Summary
Vi beskriver en beteendevetenskaplig protokoll utformat för att bedöma hur zebrafiskars personligheter påverka deras svar att vatten strömmar och svaga magnetfält. Fiskar med samma personligheter avgränsas utifrån deras utforskande beteende. Sedan observeras sin rheotactic orientering beteende i en simning tunnel med en låg flödeshastighet och under olika magnetiska förhållanden.
Abstract
För att orientera sig i sin miljö, integrera djur en rad olika externa ledtrådar, som interagerar med flera interna faktorer, såsom personlighet. Här beskriver vi ett beteende protokoll utformat för att studera Zebrafiskar personlighet påverkar deras orientering svar till flera externa miljö ledtrådar, särskilt vattenströmmar och magnetiska fält. Detta protokoll syftar till att förstå huruvida proaktiv eller reaktiva Zebrafiskar Visa olika rheotactic tröskelvärden (dvs. flödet hastighet då fisken börjar simning uppströms) när omgivande magnetfältet ändrar dess riktning. För att identifiera Zebrafiskar med samma personlighet, införs fisk i det mörka halvåret en tank ansluten med en smal öppning till ljusa hälften. Endast aktiv fisk utforska roman, ljus miljö. Reaktiva fisk avsluta inte den mörka halvan av tanken. En simning tunnel med låga flöden används för att bestämma rheotactic tröskelvärdet. Vi beskriver två sätt att styra det magnetiska fältet i tunneln, i spänna av jordens magnetfält intensitet: en som styr det magnetiska fältet längs flödesriktningen (en dimension) och en som gör en tre-axial kontroll av magnetfältet. Fisk är filmade samtidigt upplever en stegvis ökning av flödet hastighet i tunneln under olika magnetiska fält. Uppgifterna på beteendet orientering insamlas genom ett förfarande för video-tracking och tillämpas på en logistisk modell att möjliggöra fastställandet av tröskeln för rheotactic. Vi rapportera representativa resultat samlas in från stimlevande Zebrafiskar. Specifikt visar dessa att bara reaktivt, försiktig fisk visar variationer av tröskeln för rheotactic när magnetfältet varierar i dess riktning, medan proaktiv fisk inte svarar på magnetfält förändringar. Denna metod kan tillämpas på studiet av magnetiska känslighet och rheotactic beteendet hos många vattenlevande arter, både förevisande ensamma eller stimlevande simning strategier.
Introduction
I föreliggande studie beskriver vi ett lab-baserad beteendemässiga protokoll som har omfattningen av undersöker rollen av fisk personlighet om orientering svar stimlevande fiskar till extern orientering ledtrådar, såsom vattenströmmar och magnetfält.
Djur orientering beslut följd väger olika sensorisk information. Beslutsprocessen är influerad av djurets förmåga att navigera (t.ex. kapaciteten att välja och hålla en riktning), dess inre tillstånd (t.ex. utfodring eller reproduktiva behov), dess förmåga att flytta (t.ex. locomotion biomekanik), och flera ytterligare yttre faktorer (t.ex., tid på dagen, interaktion med artfränder)1.
Rollen av inre tillstånd eller djurs personlighet i orientering beteende är ofta bristfällig eller utforskat inte2. I studien av orienteringen av sociala vattenlevande arter, som ofta utför samordnade och polariserade grupp rörelse beteende3uppstår ytterligare utmaningar.
Vattenströmmar har en central roll i processen orientering av fisk. Fisk orientera vatten strömmar genom ett obetingat svar kallas rheotaxis4, som kan vara positiv (dvs, uppströms orienterat) eller negativ (dvs nedströms orienterat) och används för flera aktiviteter, alltifrån födosök till minimering av energisk utgifter5,6. Dessutom rapporterar en växande mängd litteratur att många fiskarter använder det jordmagnetiska fältet för orientering och navigering7,8,9.
Studien av rheotaxis och simning prestanda i fisken utförs vanligen i flödet chambers (flume), där fisken exponeras för en stegvis ökning av flödet hastighet, från låga till höga hastigheter, ofta tills utmattning (kallas kritisk hastighet)10, 11. Däremot, undersökt tidigare studier rollen av magnetfältet i orientering genom observation av beteendet simning djuren i arenor med stilla vatten12,13. Här beskriver vi ett laboratorium-teknik som tillåter forskare att studera beteendet hos fisk medan manipulera både vattenströmmar och magnetfältet. Denna metod användes för första gången på stimlevande Zebrafiskar (Danio rerio) i vår tidigare studie, leder till slutsatsen att manipulering av omgivande magnetfältet avgör rheotactic tröskeln (dvs minimal vatten hastigheten på som stimlevande fiskar orient uppströms)14. Denna metod är baserad på användningen av en vattenränna kammare med långsam flöden kombinerat med en setup konstruerad för att styra magnetfältet i vattenrännan, inom spänna av jordens magnetfält intensitet.
Simning tunneln används för att observera beteendet hos Zebrafiskar beskrivs i figur 1. Tunneln (gjord av en nonreflecting akryl cylinder med en 7 cm i diameter och 15 cm i längd) är ansluten till en setup för kontroll av flödet klassar14. Med denna inställning varierar flöden i tunneln mellan 0 och 9 cm/s.
