Summary
Vi beskriver en adfærdsmæssige protokol udviklet til at vurdere hvordan zebrafisks personligheder påvirke deres svar til vand strømme og svage magnetfelter. Fisk med de samme personligheder er adskilt baseret på deres udforskende adfærd. Derefter, deres rheotactic orientering adfærd i en swimming tunnel med en lav gennemstrømningshastighed og forskellige magnetisk betingelser er overholdt.
Abstract
For at orientere sig i deres miljø, integrere dyr en bred vifte af eksterne stikord, som interagerer med flere interne faktorer, såsom personlighed. Her, beskriver vi en adfærdsmæssige protokol designet til studiet af zebrafisk personlighed indflydelse på deres orientering svar til flere eksterne miljømæssige stikord, specielt vandstrømme og magnetiske felter. Denne protokol har til formål at forstå om proaktiv eller reaktiv zebrafisk vise forskellige tærskler for rheotactic (dvs. flow hastighed hvormed fiskene begynder svømning opstrøms) når det omgivende magnetfelt ændrer sin retning. For at identificere zebrafisk med den samme personlighed, er fisk indført i mørke halvdelen af en tank forbundet med en smal åbning til lyse halvdelen. Kun proaktiv fisk udforske roman, lyse omgivelser. Reaktiv fisk skal ikke afslutte den mørke halvdel af tanken. En swimming tunnel med lav strømningshastigheder bruges til at bestemme den rheotactic grænse. Vi beskriver to opsætninger til at styre det magnetiske felt i tunnelen i rækken af jordens magnetfelt intensitet: en, der styrer det magnetiske felt langs strømningsretning (én dimension) og en, der giver mulighed for en tre-axial kontrol af det magnetiske felt. Fisk er filmet mens du oplever en trinvis forøgelse af flow hastighed i tunnelen under forskellige magnetfelter. Data om orientering adfærd er indsamlet via et video-tracking procedure og påføres en logistisk model at tillade bestemmelse af den rheotactic grænse. Vi rapporterer repræsentative resultater indsamlet fra shoaling zebrafisk. Specifikt, viser disse, at kun reaktivt, forsigtige fisk viser variationer af den rheotactic grænse, når det magnetiske felt varierer i dens retning, mens proaktiv fisk ikke reagerer på magnetfelt ændringer. Denne metode kan anvendes til studiet af magnetiske følsomhed og rheotactic adfærd af mange akvatiske arter, både visning er enkeltstående eller shoaling svømning strategier.
Introduction
I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en lab-baserede adfærdsmæssige protokol, som har omfattet af undersøger rollen af fisk personlighed på orientering reaktion shoaling fisk til eksterne orientering stikord, som vandstrømme og magnetiske felter.
De orientere beslutninger af dyr skyldes vejer forskellige sensoriske oplysninger. Beslutningsprocessen er påvirket af dyrets evne til at navigere (f.eks. evne til at vælge og holde en retning), dets interne tilstand (f.eks. fodring eller reproduktive behov), dens evne til at flytte (fx bevægelse biomekanik), og flere ekstra eksterne faktorer (fx tidspunkt på dagen, interaktion med artsfæller)1.
Rolle i den interne eller dyrs personlighed i orientering opførsel er ofte dårligt forstået eller udforsket ikke2. Yderligere udfordringer opstår i studiet af orientering af sociale akvatiske arter, som ofte udfører koordineret og polariseret gruppe bevægelse adfærd3.
Vandstrømme spille en nøglerolle i orientering processen med fisk. Fisk orientere vand strømme gennem en unconditioned reaktion kaldes rheotaxis4, som kan være positiv (dvs., opstrøms orienterede) eller negativ (dvs. neden orienterede) og bruges til flere aktiviteter, lige fra fouragering til minimering af energiske udgifter5,6. Desuden rapporterer en voksende mængde af litteratur, at mange fiskearter bruger det geomagnetiske felt til orientering og navigering7,8,9.
Undersøgelse af rheotaxis og svømning ydeevne i fisk er normalt udført i flow kamre (målekanal), hvor fisk udsættes for en trinvis forøgelse af flow hastighed, fra lav til høj hastighed, ofte indtil udmattelse (kaldet kritiske hastighed)10, 11. På den anden side undersøgt tidligere studier rollen, det magnetiske felt i orientering gennem observation af svømning opførsel af dyr i arenaer med stillestående vand12,13. Her beskriver vi en laboratorium teknik, der gør det muligt for forskere at studere funktionen af fisk mens manipulere både vandstrømme og det magnetiske felt. Denne metode blev udnyttet for første gang på shoaling zebrafisk (Danio rerio) i vores tidligere undersøgelse, hvilket fører til den konklusion, at manipulation af det omgivende magnetfelt bestemmer den rheotactic tærskel (dvs. den minimale vand hastighed på hvilke shoaling fiske orient opstrøms)14. Denne metode er baseret på brugen af en målekanal kammer med langsom strømme kombineret med en opsætning, der er designet til at styre det magnetiske felt i målekanal, inden for rækkevidde af jordens magnetfelt intensitet.
Svømning tunnelen udnyttet til at observere adfærd af zebrafisk er skitseret i figur 1. Tunnelen (lavet af en nonreflecting akryl cylinder med en diameter på 7 cm og 15 cm i længden) er tilsluttet en opsætning til kontrol af flow sats14. Med denne opsætning varierer strømningshastigheder i tunnelen mellem 0 og 9 cm/s.
