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JoVE Journal Behavior
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Behavior

Bewerten den Einfluss der Persönlichkeit auf Empfindlichkeit gegenüber Magnetfeldern im Zebrafisch

Published: March 18, 2019 doi: 10.3791/59229
Automatic Translation
1, 2,3, 4
1Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Science, Department of Ocean Sciences, University of Miami, 2Department of Physics, Monte S. Angelo (MSA) Campus, University of Naples Federico II, 3Istituto Nazionale di Fisica Nucleare (INFN), 4Department of Biology, MSA Campus, University of Naples Federico II

Summary

Wir beschreiben ein behavioral Protokoll entwickelt, um zu beurteilen wie der Zebrafisch Persönlichkeiten ihre Reaktion auf Wasser Ströme und schwache Magnetfelder beeinflussen. Fische mit den gleichen Persönlichkeiten werden basierend auf ihren explorativen Verhalten getrennt. Dann wird ihre rheotactic Orientierungsverhalten in einem Swimming-Tunnel mit einer low-Flow-Rate und unterschiedlichen magnetischen Bedingungen beobachtet.

Abstract

Um sich in ihrer Umwelt zu orientieren, Tiere eine Vielzahl von externen Cues, die Interaktion mit mehreren internen Faktoren wie Persönlichkeit zu integrieren. Hier beschreiben wir eine Verhaltens Protokoll für die Untersuchung des Einflusses der Zebrafisch Persönlichkeit auf ihre Ausrichtung als Reaktion auf mehrere externe ökologische Hinweise, insbesondere Wasserströme und Magnetfelder. Dieses Protokoll soll zu verstehen, ob aktiv oder reaktiv Zebrafisch anzeigen verschiedene rheotactic Schwellenwerte (d. h. die Fließgeschwindigkeit, bei dem die Fische beginnen stromaufwärts) als das umgebende Magnetfeld ändert seine Richtung. Um Zebrafisch mit der gleichen Persönlichkeit zu identifizieren, sind Fische im Dunkeln eingesetzt die Hälfte eines Panzers mit einer schmalen Öffnung zu einem hellen Hälfte verbunden. Nur aktive Fische erkunden, Roman, helle Umgebung. Reaktive Fisch beenden nicht die dunkle Hälfte des Tanks. Ein Schwimmen-Tunnel mit geringen Durchflussmengen dient zur Bestimmung der rheotactic Schwellenwerts. Wir beschreiben zwei Setups um das magnetische Feld im Tunnel, im Bereich der Erde magnetische Feldstärke zu steuern: eine, die steuert das Magnetfeld entlang der Fließrichtung (eindimensional) und eine drei-axial Kontrolle des magnetischen Feldes ermöglicht. Fische werden gefilmt, und erleben Sie eine schrittweise Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit im Tunnel unter verschiedenen Magnetfelder. Daten über das Orientierungsverhalten sind durch eine Video-Tracking-Verfahren gesammelt und für ein logistisches Modell erlauben die Bestimmung der rheotactic Schwelle. Wir berichten über repräsentative Ergebnisse aus shoaling Zebrafisch gesammelt. Insbesondere zeigen diese, dass nur reaktiv, vorsichtige Fische Variationen der rheotactic Schwelle, zeigen wenn das magnetische Feld in seine Richtung variiert, während proaktive Fisch nicht zu Magnetfeld-Veränderungen zu reagieren. Diese Methode kann auf die Untersuchung der magnetischen Empfindlichkeit und rheotactic Verhalten von vielen aquatischen Arten, sowohl einzeln anzeigen oder shoaling schwimmen Strategien angewendet werden.

Introduction

In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Labor-basiertes Verhaltens Protokoll hat den Umfang der Untersuchung der Rolle von Fisch Persönlichkeit zur Reaktion Orientierung der shoaling Fische, externe Orientierung Hinweise, wie Wasserströme und Magnetfelder.