För att manipulera det magnetiska fältet i simning tunneln, använder vi två metoder: först är endimensionell och andra är tredimensionell. För alla program, dessa metoder manipulera det jordmagnetiska fältet för att få specifika magnetiska villkor i en definierad volym av vatten — således alla värden av magnetfält intensitet rapporterades i denna studie omfattar det jordmagnetiska fältet.
När det gäller den endimensionella förhållningssätt15, magnetfältet är manipulerad längs vatten flödesriktning (definierat som x-axeln) med hjälp av en magnetventil som lindade runt simning tunneln. Detta är ansluten till en kraftenhet, och det genererar enhetliga statiska magnetfält (figur 2A). Likaså när det gäller den tredimensionella metoden ändras det jordmagnetiska fältet i volymen som innehåller simning tunneln med spolar av elektriska ledningar. Men för att styra magnetfältet i tre dimensioner, har spolarna utformningen av tre ortogonala Helmholtz par (figur 2B). Varje Helmholtz par är sammansatt av två cirkulära spolar orienterade längs de tre ortogonala utrymme riktningarna (x, yoch z) och utrustad med en tre-axial magnetometer som arbetar i slutna förhållanden. Magnetometer fungerar med fält intensitet jämförbar med jordens naturliga fältet, och det ligger nära geometriska mittpunkt rullar uppsättningen (där simning tunneln ligger).
Vi genomföra de tekniker som beskrivs ovan för att testa hypotesen att personlighetsdrag hos fisken komponera ett stim påverkar hur de svarar på magnetiska fält16. Vi testar hypotesen att individer med proaktiv och reaktiv personlighet17,18 reagerar olika när de utsätts för vatten rinner och magnetiska fält. För att testa detta, sortera vi först Zebrafiskar använder en etablerad metodik att tilldela och grupp individer som är proaktiv eller reaktiva17,19,20,21. Sedan utvärderar vi rheotactic beteendet hos Zebrafiskar som simmar i stim som består av bara reaktiva individer eller består av endast proaktiv individer i magnetiska flume tanken, som vi presenterar som exempeldata.
Sorteringsmetod är baserad på proaktiv och reaktiv individerna olika tendens att utforska nya miljöer21. Specifikt kan vi använda en tank som uppdelad i en ljus och en mörk sida17,19,20,21 (figur 3). Vänjas till den mörka sidan. När tillträde till den ljusa sidan är öppen, proaktiv tenderar individer att snabbt avsluta den mörka halvan av tanken att utforska den nya miljön, medan reaktiva fisken inte lämna mörka tanken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén av universitetet i Neapel Federico II, Neapel, Italien (2015).
1. animaliskt underhåll
- Använda tankarna på minst 200 L som värd ett stim av minst 50 individer av båda könen i varje tank.
Obs: Tätheten av fisken i tanken måste vara ett djur per 2 L eller lägre. Under dessa förhållanden visas Zebrafiskar normalt shoaling beteende. - Ange underhållsvillkor efter som följer: temperatur på 27-28 ° C; ledningsförmåga vid < 500 μS; pH 6,5 – 7,5; NR3 på < 0,25 mg/L. och en ljus: mörk fotoperiod på 10 h:14 h.
Obs: Identiska innehav villkor måste användas för både den blanda befolkningen och separerade proaktiv och reaktiv befolkningarna.
2. personlighet urval i Zebrafiskar
- Förbereda och placera personlighet urval tanken i ett tyst rum (figur 3) med samma vatten som används i underhåll tankar.
- Placera en kamera ovanför eller vid sidan av tanken. Anslut kameran till en dator med en skärm som ligger i ett område där det finns ingen visuell kontakt med tanken.
- Välj nio fiskar på måfå från underhåll tanken och överföra dem till den mörka sidan av personlighet urval tanken, använda knutlösa nät.
Obs: Försök att begränsa interaktionen med de tankar och fisk till den minsta mängden möjliga tid. Undvik buller och snabba rörelser. Vid behov överföra djuren i en liten volym som transporterar tank (ca 2 L) med vatten från uppsamlingstank. För att undvika luft exponering av djur, Använd en 250 ml bägare och försiktigt inducera djuret att ange bägaren. Försök att minimera insamlingstiden, undvika att samla flera fisk eftersom det kan orsaka fysiska skador på djuren och håll inte fisk i mer än några sekunder i nätet eftersom dessa faktorer kan öka stressen. Fisk måste utfodras ad libitum före överföring till den experimentella tanken. Detta begränsar möjligheten att olika tendenser av mat-söker beteende skulle påverka beteendet hos individer under den följande experiment22. Genomföra replikera experiment på samma tid på dagen. Detta minimerar variationen i beteendet hos de experimentella grupper som orsakas av möjliga dygnsrytmen23. - Efter 1 h av acklimatisering, öppna skjutdörren.
Obs: Individer som kommer ut ur hålet, utforska den ljusa sidan av tanken inom 10 min, anses vara proaktiv21. - Efter 10 min, försiktigt ta bort de proaktiva individerna från tanken och överföra dem till proaktivt underhåll tank.
- Efter 15 min, samla fisk som finns kvar i den mörka rutan, som anses vara reaktiv21och överföra dem till reaktiva underhåll tank.
Obs: Kassera fisk som flyttar till den ljusa sidan av tanken efter 10 min21. Utföra Personlighetstestet med nio fisk i taget tills önskat antal proaktiv och reaktiv fisk som är nödvändiga för de provningar som beskrivs i avsnitt 5 samlas. Konsekvens av proaktiv och reaktiv personligheten kan kontrolleras regelbundet med hjälp av samma metod.