For at manipulere det magnetiske felt i tunnelen under svømning, bruger vi to metodiske tilgange: først er en-dimensionelle og andet er tre-dimensionelle. For enhver ansøgning, disse metoder manipulere det geomagnetiske felt for at få særlige magnetiske forhold i en defineret mængde af vand — således alle værdier af magnetfeltet intensitet rapporteret i denne undersøgelse omfatter det geomagnetiske felt.
Hvad angår den endimensionale tilgang15, det magnetiske felt er manipuleret langs vandet flowretning (defineret som x-aksen) ved hjælp af en magnetventil svøbt omkring svømning tunnel. Dette er sluttet til en strømforsyning, og det genererer ensartet statiske magnetiske felter (figur 2A). På samme måde for de tre-dimensionel tilgang, er det geomagnetiske felt i den diskenhed, der indeholder svømning tunnel ændres ved hjælp af spoler af elektriske ledninger. Men for at kontrollere det magnetiske felt i tre dimensioner, bredbånd har designet af tre ortogonale Helmholtz par (figur 2B). Hvert Helmholtz par er sammensat af to cirkulære bredbånd orienteret langs de tre ortogonale plads retninger (x, yog z) og udstyret med en tre-axial magnetometer arbejder i lukket kredsløb betingelser. Magnetometer arbejder med felt intensiteter sammenlignes med jordens naturlige felt, og det ligger tæt på den geometriske centrum af spoler sæt (hvor svømning tunnel er placeret).
Vi gennemføre de teknikker, der er beskrevet ovenfor for at teste hypotesen at personlighedstræk ved komponere en stime fisk indflydelse på den måde, de reagerer på magnetfelter16. Vi tester den hypotese, at personer med proaktive og reaktive personlighed17,18 reagerer forskelligt, når de udsættes for vand strømme og magnetiske felter. For at teste dette, sortere vi først zebrafisk ved hjælp en etablerede metoder til at tildele og gruppe personer, der er proaktive eller reaktive17,19,20,21. Derefter, vi evaluerer den rheotactic opførsel af zebrafisk svømning i stimer består af kun reaktive personer eller sammensat af kun proaktiv enkeltpersoner i magnetiske målekanal tank, som vi fremlægger som eksempeldata.
Sorteringsmetoden er baseret på de proaktive og reaktive individer forskellige tendens til at udforske nye miljøer21. Specifikt, bruger vi en tank, opdelt i en lys og en mørk side17,19,20,21 (figur 3). Dyr er akklimatiseret til den mørke side. Når adgang til den lyse side er åben og proaktiv individer har tendens til at hurtigt afslutter den mørke halvdel af beholderen til at udforske de nye omgivelser, mens de reaktive fisk ikke forlader den mørke tank.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af universitetet i Napoli Federico II, Napoli, Italien (2015).
1. animalsk vedligeholdelse
- Bruge tanke på mindst 200 L til at være vært en stime af mindst 50 personer af begge køn i hver tank.
Bemærk: Tætheden af fisk i tanken må være ét dyr pr. 2 L eller lavere. Under disse betingelser vises zebrafisk normalt shoaling adfærd. - Angive vedligeholdelsesbetingelser som følger: temperatur på 27-28 ° C; ledningsevne på < 500 μS; pH 6,5-7,5; 3 på < 0,25 mg/L; og en lys: mørke lysperiode på 10 h:14 h.
Bemærk: Identiske bedrift betingelser skal bruges til både den blandede befolkning og de adskilte proaktive og reaktive befolkninger.
2. personlighed udvalg i zebrafisk
- Forberede og placere personlighed udvalg tank i et stille rum (figur 3) med det samme vand som anvendt i vedligeholdelse tanke.
- Placere en video kamera over eller ved siden af tanken. Tilslutte kameraet til en computer med en skærm, der er beliggende i et område hvor der er ingen visuel kontakt med tanken.
- Vælg ni fisk tilfældigt fra vedligeholdelse tank og overføre dem til den mørke side af personlighed udvalg tank, ved hjælp af et knotless net.
Bemærk: Prøv at begrænse interaktioner med kampvogne og fisk til den mindste mængde af mulig tid. Undgå støj og hurtige bevægelser. Hvis det er nødvendigt, overføre dyr i en lille mængde transporterer tank (omkring 2 L) med vand fra holdingtank. For at undgå luft eksponering for dyr, bruge et 250 ml baegerglas og forsigtigt fremkalde dyret til at indtaste bægerglasset. Prøv at minimere capture tid, undgå, indsamle flere fisk, da det kan forårsage fysiske skader på dyr og holder ikke fisk i mere end et par sekunder i nettet, da disse faktorer kan øge stress. Fisk skal fodres ad libitum inden overdragelsen til den eksperimentelle tank. Dette begrænser muligheden for, at forskellige tendenser i mad-søger opførsel ville påvirke funktionen af personerne under den følgende eksperiment22. Udføre Repliker eksperimenter på samme tid af dagen. Dette minimerer variabiliteten i adfærd af de eksperimentelle grupper forårsaget af mulige døgnrytmen23. - Efter 1 time af akklimatisering, åbne skydedøren.
Bemærk: Personer, der afslutter fra hullet, at udforske den lyse side af tanken inden for 10 min, anses proaktiv21. - Efter 10 min, forsigtigt fjerne de proaktive personer fra tank og overføre dem til proaktiv vedligeholdelse tank.
- Efter 15 min, indsamle de fisk, der forbliver i den mørke boks, der anses for reaktiv21og overføre dem til den reaktive vedligeholdelse tank.