Die orientierenden Entscheidungen der Tiere ergeben sich aus mit einem Gewicht von verschiedenen sensorischen Informationen. Der Entscheidungsprozess ist beeinflusst durch die Möglichkeit des Tieres zu navigieren (z. B. die Fähigkeit, wählen und halten eine Richtung), seinen internen Status (z. B. Fütterung oder reproduktiven Bedürfnisse), seine Fähigkeit zu bewegen (z. B. Fortbewegung Biomechanik), und einige zusätzliche externe Faktoren (z. B. Uhrzeit, Interaktion mit Artgenossen)1.

Die Rolle des internen Zustand oder tierischen Persönlichkeit in das Orientierungsverhalten oft unverstanden oder2nicht erforscht. In der Studie von der Orientierung des sozialen aquatische Arten, die oft ausführen koordiniert und polarisiert Gruppe Bewegung Verhalten3ergeben sich zusätzliche Herausforderungen.

Wasserströmungen spielen eine Schlüsselrolle bei der Ausrichtung der Fische. Fisch Wasser Ströme durch eine Unconditioned Antwort genannt Rheotaxis4, deren Wert positiv sein können (d.h., stromaufwärts orientiert) oder negativ (d. h. flussabwärts orientiert) orientieren und wird verwendet für verschiedene Aktivitäten, angefangen bei Nahrungssuche auf die Minimierung der energetische Ausgaben5,6. Darüber hinaus berichtet eine wachsende Zahl von Literatur, dass viele Fischarten für Orientierung und Navigation7,8,9das geomagnetische Feld verwenden.

Die Untersuchung über die Rheotaxis und schwimmen die Fische erfolgt in der Regel in Fluss Kammern (Wildwasserbahn), wo Fische die schrittweise Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit von niedrigen bis hohen Geschwindigkeiten oft bis zu Erschöpfung (so genannte kritische Drehzahl)10ausgesetzt sind, 11. Auf der anderen Seite, untersuchten frühere Studien die Rolle des magnetischen Feldes in der Orientierung durch die Beobachtung des Verhaltens Schwimmen der Tiere in den Arenen mit stillem Wasser12,13. Hier beschreiben wir eine Labortechnik, die Forscher zur Untersuchung des Verhaltens von Fischen während der Manipulation die Wasserströmungen und das magnetische Feld können. Diese Methode wurde zum ersten Mal auf shoaling Zebrafisch (Danio Rerio) genutzt, in unserer vorherigen Studie, was zu dem Schluss, dem die Manipulation des umgebenden Magnetfeldes bestimmt, die rheotactic Schwelle (d. h. minimal Geschwindigkeit durch das Wasser an die shoaling Fische stromaufwärts Orient)14. Diese Methode basiert auf der Verwendung einer Wildwasserbahn Kammer mit langsamen Bewegungen kombiniert mit einer Einrichtung zur Kontrolle der des Magnetfeldes in der Klamm, im Bereich der Erde magnetische Feldstärke.

Der Swimming-Tunnel genutzt, um das Verhalten der Zebrafisch zu beobachten ist in Abbildung 1dargestellt. Der Tunnel (gemacht von einem Nonreflecting Acryl Zylinder mit einem Durchmesser von 7 cm und 15 cm lang) ist eine Einrichtung für die Kontrolle der Flow Rate14verbunden. Mit diesem Setup variiert das Spektrum der Durchflussmengen im Tunnel zwischen 0 und 9 cm/s.

Wenn das Magnetfeld im Schwimmen Tunnel bearbeiten möchten, verwenden wir zwei methodische Ansätze: die erste ist eindimensional und die zweite ist dreidimensional. Für jede Anwendung dieser Methoden zu manipulieren das geomagnetische Feld, um bestimmten magnetischen Bedingungen in einem definierten Volumen des Wassers zu erhalten – also alle Werte der magnetischen Feldstärke in dieser Studie berichtet das geomagnetische Feld enthalten.