3. Ställ in av det magnetiska fältet med endimensionella magnetfält Manipulation27
- Växla på strömkällan (figur 2A).
- Placera ringlar tunneln på den plats där rheotactic protokollet ska utföras (avsnitt 5) men behålla den kopplats bort från simning apparaten (figur 2A). Placera en magnetisk sond ansluten med en Gauss/Teslameter inuti tunneln och kontrollera vilken spänning krävs för att uppnå det valda magnetfält värdet längs huvudaxeln av tunneln.
Obs: På grund av de magnetiska egenskaperna hos en solenoid är fältet någorlunda enhetliga inuti tunneln. Detta kan kontrolleras genom att sakta flytta sonden både horisontellt och vertikalt. - Koppla bort sonden och Anslut flöde tunneln till simning utrustningen.
- Börja med protokollet rheotactic (avsnitt 5).
4. ställa upp i det magnetiska fältet med tredimensionella magnetfältet Manipulation27
- Slå på den CPU, DAC och spole drivrutiner (figur 2B).
- Ange det valda magnetfältet på var och en av de tre axlarna (x, y och z).
- Placera tunneln i mitten av Helmholtz par uppsättningen.
- Börja med protokollet rheotactic (avsnitt 5).
5. test av den Zebrafiskar Rheotaxis i flödet kammaren
- Överföra en till fem fisk till flöde tunneln med en 2 L tank med sidorna och botten skyms.
- Slå på pumpen och flödet i tunneln till 1,7 cm/s.
Obs: Detta långsamma vatten kommer att hålla vattnet i tunneln syresatt och det kommer att underlätta djurens återhämtning. - Låt djuren acklimatisera till simning tunneln för 1 h.
- Starta videoinspelningen av uppförandet av fisken i tunneln.
Obs: Vi använde en kamera (t.ex. Yi 4K Action) med fjärrkontroll (t.ex. Bluetooth) och sparas videon som .mpg (30 bildrutor/s). - Starta stegvis ökning av flödet klassar enligt det valda experimentellt protokollet (1,3 cm/s i denna studie; (Se figur 4).
Obs: I detta protokoll, har vi använt låga flöden som för Zebrafiskar, varierar från 0 till 2,8 BL (kroppen längder) / s. Dessa flöde hastigheter är i det lägre spänner av flöden som inducerar kontinuerlig orienterade simning i zebrafisk (3% – 15% av kritiska simhastighet [Ukrit])24. Användning av låga flöden (följande Bretts protokoll25) är kopplad till specifika beteendemässiga egenskaper av denna art i närvaro av vattenströmmar. Zebrafisk tenderar att simma längs huvudaxeln på avdelningen, svarvning ofta, även i närvaro av vatten flöde, och tenderar att simma både uppströms och nedströms24,26. Detta beteende påverkas av andelen vatten flöde, försvinner i relativt höga hastigheter (> 8 BL/s)26, när djuren simmar kontinuerligt inför uppströms (full positiva rheotactic svar). Vertikala och tvärgående förskjutningar är mycket sällsynta. -
Utföra morfometri av djuren (kön och total längd [TL], gaffel längd [FL] eller BL) på bilder av fisk i en morfometriska kammare.
- Välj lämplig bild.
- Öppna bilden i ImageJ.
- Ta del av könsbestämma av djuret (manliga Zebrafiskar är smala och tenderar att vara gulaktig, medan kvinnor är mer rundade och tenderar att ha blå och vita färgämnen).
- Klicka på analysera > Ange skala och ange omfattningen av bilden i centimeter, med tunneln helt horisontell längd som referens.
- Klicka på analysera > mäta och registrera linjära längden på djuret.
- Beräkna dess kroppsvikt (BW).
Obs: BW beräknas från kön-FL-BW relationer tidigare byggt i labbet eller metadata. Hela förfarandet undviker manipulation stress på djuren.
6. video spårning
- Öppna videofilen med Tracker 4,84 videoanalys och modellering verktyg.
Obs: Om nödvändigt, korrigera video snedvridning med perspektiv och radiella distorsion filter. - Klicka på koordinatsystem i den övre menyn och ange längd enheterna till centimeter och enheterna till sekunder.
- Klicka på Arkiv > Importera > Video och öppna en av videorna i Tracker 4,84.
- Klicka på ”samordna axlarna” och ange referenssystemet att spåra placeringen av fisken över tid, med x-axeln längs tunneln. Ange startpunkt vid låg hörnet av nedströms slutar vägg (vid vatten utlopp).
- Klicka på spår > New > punkt av massa och börja spåra en fisk i taget. Spåra de sista 5 min i varje steg att fisken som spenderas på varje flöde.
- Avancera videon manuellt med fem-ram intervall (0,5 s) och markera tid och position av djuret vid varje uppströms-nedströms tur (UDt; röda prickar i figur 5) och vid varje downstream-upstream tur (DUt; blå prickar i figur 5).
Obs: Använd fisken ögat positionen som en referens för fiskens position. Spåra djurets position med hjälp av en punkt massa. Exkludera från spårning någon period av icke-orienterad simning (dvs. manövrering tid). - I slutet av varje spårning session, Välj x-värden och tid värden från tabellen på det nedre högra hörnet av fönstret programvara. Högerklicka på data och klicka på kopiera data > Full precision.