Bemærk: Kassér fisk, der flytter til den lyse side af tanken efter 10 min21. Udføre personlighedstest med ni fisk ad gangen, indtil det ønskede antal proaktive og reaktive fisk nødvendige for de i punkt 5 beskrevne prøver indsamles. Konsekvens af den proaktive og reaktive personlighed kan kontrolleres regelmæssigt ved hjælp af den samme tilgang.
3. sæt af det magnetiske felt med One-dimensional magnetfelt Manipulation27
- Tænd Power unit (figur 2A).
- Placer den snoede tunnel på den placering, hvor den rheotactic protokol vil være udført (afsnit 5) men holder det afbrudt fra svømning apparater (figur 2A). Placer en magnetisk sonden er forbundet med en Gauss/Teslameter inde i tunnelen og kontrollere, hvilken spænding er nødvendig for at opnå den valgte magnetfelt værdi langs den største akse for tunnelen.
Bemærk: På grund af de magnetiske egenskaber af en magnetventil er feltet rimeligt ensartede inde i tunnelen; Dette kan kontrolleres ved at langsomt flytte sonden både horisontalt og vertikalt. - Afbryde sonden og Tilslut strømmen tunnel til svømning apparater.
- Start med rheotactic-protokollen (afsnit 5).
4. sæt op af det magnetiske felt med tre-dimensionelle magnetfeltet Manipulation27
- Tænd CPU, DAC og spole drivere (figur 2B).
- Angiv den valgte magnetfelt på hver enkelt af de tre akser (x, y og z).
- Sted i tunnelen i midten af Helmholtz par sæt.
- Start med rheotactic-protokollen (afsnit 5).
5. test af zebrafisk Rheotaxis i Flow-kammer
- Overføre et til fem fisk til flow-tunnelen ved hjælp af en 2 L tank med siderne og bunden er skjult.
- Drej på pumpen og strømningshastigheden i tunnelen til 1,7 cm/s.
Bemærk: Denne langsomme vand vil holde vandet i tunnelen iltet og det vil lette dyrs opsving. - Lad dyrenes acclimate til tunnelen under svømning for 1 h.
- Starte videooptagelse af opførsel af fisk i tunnelen.
Bemærk: Vi brugte et kamera (f.eks., Yi 4K handling) med fjernbetjeningen (fx, Bluetooth) og gemmes videoen som .mpg (30 rammer/s). - Start en trinvis forøgelse af strømningshastigheden efter den valgte eksperimentel protokol (1,3 cm/s i denne undersøgelse; Figur 4).
Bemærk: For denne protokol, brugte vi lave strømningshastigheder, der for zebrafisk, spænder fra 0 til 2,8 BL (krop længder) / s. Disse flow hastigheder er i den nedre ende af strømningshastigheder, der inducerer løbende orienteret svømning i zebrafisk (3-15% af kritiske swimming speed [Ucrit])24. Brug af lav strømningshastigheder (følgende Brett protokol25) er knyttet til specifik adfærdsmæssige karakteristika af denne art i tilstedeværelse af vandstrømme. Zebrafisk tendens til at svømme langs den største akse for kammer, dreje ofte, selv i nærværelse af vand flow, og har tendens til at svømme både opstrøms og nedstrøms24,26. Denne adfærd påvirkes af vand trykforøgelsesanlæg sats, forsvinder ved relativt høje hastigheder (> 8 BL/s)26, når dyrene hele tiden svømme vender opstrøms (fuld positive rheotactic svar). Lodrette og tværgående forskydninger er meget sjældne. -
Udføre morfometri af dyr (sex og total længde [TL], gaffel længde [FL] eller BL) på billeder af fisk i en morfometrisk kammer.
- Vælg den passende billede.
- Åbn billedet i ImageJ.
- Tage til efterretning af sex af dyret (mandlige zebrafisk er slank og har tendens til at være gullige, mens hunnerne er mere afrundede og tendens til at have blå og hvide farvestoffer).
- Klik på analyser > Angive skala og sæt omfanget af billedet i centimeter, ved hjælp af den hele vandret længde i tunnellen som reference.
- Klik på analyser > foranstaltning og optage den lineære længde af dyret.
- Beregne sin kropsvægt (BW).
Bemærk: BW beregnes fra sex-FL-BW relationer tidligere bygget i lab eller metadata. Hele proceduren undgår manipulation stress på dyrene.
6. video Tracking
- Åbne videofilen med Tracker 4,84 videoanalyse og modellering værktøj.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, rette alle video forvridning ved hjælp af perspektiv og radial forvrængning filteret. - Klik på koordinatsystemet i den øverste menu og indstille længden enheder til centimeter og tidsenheder til sekunder.
- Klik på filer > Importer > Video og åbne en af videoerne i Tracker 4,84.
- Klik på "Koordinere akserne" og indstille referencesystem til at spore placeringen af fisken over tid, med x's akse langs tunnelen. Placere oprindelse i downstream slutter væg (på vand outlet) lav hjørne.
- Klik på spor > ny > punkt af massen og start sporing én fisk ad gangen. Holde styr på de sidste 5 min af hvert trin, som fiskene brugt på hver strømningshastighed.
- Forhånd video manuelt med fem-frame intervaller (0,5 s) og markere den tid og placering af dyret ved hver upstream-downstream tur (UDt, røde prikker i figur 5) og ved hver downstream-upstream tur (DUt; blå prikker i figur 5).
Bemærk: Bruge fisk øje position som reference for fisks holdning. Spore dyrets position ved hjælp af et punkt masse. Udelukke fra tracking nogen periode af ikke-orienterede svømning (dvs., manøvrering tid). - I slutningen af hver tracking-session, skal du vælge x-værdier og tid værdier fra tabellen på det nederste højre hjørne af vinduet software. Højreklik på dataene, og klik på Kopier data > fuld præcision.