Bezüglich der eindimensionalen Ansatz15, das magnetische Feld wird manipuliert, entlang der Fließrichtung Wasser (definiert als die x-Achse) über ein Magnetventil eingewickelt um den Swimming-Tunnel. Dies an ein Netzteil angeschlossen ist, und es erzeugt gleichmäßige statische Magnetfelder (Abbildung 2A). In ähnlicher Weise bei der dreidimensionalen Ansatz ist das geomagnetische Feld in das Volume mit dem Swimming-Tunnel mit Spulen von elektrischen Leitungen geändert. Allerdings haben die Spulen um das magnetische Feld in drei Dimensionen zu kontrollieren, das Design der drei orthogonalen Helmholtz-Paare (Abb. 2 b). Jedes Helmholtz-paar besteht aus zwei kreisförmigen Windungen entlang den drei orthogonalen Raumrichtungen (X, yund Z) und ausgestattet mit einem drei-axial Magnetometer unter geschlossenen Bedingungen arbeiten. Das Magnetometer arbeitet mit Feld Intensitäten vergleichbar mit natürlichen Feld der Erde, und es liegt in der Nähe der geometrischen Mitte des eingestellten Spulen (wo sich der Schwimmen Tunnel befindet).

Wir implementieren die Hypothese, dass die Persönlichkeitsmerkmale der Komposition ein Schwarm Fische beeinflussen die Art und Weise, die Sie auf Magnetfelder16 reagieren,die oben beschriebenen Techniken. Wir testen die Hypothese, dass Personen mit proaktiven und reaktiven Persönlichkeit17,18 unterschiedlich reagieren, wenn Wasser fließt und Magnetfeldern ausgesetzt. Um dies zu testen, sortieren wir zuerst Zebrafisch mit einer etablierten Methode zuweisen und Gruppe Einzelpersonen, die proaktive und reaktive17,19,20,21. Dann bewerten wir das rheotactic Verhalten der Zebrafisch schwimmen in Schwärmen bestehend aus nur reaktiv Einzelpersonen oder bestehend aus nur proaktive Individuen in den magnetischen Flume-Tank, die wir als Sample-Daten darstellen.

Die Sortiermethode basiert auf die verschiedenen Tendenz der proaktiven und reaktiven Individuen, neue Umgebungen21zu erkunden. Insbesondere nutzen wir einen Panzer in eine helle und eine dunkle Seite17,19,20,21 (Abbildung 3) unterteilt. Tiere sind auf die dunkle Seite gewöhnt. Beim Zugriff auf die helle Seite offen, proaktive ist tendenziell Menschen schnell beenden die dunkle Hälfte des Tanks, um die neue Umgebung zu erkunden, während die reaktive Fische nicht die dunklen Tank lassen.

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Protocol

Das folgende Protokoll wurde von der institutionellen Animal Care und Verwendung von der Universität von Neapel Federico II, Neapel, Italien (2015) genehmigt.

1. Tier Wartung

  1. Verwenden Sie Panzer von mindestens 200 L zu einem Schwarm von mindestens 50 Personen beider Geschlechter in jedem Tank host.
    Hinweis: Die Dichte der Fische in den Tank muss ein Tier pro 2 L oder niedriger sein. Unter diesen Bedingungen zeigt Zebrafisch shoaling Normalverhalten.
  2. Die Haltungsbedingungen wie folgt festgelegt: Temperatur bei 27-28 ° C; Leitfähigkeit bei < 500 μS; pH 6,5-7,5; Nr.3 in < 0,25 mg/L; und ein Licht: dunkel Photoperiode um 10 H:14 h.
    Hinweis: Identischen Haltungsbedingungen müssen sowohl der gemischte und getrennte proaktiven und reaktiven Bevölkerung zur Verfügung.