- Spara de tid och x-värdena av alla roterande positioner på en mallfil kalkylblad att beräkna den totala uppströms tid (summan av alla intervallerna mellan UDT och nitar) och nedströms totaltiden (summan av intervallerna mellan nitar och UDt), samt värden rheotactic index i procent (RI %) för varje flöde steg (se figur 5).
Obs: Rheotactic beteendet är kvantifierad andel av den totala orienterade tid som fisken tillbringa vänt mot flödesriktningen (simning eller sällan frysning [dvs, de håller fortfarande på botten av tunneln]27). Denna andel definieras som de RI % (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som exempeldata presenterar vi resultaten styra magnetfältet längs vatten flödesriktning på proaktiv och reaktiv shoaling Zebrafiskar16 med setup visas i figur 2A (se avsnitt 3 i protokollet). Dessa resultat visar hur protokollet beskrivs kan belysa skillnader i Svaren till magnetfältet i fisk med olika personligheter. Det övergripande begreppet dessa prövningar förlitar sig på konstaterandet att riktningen på magnetfältet i förhållande till vattenflödet påverkar rheotactic tröskelvärdet i stimlevande Zebrafiskar14. Således, som förändringar i magnetfältet modulera rheotaxis, detta protokoll kan användas för att bedöma om svar på Zebrafiskar magnetfält varierar beroende på deras proaktiv eller reaktiva personlighet28.
Först, med mörka/ljusa tanken som visas i figur 3, Zebrafiskar delades upp i olika grupper enligt deras proaktiv/reaktiv personlighet. Efter ett sådant test testades sedan stim av fem fiskar med samma personlighet i magnetventil simning tunneln (figur 1 och figur 2A). Sammanlagt 20 fisk testades: två shoals består av fem reaktiva fisk varje (10 reaktiva fisk) och två shoals består av fem proaktiv fisk varje (10 proaktiv fisk).
Ett stim i taget var video inspelad medan du simmar i tunneln och vattnet nuvarande accelererades med en stegvis ökning av flödet klassar som schematiskt visas i figur 4. Fisken fick vänja för 1 h i tunneln. Efter att tillämpat vi protokollet för kvantifiering av rheotactic beteende, med en stegvis ökning av flödet klassar enligt de klassiska Brett protokoll25. Specifikt, ökat flödet med 0,4 BL/s varje 10 min totalt av sju på varandra följande steg (figur 4). Beteendet hos Zebrafiskar spelades under hela körningen i tunneln (70 min), och RI värdet vid varje steg beräknades (se protokollet steg 6,8).
Under körningarna i simning tunneln, magnetfältet var inställd på en av de två följande villkoren: 50 μT nedströms (dvs. den horisontella komponenten [längs x-axeln] av det magnetiska fältet hade samma riktning av vattenflödet) och 50 μT uppströms (dvs, den horisontella komponenten av det magnetiska fältet hade en motsatt riktning när det gäller vattenflödet)16. Intensiteten längs axlarna y och z inte påverkades, samt total intensitet och lutning av magnetfält vektor. Varje shoal av fem fisk var utsatt till endast en av de två magnetiska villkor. Till exempel med tanke på proaktiv fisk, en proaktiv shoal hade magnetfältet riktat nedströms och andra proaktiv grundet hade magnetfält riktade uppströms.
Videor analyserades sedan med video-mjukvara (avsnitt 6 i protokollet). Fisken var video inspelad under hela körningen i simning tunneln. Dock spårades endast de sista 5 min för varje 10 min lång stegvis ökning av flödet (figur 4). Under spårade, vändna av varje fisk vid varje flöde som lyftes fram (figur 5, röda och blå datapunkter). Dessa användes sedan som hänvisningar till beräkna RI varje fisk och varje flöde hastighet (figur 5). RI index varierar mellan 0% och 100%. När under 50%, anger RI index att fisken visas negativa rheotaxis (prevalens av nedströms simning); När RI är högre än 50%, visar det att djuret hade ett positivt rheotactic svar (prevalens av uppströms simning). En RI inte signifikant från 50% skulle indikera en avsaknad av rheotactic svar. RI % av alla fem fiskar i ett stim var sedan medelvärdet på varje flöde. Uppgifterna i genomsnitt var arcsine omvandlas och brukade passa kurvor visas i figur 6A. Således ökar rheotactic index sigmoidally när vatten hastigheten ökar, så att kvantifiering av rheotaxis med en enkel matematisk metod. Förhållandet mellan RI och flödet kan monteras på följande logistic-sigmoidal modell.
Tre parametrar och deras variabilitet kan härledas från fit kurvan. RIplatå mäter maximal tendensen hos djuren att orientera uppströms i spänna av flöden som används i experimentet. RIbotten är RI värdet i avsaknad av vattenflödet och hypotetiskt, bör inte skilja sig från 50%. Rtr är det är flödet som uppstår den maximala lutningen på kurvan, och det kan användas som ett mått på den rheotactic tröskel6.
Resultaten indikerar att tröskelvärdet rheotactic (Rtr) på zebrafisk är mycket låg, i spänna av några centimeter per sekund. Variationer i magnetfältet påverkar inte Rtr proaktiv fisk (ingen effekt av magnetfältet, t-test, P > 0,05). Oppositely, magnetfält förändringar har en uttalad effekt på beteendet rheotactic med reaktiva Zebrafiskar. När komponenten magnetfält längs simning tunneln riktades nedströms, är Rtr mycket låg och liknande till det av proaktiv fisk. Tröskeln var betydligt högre när magnetfältet var riktad uppströms (t-test, P < 0,01).