- Spare den tid og x-værdier for alle drejning positioner på en skabelon regnearksfil til at beregne den samlede opstrøms tid (summen af alle mellemrum mellem UDts og Udludningsrester) samt den samlede downstream tid (summen af intervallerne mellem Udludningsrester og UDt) og værdierne rheotactic index i procenter (RI %) for hver strømningshastighed skridt (Se figur 5).
Bemærk: Den rheotactic adfærd er kvantificeret ved andelen af den samlede orienteret tid, som fisken bruger vender opstrøms (svømning eller sjældent frysning [dvs., de holder stadig i bunden af tunnelen]27). Denne andel er defineret som RI % (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som eksempeldata præsenterer vi resultaterne kontrollerende magnetfelt langs vandet flowretning på proaktive og reaktive shoaling zebrafisk16 ved hjælp af setup, vist i figur 2A (jf. punkt 3 i protokollen). Disse resultater viser, hvordan den beskrevne protokol kan fremhæve forskelle i reaktioner på det magnetiske felt i fisk med forskellige personligheder. Det overordnede koncept af disse forsøg er baseret på den konstatering, at retningen af det magnetiske felt i forhold til vandmængden påvirker den rheotactic tærskel i shoaling zebrafisk14. Således, som ændringer i magnetfeltet modulere rheotaxis, denne protokol kan bruges til at vurdere, om svar på zebrafisk magnetiske felter varierer afhængigt af deres proaktive eller reaktive personlighed28.
I første omgang, bruge den mørke/lys tank, som vist i figur 3, zebrafisk var delt ind i forskellige grupper efter deres proaktive/reaktiv personlighed. Efter sådan en test, stimer af fem fisk med den samme personlighed blev derefter testet i magnetventil svømning tunnel (figur 1 og figur 2A). Ialt 20 fisk blev testet: to stimer består af fem reaktive fisk hver (10 reaktive fisk) og to stimer består af fem proaktiv fisk hver (10 proaktiv fisk).
En stime på et tidspunkt var video optaget mens svømning i tunnelen og vand nuværende blev fremskyndet med en trinvis forøgelse af strømningshastigheden som vist skematisk i figur 4. Fiskene fik lov til at acclimate til 1 h i tunnelen. Efter dette anvendte vi protokol til kvantificering af rheotactic adfærd, ved hjælp af en trinvis stigning af strømningshastigheden ifølge den klassiske Brett protokol25. Specifikt, steget strømningshastigheden med 0,4 BL/s hver 10 min i alt syv på hinanden følgende trin (figur 4). Funktionsmåden for zebrafisk blev indspillet i hele hele varigheden af køre i tunnel (70 min), og værdien RI på hvert trin blev beregnet (se protokollen trin 6.8).
Under kører i tunnellen, svømning, det magnetiske felt blev sat på en af følgende to betingelser: 50 μT nedstrøms (dvs. den horisontale komponent [langs x-aksen] af det magnetiske felt havde den samme retning af vandflow) og 50 μT opstrøms (dvs. den horisontale komponent af det magnetiske felt havde en modsatte retning med hensyn til vandstrømmen)16. Intensitet langs akserne y og z blev ikke ramt, samt de samlede intensitet og hældning af magnetfeltet vektor. Hver stime af fem fisk blev udsat for kun én af de to magnetiske betingelser. For eksempel, overvejer proaktiv fisk, en proaktiv stime havde det magnetiske felt instrueret nedstrøms og andre proaktiv stimen havde det magnetiske felt instrueret opstrøms.
Videoerne blev derefter analyseret med video-tracking software (afsnit 6 i protokollen). Fisken var video optaget for hele varigheden af køre i tunnelen under svømning. Dog blev kun de sidste 5 min af hver 10 min lange trinvis forøgelse af flow (figur 4) sporet. I løbet af den registrerede tid, drejninger af hver fisk på hver strømningshastighed blev fremhævet (figur 5, røde og blå datapunkter). Disse blev derefter brugt som henvisninger til at beregne RI af hver fisk og hver flow hastighed (figur 5). RI indeks svinger mellem 0% og 100%. Når under 50%, viser RI indekset, at fiskene vises negative rheotaxis (prævalens af downstream svømning); Når RI er højere end 50%, viser det, at dyret havde et positivt rheotactic svar (prævalens af upstream svømning). En RI ikke signifikant forskellig fra 50% ville indikere en manglende rheotactic svar. Gennemsnitsværdien af RI % af alle fem fiskene i en stime blev derefter på hver strømningshastighed. Disse gennemsnit data blev arcus sinus omdannes og bruges til at passe kurver vises i figur 6A. Således, den rheotactic indeks øger sigmoidally når vandet hastighed stiger, giver mulighed for kvantificering af rheotaxis med en simpel matematisk metode. Forholdet mellem RI og flowet kan monteres på følgende logistik-sigmoide model.
Tre parametre og deres variation kan udledes af fit kurven. RIplateau måler dyrene maksimal tendens til at orientere opstrøms i rækken af strømningshastigheder anvendes i forsøget. RIbunden er RI værdi i mangel af vandflow og hypotetisk, bør ikke adskiller sig fra 50%. Rtr er den er strømningshastigheden som den maksimale hældningen af kurven opstår, og det kan bruges som en målestok for rheotactic tærskel6.
