou mesmo dentro de uma população ou um pequeno grupo (como um cardume de peixes), caracterizam-se por personalidade diferentes traços22,,40, que pode ser um fator importante em estudos migratórios, exploratória, navegação e comportamento de orientação. Nem todos os indivíduos integram as pistas ambientais da mesma forma. Assim, tendo em conta factores internos, tais como personalidade, pode ajudar a reduzir a variabilidade de dados que é comumente observada em estudos sobre o movimento ecologia16.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado pela Fundação de pesquisas básicas do departamento de física e departamento de biologia da Universidade de Nápoles Federico II. Os autores Agradecemos o apoio estatístico Dr. Claudia Angelini (Instituto de aplicado cálculo, Consiglio Nazionale delle Ricerche [CNR], Itália). Os autores Obrigado Martina Scanu e Silvia Frassinet para sua assistência técnica de coleta de dados e os técnicos departamentais F. Cassese, Passeggio G. e R. Rocco por sua assistência hábil na concepção e realização da instalação experimental. Agradecemos a Laura Gentile para ajudar a fazer a experiência durante as filmagens de vídeo. Agradecemos a Diana Rose Udel da Universidade de Miami para fotografar as declarações da entrevista de Alessandro Cresci.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9500 G meter | FWBell | N/A | Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT |
| AD5755-1 | Analog Devices | EVAL-AD5755SDZ | Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter |
| ALR3003D | ELC | 3760244880031 | DC Double Regulated power supply |
| BeagleBone Black | Beagleboard.org | N/A | Single Board Computer |
| Coil driver | Home made | N/A | Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI) |
| Helmholtz pairs | Home made | N/A | Coils made with standard AWG-14 wire |
| HMC588L | Honeywell | 900405 Rev E | Digital three-axis magnetometer |
| MO99-2506 | FWBell | 129966 | Single axis magnetic probe |
| Swimming apparatus | M2M Engineering Custom Scientific Equipment | N/A | Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback |
| TECO 278 | TECO | N/A | Thermo-cryostat |
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