RIplatå värdet av reaktiva djur var betydligt lägre när magnetfältet var riktad uppströms (t-test, P < 0,01). Detta resultat visar att reaktiva fisk med dessa villkor, skulle nå den fullständiga rheotactic positivt (RI = 100%) endast vid mycket höga flöden. Således detta resultatet belyser att RIplatå jämfört Rtr, och ger mindre information om simning beteendet av fisken. I själva verket kan bygger på starka skillnaden i reaktiva RIplatå mellan de två magnetiska villkor, vi konstatera att, under det uppströms-orienterade magnetfältet, reaktiva djuren troligen visar en full rheotactic svar på en högre vatten flöde.
RIlägsta värdena tenderar att vara högre (men inte signifikant) än 50% i proaktiv djuren och reaktiva djuren utsätts för ett nedströms-orienterade magnetfält. Detta kan indikera en bias i protokollet sedan djuren kännetecknas av en mycket låg tröskel kan minnas flödesriktningen erfarna under acklimatisering. Ett korrekt protokoll kan utformas för att testa denna möjlighet.
Figur 1: Förenklad framställning av simning tunnel apparater som används i den aktuella studien. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Setup för magnetfält kontroll. (A) Rendering av simning tunneln med en solenoid för induktion av ett statiskt, horisontellt magnetfält inom tunneln. Solenoiden (0.83 varv/cm) är ansluten till en strömförsörjningsenhet och det genererar fält i spänna av ±250 µT (intensiteten intervall som innehåller jordens magnetfält utbud). På höger sida visas ett foto av magnetventil tunneln ansluten till simning apparaten. Tunneln är gjord av akryl och har två perforerade akryl skyltar placeras vid vatteninloppet till, som garanterar flödet för att vara nära laminär. (B) diagrammet och foto av de tre ortogonala Helmholtz par in för kontroll av magnetfältet i jordmagnetiska spänna av stödnivåer. Sonden magnetfält, CPU, den digital-till-analog-omvandlaren och spole drivrutinerna brukade stänga slingan visas också. Varje par av spolar består av två cirkulära spolar med en radie (r) på 30 cm och N = 50 vänder AWG-14 kopparledningar. En tre-axlig magnetometer (sensor) med valbar skala (± 88 µT till ± 810 µT) placeras nära centrum av spolen. Intervallet sensor är inställt värde till ±130 µT. Dessa värden användes också för de mätningar som beskrivs i de representativa resultat (i dessa villkor, den nominella Sensorupplösning är ungefär 0,1 µT). Intensiteten och riktningen på magnetfältet styrs med en digital feedback-systemet. Sensorn mäter tre komponenter i magnetfält vektorn (de tre axlarna) och de motsvarande fel signalerna extraheras. Sedan, korrigering signalerna genereras av ett enkelt integrator filter. De digitala korrigeringssignaler konverteras till spänning av en digital-till-analog-omvandlare och förstärks av en lämplig spole drivrutin. Dessa sista signaler används för att driva Helmholtz paren. Samplingsfrekvensen är fast 5 Hz och unity gain frekvensen av slingorna är ca 0.16 Hz. När strömmarna i Helmholtz parar av spolarna är inställda, totala magnetfältet varierar mindre än 2% från dess genomsnittliga intensitetsvärdet centrala Kubikvolymen (med kant [L] = 10 cm) av spolarna. Under mätningarna är magnetfält rms mindre än 0,2 µT. I båda uppställningar (paneler A och B) genereras en statiskt elektriskt fält av aktuellt i spolarna producerar de magnetfält16. Intensiteten i det elektriska fältet är ungefär 0,4 V/m när den maximala strömmen appliceras; Detta värde är försumbar jämfört med naturliga eller konstgjorda statiska fält förekommer i miljön vars intensitet är i storleksordningen 1 kV/m17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk representation av tanken (40 x 40 cm x 40 cm) används för att separera proaktiv från reaktiv Zebrafiskar individer (ej i skala), enligt Rey et al.21. Volymen av personlighet urval tanken är 50 L. hälften av tanken var ockuperat av en ruta med ett hål på 5 cm i diameter på sidan av lådan inför den ljusa halvan av tanken. Hålet var täckt av en skjutdörr (visas inte), vars öppning undertecknades i början av en välja rättegång. Den mörka sidan av tanken behöver en avtagbar klädsel att tillåta åtkomst av hand nät. Detta underlättar utsläppande eller fånga fisk före och efter beteendevetenskapliga prövningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Diagram för de flöden som används under provningarna för att bestämma rheotactic tröskelvärdet på Zebrafiskar. Flödet under perioden 1 h acklimatisering var tillräckligt för att garantera en tillräcklig syretillförsel till djuren. Det kan antas att med denna design, syretillförsel är aldrig en gräns, även i de första 10 min stegen med flöde 0. Faktiskt med en syrehalt på vatten vid 27 ° C på ca 7,9 mg/L och ett djurs syreförbrukning av 1 mg/h.g (approximation överskott Zebrafiskar syre både rutinmässiga villkor [Uliano et al.29] och vid låg hastighet simning [Palstra et Al.30]), är det möjligt att beräkna att, i avsaknad av flöde, Po2 i av flume inte minskar mer än 2% per djur, återstående långt