Resultaterne tyder på, at rheotactic tærskel (Rtr) af zebrafisk er meget lav, i rækken af et par centimeter i sekundet. Variationer af det magnetiske felt påvirker ikke Rtr proaktiv fisk (ingen effekt af det magnetiske felt, t-test, P > 0,05). Oppositely, magnetfelt ændringer har en udtalt effekt på den rheotactic opførsel af reaktive zebrafisk. Når komponenten magnetfelt langs svømning tunnelen blev instrueret nedstrøms, er Rtr meget lav og svarer til proaktiv fisk. Tærsklen var signifikant højere når magnetfeltet blev instrueret opstrøms (t-test, P < 0,01).
RIplateau værdien af reaktive dyr var væsentligt lavere, når magnetfeltet blev instrueret opstrøms (t-test, P < 0,01). Dette resultat angiver, at med disse betingelser, reaktiv fisk ville nå den fulde positive rheotactic svar (RI = 100%) kun ved meget høje strømningshastigheder. Således, dette resultat fremhæver, i forhold til Rtr, RIplateau giver færre oplysninger om svømning opførsel af fisk. Faktisk, kan baseret på stærk forskellen på reaktiv RIplateau mellem de to magnetiske betingelser, vi konstatere, at de reaktive dyr under magnetfelt upstream-orienterede sandsynligvis vises en fuld rheotactic svar på en højere vand flow.
RI bundværdier tendens til at være højere (selvom ikke signifikant) end 50% i dyrenes proaktive og reaktive dyrene udsættes for en downstream-orienterede magnetfelt. Dette kan indikere en bias i protokollen, da dyrene kendetegnet ved en meget lav tærskel kan huske den erfarne under acclimation strømningsretning. En ordentlig protokollen kunne være udtænkt for at teste denne mulighed.
Figur 1: Forenklet repræsentation af svømning tunnel apparater udnyttes i den nuværende undersøgelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Opsætning for magnetfelt kontrol. (A) gengivelse af svømning tunnelen med en magnetventil til induktion af en statisk, vandrette magnetfelt i tunnelen. Magnetventil (0,83 sving/cm) er sluttet til en strømforsyning, og det skaber et felt i rækken af ±250 µT (intensitet interval, der omfatter jordens magnetfelt range). På højre side vises et billede af magnetventil tunnelen tilsluttet apparatet svømning. Tunnelen er lavet af akryl og det har to perforeret akryl plader placeres på indsugningen, som garanterer flow for at være tæt på laminar. (B) Diagram og foto af de tre ortogonale Helmholtz par sæt til kontrol af det magnetiske felt i det geomagnetiske række intensiteter. Magnetfelt sonden, CPU, digital-til-analog-konverter og coil drivere plejede slutning sløjfen er også vist. Hvert par af bredbånd er sammensat af to cirkulære spoler med en radius (r) på 30 cm og N = 50 omgange af AWG-14 kobbertråde. En tre-akser magnetometer (sensor) med valgbar skala (± 88 µT til ± 810 µT) er placeret tæt på centrum af spolen sæt. Rækken sensor er indstillet til værdier lige til ±130 µT. Disse værdier blev også anvendt ved målingerne beskrevet i de repræsentative resultater (i disse betingelser, den nominelle sensor opløsning er ca 0,1 µT). Intensiteten og retningen af det magnetiske felt styres med en digital feedback-system. Sensoren måler de tre komponenter i magnetfelt vektor (de tre akser), og de tilsvarende fejl signaler udtrækkes. Derefter er korrektion signaler genereret af en simpel integrator filter. Digital korrektion signaler er konverteret til spændingen ved en digital til analog konverter og forstærket af en egnet coil driver. Disse sidste signaler bruges til at drive Helmholtz par. Samplingfrekvensen er fastsat til 5 Hz og unity gain hyppigheden af sløjfer er omkring 0.16 Hz. Når strømninger parvis Helmholtz af bredbånd er sat, det samlede magnetiske felt varierer mindre end 2% fra dens gennemsnitlige intensitet værdi i den centrale kubiske volumen (med kant [L] = 10 cm) af bredbånd. Under målingerne er magnetfelt rms mindre end 0,2 µT. I begge opsætninger (paneler A og B) er en statisk elektrisk felt genereret af aktuelt oprullet producerer magnetiske felt16. Intensiteten af det elektriske felt er omkring 0,4 V/m, når den maksimale strøm anvendes; Denne værdi er ubetydelig sammenlignet med naturlige eller kunstige statiske felter i miljøet hvis intensitet er ca. 1 kV/m17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skematisk gengivelse af tanken (40 cm x 40 cm x 40 cm) bruges til at adskille proaktiv fra reaktiv zebrafisk enkeltpersoner (ikke i skala), ifølge Rey et al.21. Mængden af personlighed udvalg tank er 50 L. halvdel af tanken var besat af en mørk kasse med et hul 5 cm i diameter på den side af boksen står over for den lyse halvdel af tanken. Hullet var dækket af en skydedør (ikke vist), hvis åbning underskrevet start vælge rettergang. Den mørke side af tanken behov et aftageligt betræk hen til indrømme adgang af hånd redskaber. Dette muliggør markedsføring eller fange fisk, før og efter de adfærdsmæssige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Diagram af strømningshastigheder anvendes under prøverne til at bestemme den rheotactic grænse af zebrafisk. Flow i 1 h acclimation periode var nok til at garantere en tilstrækkelig ilttilførsel til dyrene. Det kan antages, at med dette design, ilttilførslen er aldrig en grænse, selv i de første 10 min skridt med flow 0. Faktisk, med et iltindhold i vand ved 27 ° C i ca 7,9 mg/L og en dyr iltforbrug af 1 mg/h.g (en overskydende tilnærmelse til zebrafisk iltforbrug under rutinebetingelser [Uliano et al.29] og på lav hastighed svømning [Palstra et al.30]), det er muligt at beregne, at Po-2 i målekanal i mangel af flow, ikke vil falde mere end 2% pr. dyr, resterende godt over den kritiske Po2 (ca. 40 torr for zebrafisk). Dette tal er blevet ændret fra Cresci et al.14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Dyrs adfærd i tunnelen og beregningen af RI. Grafer præsentere placeringen af et bestemt dyr langs x-aksen i en 300 s post på tre værdier af strømningshastigheden. De røde prikker repræsenterer downstream til upstream svingene, blå prikker opstrøms til nedstrøms sving. Den tilsvarende tid mellemrum brugt af dyr nedstrøms eller opstrøms er også rapporteret, og de samlede opstrøms og nedstrøms gange rapporteres fra som en RI værdi kan beregnes. Det kan observeres, når stigende strømningshastighed, opstrøms tiden og RI værdier stige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative resultater. (A) forholdet mellem arcus sinus-omdannet RI værdier (RI er procentdelen af den samlede orienteret tid, fisk vender opstrøms) og strømningshastigheden for proaktive og reaktive shoaling zebrafisk under to magnetfelt forhold langs strømmen sats retning (en-dimension kontrol). Hvert datapunkt er gennemsnittet af RI værdierne af de fem fisk komponere stime på hver strømningshastighed. Væsentlige forskelle mellem kurver blev testet via en summen af kvadrater F-test (alpha = 0,05)14. (B) magnetfelt akser og retning af vand flow i tunnelen. En tre-dimensionelle repræsentation af de magnetiske vektorer i to magnetfelt betingelser anvendes i denne undersøgelse er også vist. Det magnetiske felt i lab (40 ° N, 14 ° E) var: F = 62 μT; Jeg = 64°; D = 44°. Dette tal er blevet ændret fra Cresci et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse giver forskerne til at kvantificere komplekse orientering svar af akvatiske arter som følge af integrationen mellem to eksterne stikord (vand aktuelle og geomagnetiske felt) og en indre faktor af dyret, som personlighed. Det overordnede koncept er at skabe en eksperimentelle design, der gør det muligt for forskerne at adskille individer af forskellige personlighed og undersøge deres orientering adfærd mens kontrollerende separat eller samtidig de eksterne miljømæssige stikord.
Den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse, sammen med den matematiske definition af det rheotactic index (RI), var designet efter indledende observationer af adfærd af zebrafisk i svømning-tunnellen. Når det placeres i en tunnel, disse dyr viser to typer af adfærdsmæssige mønstre, både i fravær eller tilstedeværelse af vand flow: orienterede svømning og manøvrering. De tilbringer størstedelen af den orienteret tid (normalt, fisken var video optaget for mere end 95% af tiden) svømning langs tunnelen (dvs. orienteret langs den lange akse med en lavere end en 45° vinkel), frem og tilbage, dreje i nærhed af gavlene og ofte sh på grund af thigmotaxis (dvs. svømning tæt på vægge af tunnelen)27.
Denne protokol skal lykkes, er det vigtigt, at den, der udfører forsøget betaler opmærksomhed til stress for dyrene. Transport af fisk mellem de eksperimentelle opsætninger skal udføres med omhu. Brugen af hånd net bør være så hurtigt som muligt, og nogle uddannelse før den faktiske eksperiment er stærkt anbefales som zebrafisk er hurtige svømmere og svært at fange i en tank. Stress kan drastisk påvirke funktionen af disse dyr, og i tilfælde af zebrafisk, kan det væsentligt ændre deres svømning adfærd27. Dette vil sandsynligvis påvirke resultaterne, som fisk kan vise hyperaktiv adfærd og være mindre følsomme over for vand strømme og magnetfelt ændringer. Kontakt med dyr i opsætningen af eksperimenterende bør være så hurtig og kort som muligt. Den adfærdsmæssige analyse kræver ekstern observation, som også kræver praksis. Derudover er det vigtigt at analysere videoerne blindt (dvs. uden at vide, protokoller og behandlinger).
Den rheotactic adfærd af mange arter af fisk er blevet undersøgt ved hjælp af svømning tunneler5,10,11,31. Mange tidligere undersøgelser fokuseret på vurdering af svømning hastighed at fisk kan opretholde indtil udmattelse, der defineres som Ucrit, for det meste for at teste fysiologiske og økologiske hypoteser11,32, 33. metoden i denne undersøgelse fokuserer i stedet på rheotactic adfærd ved lavt flow hastigheder. Dette valg blev foretaget fordi formålet med denne undersøgelse er at vurdere følsomhed over for en subtil og svage cue som magnetfelt gennem observation af en velkendt og robust orientering opførsel af fisk, den positive rheotaxis. I de repræsentative resultater rapporteret her, vises zebrafisk en meget lav rheotactic tærskel (kun et par centimeter pr. sekund). Denne bemærkning kan være økologisk relevant for denne art, som lever miljøer hvor hastigheden af vandstrømme kan afvige mærkbart. Zebrafisk lever både i turbulente floder34 og i vandløb hvor vandet bevæger sig langsomt, som paddies, damme og flodsletter35. Når vand bevæger sig langsomt, kunne evnen til at opdage og orientere ved lavt flow hastigheder (en lav rheotactic tærskel) muligvis være fordelagtigt, da den rheotactic reaktion øger chancerne for at opfange downstream-drivende bytte36 og giver retningsbestemt stimuli for migration37.