över den kritiska Po2 (ca 40 torr för zebrafisk). Denna siffra har ändrats från Cresci et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Djurs beteende i tunneln och beräkningen av RI. Grafer presenterar positionen för ett enskilt djur längs x-axeln under 300 s rekord på tre värden av flödet. De röda prickarna representerar nedströms-till-upstream svängar, blå prickar uppströms-till-nedströms svängar. Motsvarande tidsintervall som spenderas av djuren nedströms eller uppströms rapporteras också, och de totala uppströms och nedströms tiderna rapporteras, från som en RI-värde kan beräknas. Det kan konstateras att när ökar flödet, uppströms tiden och RI värdena ökar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Representativa resultat. (A) förhållandet mellan arcus sinus-omvandlad RI värden (RI är procentandelen av den totala orienterade tid att fisk vänt mot flödesriktningen) och flödet för proaktiv och reaktiv shoaling Zebrafiskar två magnetfält villkor längs flödet Rate riktning (en-dimension kontroll). Varje datapunkt är genomsnittet av RI värdena av fem fisken komponera grundet, vid varje flödeshastighet. Betydande skillnader mellan kurvor testades via en sum-av-torg F-test (alpha = 0,05)14. (B) magnetfält yxor och riktning av vatten flödet i tunneln. En tredimensionell representation av de magnetiska vektorerna i de två magnetfält villkor används i denna studie visas också. Magnetfältet i labbet (40 ° N, 14 ° E) var: F = 62 μT; Jag = 64°; D = 44°. Denna siffra har ändrats från Cresci et al.16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs i denna studie tillåter forskare att kvantifiera av vattenlevande arter följd av integrationen mellan två externa cues (vatten nuvarande och geomagnetiska fält) och en inre faktor av djuret, som svar på komplexa orientering personligheten. Det övergripande konceptet är att skapa en experimentell design som tillåter forskare att separata individer av olika personlighet och undersöka deras orientering beteende samtidigt kontrollera separat eller samtidigt yttre miljö ledtrådar.
Protokollet beskrivs i denna studie, tillsammans med matematiska definitionen av rheotactic index (RI), utformades efter preliminära iakttagelser av beteendet hos Zebrafiskar i simning tunneln. När den placeras i en tunnel, dessa djur visar två typer av beteendemönster, både i frånvaron eller närvaron av vatten flöde: orienterade simning och manövrering. De tillbringar merparten av den orienterade tid (vanligtvis, fisken var video inspelad för mer än 95% av tiden) simma längs tunneln (dvs orienterade längs den långa axeln med en vinkel som är lägre än 45°), fram och tillbaka, svarvning i närheten av slutet väggarna och ofta sh på grund av thigmotaxis (dvs simma nära väggarna i tunneln)27.
Detta protokoll ska lyckas, är det viktigt att den som utför experimentet uppmärksammar stress av djuren. Transport av fisk mellan de experimentella installationerna ska utföras med omsorg. Användning av hand nät bör vara så snabbt som möjligt, och en del träning innan den faktiska experimentet rekommenderas som zebrafisk är snabba simmare och svårt att fånga i en tank. Stress kan dramatiskt påverka beteendet hos dessa djur, och när det gäller Zebrafiskar, det kan markant ändra deras simning beteende27. Detta skulle förmodligen påverka resultaten, eftersom fisk kan visa hyperaktiva beteende och vara mindre känslig för vatten rinner och magnetfält förändringar. Kontakt med djur i den experimentella setup bör vara så snabb och kort som möjligt. Beteendeanalys kräver fjärrobservation, som också kräver övning. Det är dessutom viktigt att analysera videor blint (dvs. utan att veta protokoll och behandlingar).
Många fiskarter rheotactic beteende har studerats med hjälp av simning tunnlar5,10,11,31. Många tidigare studier fokuserat på uppskattningen av rusade simningen att fisk kan upprätthålla tills utmattning, som definieras som Ukrit, mest för att testa fysiologiska och ekologiska hypoteser11,32, 33. den metod som beskrivs i denna studie fokuserar, i stället på rheotactic beteende vid lågt flöde hastigheter. Detta val gjordes eftersom syftet med denna studie är att bedöma känsligheten för en subtil och svag stickrepliken lik magnetfältet genom observation av en välkänd och robust orientering beteende av fisk, den positiva rheotaxis. Zebrafiskar visas i de representativa resultat redovisas här, en mycket låg rheotactic tröskel (endast några centimeter per sekund). Denna observation kan vara ekologiskt relevanta för denna art, som bebor miljöer där hastigheten på vattenströmmar kan variera avsevärt. Zebrafiskar lever både i turbulenta floder34 och i vattendrag där vattnet rör sig långsamt, till exempel risfält, dammar och flodslätter35. När vatten rör sig långsamt, kan förmågan att upptäcka och orientera vid lågt flöde hastigheter (en låg rheotactic tröskel) möjligen vara fördelaktigt, som rheotactic svar ökar chanserna att avlyssna nedströms-drifting prey36 och ger directional stimuli för migration37.