Disse observationer kan ikke gøres ved hjælp af strømme med høje priser. Disse ville fremkalde en stærk bevægelsesadfærd reaktion, der vil afhænge mere på kroppen betingelser og høj svømning opførelser af dyr i stedet for eksterne stikord som det magnetiske felt. Protokollen præsenteres her blev anvendt på zebrafisk, men det er sandsynligt, egnet til nogen ferskvand eller marine arter, som bebor miljøer med bevægelige vand og kan håndteres i laboratorieforhold.
Men denne protokol præsenterer nogle begrænsninger. Mens det højdepunkter tydeligt om en art er følsomme eller nonsensitive for magnetiske felter, kan det afsløre orientering mekanismer gennem hvilke dyret bruger magnetiske felter til bevægelsen beslutningerne. For at undersøge de magnetiske orientering mekanismer i akvatiske arter, er opsætninger med cirkulær arenaer og stillestående vand7,38,39 eller labyrinter13 almindeligt anvendt. Dog fisk (og akvatiske dyr i almindelighed) ikke bor i miljøer, hvor strøm er fraværende, og den præsenterede metode er et første forsøg på at undersøge den integrative adfærdsmæssige reaktion på allestedsnærværende retningsbestemt stikord, som vandet løber og magnetiske felter. En anden begrænsning af denne protokol er den manuelle video-tracking procedure. Integrere dette setup med en automatisk sporingssoftware vil forbedre timingen af hele data analyse proces.
Forsøgsplan præsenteres her er den første, designet til at undersøge indflydelsen af dyrs personlighed på magnetisk følsomhed og rheotaxis. Dette emne er blevet overset i litteraturen og skal undersøges yderligere. Individer fra samme art, eller selv inden for en population eller lille gruppe (f.eks. en fisk stime), er karakteriseret ved forskellige personlighed træk22,40, som kan være en vigtig faktor i undersøgelser af vandrende, sonderende, navigation og orientering adfærd. Ikke alle individer integrere de miljømæssige stikord på samme måde. Således kunne tages hensyn indre faktorer, såsom personlighed, bidrage til at reducere den data variabilitet, som er almindeligt observeret i undersøgelser på bevægelse økologi16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af den grundlæggende forskning grundlæggelsen af departementet fysik og biologi Department of Napoli University Federico II. Forfatterne takke Dr. Claudia Angelini (Institut for anvendt kalkyle, Consiglio Nazionale delle Ricerche [CNR], Italien) for den statistiske støtte. Forfatterne takke Martina Scanu og Silvia Frassinet deres teknisk hjælp til indsamling af data og de departementale teknikere F. Cassese, G. Passeggio og R. Rocco for deres dygtige bistand til design og realisering af opsætningen af eksperimenterende. Vi takke Laura Gentile for at hjælpe gennemføre forsøget under video optagelse. Vi takke Diana Rose Udel fra University of Miami for skydning interview erklæringer af Alessandro Cresci.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9500 G meter | FWBell | N/A | Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT |
| AD5755-1 | Analog Devices | EVAL-AD5755SDZ | Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter |
| ALR3003D | ELC | 3760244880031 | DC Double Regulated power supply |
| BeagleBone Black | Beagleboard.org | N/A | Single Board Computer |
| Coil driver | Home made | N/A | Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI) |
| Helmholtz pairs | Home made | N/A | Coils made with standard AWG-14 wire |
| HMC588L | Honeywell | 900405 Rev E | Digital three-axis magnetometer |
| MO99-2506 | FWBell | 129966 | Single axis magnetic probe |
| Swimming apparatus | M2M Engineering Custom Scientific Equipment | N/A | Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback |
| TECO 278 | TECO | N/A | Thermo-cryostat |
References
- Nathan, R., et al. A movement ecology paradigm for unifying organismal movement research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19052-19059 (2008).
- Holyoak, M., Casagrandi, R., Nathan, R., Revilla, E., Spiegel, O. Trends and missing parts in the study of movement ecology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19060-19065 (2008).
- Miller, N., Gerlai, R. From Schooling to Shoaling: Patterns of Collective Motion in Zebrafish (Danio rerio). PLoS ONE. 7 (11), 8-13 (2012).
- Chapman, J. W., et al. Animal orientation strategies for movement in flows. Current Biology. 21 (20), R861-R870 (2011).
- Montgomery, J. C., Baker, C. F., Carton, A. G. The lateral line can mediate rheotaxis in fish. Nature. 389 (6654), 960-963 (1997).
- Baker, C. F., Montgomery, J. C. The sensory basis of rheotaxis in the blind Mexican cave fish, Astyanax fasciatus. Journal of Comparative Physiology A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 184 (5), 519-527 (1999).
- Putman, N. F., et al. An Inherited Magnetic Map Guides Ocean Navigation in Juvenile Pacific Salmon. Current Biology. 24 (4), 446-450 (2014).
- Cresci, A., et al. Glass eels (Anguilla anguilla) have a magnetic compass linked to the tidal cycle. Science Advances. 3 (6), 1-9 (2017).
- Newton, K. C., Kajiura, S. M. Magnetic field discrimination, learning, and memory in the yellow stingray (Urobatis jamaicensis). Animal Cognition. 20 (4), 603-614 (2017).
- Langdon, S. A., Collins, A. L. Quantification of the maximal swimming performance of Australasian glass eels, Anguilla australis and Anguilla reinhardtii, using a hydraulic flume swimming chamber. New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research. 34 (4), 629-636 (2000).