Dessa observationer kunde inte göras med höga flöden. Dessa skulle framkalla en stark motoriskt svar som skulle bero mer på kropp villkor och hög simning föreställningar djur snarare än yttre ledtrådar som magnetfältet. Det protokoll som presenteras här tillämpades på Zebrafiskar, men sannolikt passar någon sötvatten eller marina arter som bebor miljöer med rörliga vatten och kan hanteras i laboratoriemiljö.
Detta protokoll presenterar emellertid vissa begränsningar. Medan det belyser tydligt om en art är känsliga eller nonsensitive för magnetfält, kan inte det uppenbara orientering mekanismer genom vilka djuret använder magnetfält för rörelse beslut. För att undersöka de magnetiska orientering mekanismerna i vattenlevande arter, används uppställningar med cirkulär arenor och stilla vatten7,38,39 eller labyrinter13 ofta. Men fisk (och vattenlevande djur i allmänhet) inte bor i miljöer där strömmarna är frånvarande, och denna metod är ett första försök att undersöka den integrativa beteendemässiga Svaren till allestädes närvarande riktad ledtrådar, gillar vatten rinner och magnetiska fält. En annan begränsning i detta protokoll är det manuella video-tracking-förfarandet. Att integrera denna setup med en automatisk spårningsprogramvara skulle förbättra tidpunkten för hela data analysprocessen.
Det experimentellt protokoll som presenteras här är den första utformade för att undersöka påverkan av djurs personlighet på magnetiska känslighet och rheotaxis. Detta ämne har förbisetts i litteraturen och måste undersökas ytterligare. Individer från samma art, eller även inom en befolkning eller liten grupp (t.ex. en fisk shoal), kännetecknas av olika personlighet drag22,40, vilket kan vara en viktig faktor i studier på flyttande, utforskande, navigering och orientering beteende. Inte alla individer integrera miljömässiga ledtrådar på samma sätt. Således, med beaktande interna faktorer, såsom personlighet, kunde bidra till att minska data variationen som är vanligt förekommande i studier på rörelse ekologi16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Studien har finansierats av grundläggande forskning grundandet av departementet fysik och biologi institutionen av Neapel universitetet Federico II. Författarna tackar Dr. Claudia Angelini (Institutet för tillämpad kalkyl, Consiglio Nazionale delle Ricerche [CNR], Italien) för statistiska stödet. Författarna tackar Martina Scanu och Silvia Frassinet för teknisk hjälp med att samla in data och avdelnings teknikerna F. Cassese, G. Passeggio och R. Rocco för deras skickliga hjälp i utformningen och förverkligandet av den experimentella setup. Vi tackar Laura Gentile för att hjälpa genomför experimentet under video inspelningen. Vi tackar Diana Rose Udel från University of Miami för skytte intervju uttalanden av Alessandro Cresci.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9500 G meter | FWBell | N/A | Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT |
| AD5755-1 | Analog Devices | EVAL-AD5755SDZ | Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter |
| ALR3003D | ELC | 3760244880031 | DC Double Regulated power supply |
| BeagleBone Black | Beagleboard.org | N/A | Single Board Computer |
| Coil driver | Home made | N/A | Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI) |
| Helmholtz pairs | Home made | N/A | Coils made with standard AWG-14 wire |
| HMC588L | Honeywell | 900405 Rev E | Digital three-axis magnetometer |
| MO99-2506 | FWBell | 129966 | Single axis magnetic probe |
| Swimming apparatus | M2M Engineering Custom Scientific Equipment | N/A | Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback |
| TECO 278 | TECO | N/A | Thermo-cryostat |
References
- Nathan, R., et al. A movement ecology paradigm for unifying organismal movement research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19052-19059 (2008).
- Holyoak, M., Casagrandi, R., Nathan, R., Revilla, E., Spiegel, O. Trends and missing parts in the study of movement ecology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19060-19065 (2008).
- Miller, N., Gerlai, R. From Schooling to Shoaling: Patterns of Collective Motion in Zebrafish (Danio rerio). PLoS ONE. 7 (11), 8-13 (2012).
- Chapman, J. W., et al. Animal orientation strategies for movement in flows. Current Biology. 21 (20), R861-R870 (2011).
- Montgomery, J. C., Baker, C. F., Carton, A. G. The lateral line can mediate rheotaxis in fish. Nature. 389 (6654), 960-963 (1997).
- Baker, C. F., Montgomery, J. C. The sensory basis of rheotaxis in the blind Mexican cave fish, Astyanax fasciatus. Journal of Comparative Physiology A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 184 (5), 519-527 (1999).
- Putman, N. F., et al. An Inherited Magnetic Map Guides Ocean Navigation in Juvenile Pacific Salmon. Current Biology. 24 (4), 446-450 (2014).
- Cresci, A., et al. Glass eels (Anguilla anguilla) have a magnetic compass linked to the tidal cycle. Science Advances. 3 (6), 1-9 (2017).
- Newton, K. C., Kajiura, S. M. Magnetic field discrimination, learning, and memory in the yellow stingray (Urobatis jamaicensis). Animal Cognition. 20 (4), 603-614 (2017).
- Langdon, S. A., Collins, A. L. Quantification of the maximal swimming performance of Australasian glass eels, Anguilla australis and Anguilla reinhardtii, using a hydraulic flume swimming chamber. New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research. 34 (4), 629-636 (2000).
- Faillettaz, R., Durand, E., Paris, C. B., Koubbi, P., Irisson, J. O. Swimming speeds of Mediterranean settlement-stage fish larvae nuance Hjort’s aberrant drift hypothesis. Limnology and Oceanography. 63 (2), 509-523 (2018).