- Faillettaz, R., Durand, E., Paris, C. B., Koubbi, P., Irisson, J. O. Swimming speeds of Mediterranean settlement-stage fish larvae nuance Hjort’s aberrant drift hypothesis. Limnology and Oceanography. 63 (2), 509-523 (2018).
- Takebe, A., et al. Zebrafish respond to the geomagnetic field by bimodal and group-dependent orientation. Scientific Reports. 2, 727 (2012).
- Osipova, E. A., Pavlova, V. V., Nepomnyashchikh, V. A., Krylov, V. V. Influence of magnetic field on zebrafish activity and orientation in a plus maze. Behavioural Processes. 122, 80-86 (2016).
- Cresci, A., De Rosa, R., Putman, N. F., Agnisola, C. Earth-strength magnetic field affects the rheotactic threshold of zebrafish swimming in shoals. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology. 204, 169-176 (2017).
- Tesch, F. W. Influence of geomagnetism and salinity on the directional choice of eels. Helgoländer Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen. 26 (3-4), 382-395 (1974).
- Cresci, A., et al. Zebrafish “personality” influences sensitivity to magnetic fields. Acta Ethologica. , 1-7 (2018).
- Benus, R. F., Bohus, B., Koolhaas, J. M., Van Oortmerssen, G. A. Heritable variation for aggression as a reflection of individual coping strategies. Cellular and Molecular Life Sciences. 47 (10), 1008-1019 (1991).
- Dahlbom, S. J., Backstrom, T., Lundstedt-Enkel, K., Winberg, S. Aggression and monoamines: Effects of sex and social rank in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 228 (2), 333-338 (2012).
- Koolhaas, J. M. Coping style and immunity in animals: Making sense of individual variation. Brain, Behavior, and Immunity. 22 (5), 662-667 (2008).
- Dahlbom, S. J., Lagman, D., Lundstedt-Enkel, K., Sundström, L. F., Winberg, S. Boldness predicts social status in zebrafish (Danio rerio). PLoS ONE. 6 (8), 2-8 (2011).
- Rey, S., Boltana, S., Vargas, R., Roher, N., Mackenzie, S. Combining animal personalities with transcriptomics resolves individual variation within a wild-type zebrafish population and identifies underpinning molecular differences in brain function. Molecular Ecology. 22 (24), 6100-6115 (2013).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A Methodological Review of Personality-related Studies in Fish: Focus on the Shy-Bold Axis of Behavior. International Journal of Comparative Psychology. 23, 1-25 (2010).
- Boujard, T., Leatherland, J. F. Circadian rhythms and feeding time in fishes. Environmental Biology of Fishes. 35 (2), 109-131 (1992).
- Plaut, I. Effects of fin size on swimming performance, swimming behaviour and routine activity of zebrafish Danio rerio. Journal of Experimental Biology. 203 (4), 813-820 (2000).
- Tierney, P., Farmer, S. M. Creative Self-Efficacy Development and Creative Performance Over Time. Journal of Applied Psychology. 96 (2), 277-293 (2011).
- Plaut, I., Gordon, M. S. swimming metabolism of wild-type and cloned zebrafish brachydanio rerio. Journal of Experimental Biology. 194 (1), (1994).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Tudorache, C., Schaaf, M. J. M., Slabbekoorn, H. Covariation between behaviour and physiology indicators of coping style in zebrafish (Danio rerio). Journal of Endocrinology. 219 (3), 251-258 (2013).
- Uliano, E., et al. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 157 (3), 283-290 (2010).
- Palstra, A. P., et al. Establishing zebrafish as a novel exercise model: Swimming economy, swimming-enhanced growth and muscle growth marker gene expression. PLoS ONE. 5 (12), (2010).
- Bak-Coleman, J., Court, A., Paley, D. A., Coombs, S. The spatiotemporal dynamics of rheotactic behavior depends on flow speed and available sensory information. The Journal of Experimental Biology. 216, 4011-4024 (2013).
- Brett, J. R. The Respiratory Metabolism and Swimming Performance of Young Sockeye Salmon. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 21 (5), 1183-1226 (1964).
- Quintella, B. R., Mateus, C. S., Costa, J. L., Domingos, I., Almeida, P. R. Critical swimming speed of yellow- and silver-phase European eel (Anguilla anguilla, L.). Journal of Applied Ichthyology. 26 (3), 432-435 (2010).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews. 83 (1), 13-34 (2008).
- Engeszer, R. E., Patterson, L. B., Rao, A. A., Parichy, D. M. Zebrafish in the Wild: A Review of Natural History and New Notes from the Field. Zebrafish. 4 (1), (2007).
- Gardiner, J. M., Atema, J. Sharks need the lateral line to locate odor sources: rheotaxis and eddy chemotaxis. Journal of Experimental Biology. 210 (11), 1925-1934 (2007).
- Thorpe, J. E., Ross, L. G., Struthers, G., Watts, W. Tracking Atlantic salmon smolts, Salmo salar L., through Loch Voil, Scotland. Journal of Fish Biology. 19 (5), 519-537 (1981).
- Bottesch, M., et al. A magnetic compass that might help coral reef fish larvae return to their natal reef. Current Biology. 26 (24), R1266-R1267 (2016).
- Boles, L. C., Lohmann, K. J. True navigation and magnetic maps in spiny lobsters. Nature. 421 (6918), 60-63 (2003).
- Dingemanse, N. J., Kazem, A. J. N., Réale, D., Wright, J. Behavioural reaction norms: animal personality meets individual plasticity. Trends in Ecology and Evolution. 25 (2), 81-89 (2010).