- Takebe, A., et al. Zebrafish respond to the geomagnetic field by bimodal and group-dependent orientation. Scientific Reports. 2, 727 (2012).
- Osipova, E. A., Pavlova, V. V., Nepomnyashchikh, V. A., Krylov, V. V. Influence of magnetic field on zebrafish activity and orientation in a plus maze. Behavioural Processes. 122, 80-86 (2016).
- Cresci, A., De Rosa, R., Putman, N. F., Agnisola, C. Earth-strength magnetic field affects the rheotactic threshold of zebrafish swimming in shoals. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology. 204, 169-176 (2017).
- Tesch, F. W. Influence of geomagnetism and salinity on the directional choice of eels. Helgoländer Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen. 26 (3-4), 382-395 (1974).
- Cresci, A., et al. Zebrafish “personality” influences sensitivity to magnetic fields. Acta Ethologica. , 1-7 (2018).
- Benus, R. F., Bohus, B., Koolhaas, J. M., Van Oortmerssen, G. A. Heritable variation for aggression as a reflection of individual coping strategies. Cellular and Molecular Life Sciences. 47 (10), 1008-1019 (1991).
- Dahlbom, S. J., Backstrom, T., Lundstedt-Enkel, K., Winberg, S. Aggression and monoamines: Effects of sex and social rank in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 228 (2), 333-338 (2012).
- Koolhaas, J. M. Coping style and immunity in animals: Making sense of individual variation. Brain, Behavior, and Immunity. 22 (5), 662-667 (2008).
- Dahlbom, S. J., Lagman, D., Lundstedt-Enkel, K., Sundström, L. F., Winberg, S. Boldness predicts social status in zebrafish (Danio rerio). PLoS ONE. 6 (8), 2-8 (2011).
- Rey, S., Boltana, S., Vargas, R., Roher, N., Mackenzie, S. Combining animal personalities with transcriptomics resolves individual variation within a wild-type zebrafish population and identifies underpinning molecular differences in brain function. Molecular Ecology. 22 (24), 6100-6115 (2013).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A Methodological Review of Personality-related Studies in Fish: Focus on the Shy-Bold Axis of Behavior. International Journal of Comparative Psychology. 23, 1-25 (2010).
- Boujard, T., Leatherland, J. F. Circadian rhythms and feeding time in fishes. Environmental Biology of Fishes. 35 (2), 109-131 (1992).
- Plaut, I. Effects of fin size on swimming performance, swimming behaviour and routine activity of zebrafish Danio rerio. Journal of Experimental Biology. 203 (4), 813-820 (2000).
- Tierney, P., Farmer, S. M. Creative Self-Efficacy Development and Creative Performance Over Time. Journal of Applied Psychology. 96 (2), 277-293 (2011).
- Plaut, I., Gordon, M. S. swimming metabolism of wild-type and cloned zebrafish brachydanio rerio. Journal of Experimental Biology. 194 (1), (1994).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Tudorache, C., Schaaf, M. J. M., Slabbekoorn, H. Covariation between behaviour and physiology indicators of coping style in zebrafish (Danio rerio). Journal of Endocrinology. 219 (3), 251-258 (2013).
- Uliano, E., et al. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 157 (3), 283-290 (2010).
- Palstra, A. P., et al. Establishing zebrafish as a novel exercise model: Swimming economy, swimming-enhanced growth and muscle growth marker gene expression. PLoS ONE. 5 (12), (2010).
- Bak-Coleman, J., Court, A., Paley, D. A., Coombs, S. The spatiotemporal dynamics of rheotactic behavior depends on flow speed and available sensory information. The Journal of Experimental Biology. 216, 4011-4024 (2013).
- Brett, J. R. The Respiratory Metabolism and Swimming Performance of Young Sockeye Salmon. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 21 (5), 1183-1226 (1964).
- Quintella, B. R., Mateus, C. S., Costa, J. L., Domingos, I., Almeida, P. R. Critical swimming speed of yellow- and silver-phase European eel (Anguilla anguilla, L.). Journal of Applied Ichthyology. 26 (3), 432-435 (2010).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews. 83 (1), 13-34 (2008).
- Engeszer, R. E., Patterson, L. B., Rao, A. A., Parichy, D. M. Zebrafish in the Wild: A Review of Natural History and New Notes from the Field. Zebrafish. 4 (1), (2007).
- Gardiner, J. M., Atema, J. Sharks need the lateral line to locate odor sources: rheotaxis and eddy chemotaxis. Journal of Experimental Biology. 210 (11), 1925-1934 (2007).
- Thorpe, J. E., Ross, L. G., Struthers, G., Watts, W. Tracking Atlantic salmon smolts, Salmo salar L., through Loch Voil, Scotland. Journal of Fish Biology. 19 (5), 519-537 (1981).
- Bottesch, M., et al. A magnetic compass that might help coral reef fish larvae return to their natal reef. Current Biology. 26 (24), R1266-R1267 (2016).
- Boles, L. C., Lohmann, K. J. True navigation and magnetic maps in spiny lobsters. Nature. 421 (6918), 60-63 (2003).
- Dingemanse, N. J., Kazem, A. J. N., Réale, D., Wright, J. Behavioural reaction norms: animal personality meets individual plasticity. Trends in Ecology and Evolution. 25 (2), 81-89 (2010).