(2) Persönlichkeit Auswahl im Zebrafisch

  1. Bereiten Sie und platzieren Sie die Persönlichkeit Auswahl Tank in einem ruhigen Raum (Abbildung 3) mit dem gleichen Wasser wie in der Instandhaltung-Tanks.
  2. Legen Sie eine Videokamera oben oder an der Seite des Tanks. Schließen Sie die Kamera an einen Computer mit einem Monitor befindet sich in einem Gebiet wo es kein Sichtkontakt mit dem Tank.
  3. Wählen Sie neun Fische nach dem Zufallsprinzip aus dem Tank Wartung und übertragen Sie sie auf die dunkle Seite der Persönlichkeit Auswahl Tank, mit einem knotenlosen Net.
    Hinweis: Versuchen Sie, die Interaktionen mit den Panzern und Fische zu den geringst möglichen Zeit zu begrenzen. Vermeiden Sie Lärm und schnelle Bewegungen. Falls erforderlich, übertragen Sie die Tiere in einem kleinen Volumen Transport Tank (ca. 2 L) mit Wasser aus dem Vorratstank. Um Luft Exposition von Tieren zu vermeiden, verwenden Sie ein 250-ml-Becherglas und induzieren Sie sanft das Tier in den Becher geben. Versuchen Sie, die Aufnahmezeit minimieren, vermeiden mehrere Fische zu sammeln, wie es den Tieren physischen Schaden zufügen könnte und halten Sie Fisch nicht mehr als ein paar Sekunden im Netz, da diese Faktoren Stress erhöhen können. Fische müssen vor der Übertragung an den experimentellen Tank ad libitum gefüttert werden. Dies schränkt die Möglichkeit, dass verschiedene Tendenzen der Nahrung suchende Verhalten das Verhalten der Personen während der folgenden Experiment22beeinträchtigen würde. Wiederholte Experimente zur gleichen Zeit des Tages. Dies minimiert die Variabilität im Verhalten von den experimentellen Gruppen verursacht durch mögliche Tagesrhythmus23.
  4. Öffnen Sie nach 1 h der Akklimatisation die Schiebetür.
    Hinweis: Personen, die aus dem Loch, Ausfahrt Erkundung der hellen Seite des Tanks innerhalb von 10 min, gelten als proaktive21.
  5. Nach 10 Minuten sanft nehmen Sie die proaktive Individuen aus dem Becken und übertragen Sie sie auf die proaktive Wartung Tank.
  6. Nach 15 min sammeln Sie die Fische, die im dunklen Feld bleiben die reaktive21gelten, und übertragen Sie sie auf die korrigierende Wartung Tank.
    Hinweis: Entsorgen Sie Fische, die auf der hellen Seite des Tanks nach 10 min21verschieben. Durchführen der Persönlichkeitstest mit neun Fische nacheinander, bis die gewünschte Anzahl von proaktiven und reaktiven Fisch notwendig für die in Abschnitt 5 beschriebenen Tests gesammelt werden. Konsistenz der proaktiven und reaktiven Persönlichkeit kann regelmäßig mit dem gleichen Ansatz überprüft werden.

3. Einrichten des magnetischen Feldes mit der eindimensionale Magnetfeld Manipulation27

  1. Schalten Sie das Netzgerät (Abbildung 2A).
  2. Legen Sie die aufgerollten Tunnel an der Stelle, wo das rheotactic Protokoll werden, durchgeführt (Abschnitt 5) aber halten es vom Schwimmbad Bodenreiniger (Abbildung 2A getrennt). Legen Sie eine Magnetsonde, verbunden mit einem Gauss/Teslameter innerhalb des Tunnels und überprüfen Sie, welche Spannung notwendig, den Wert der gewählten Magnetfeld entlang der Hauptachse des Tunnels zu erhalten ist.
    Hinweis: Aufgrund der magnetischen Eigenschaften von ein Magnetventil ist das Feld relativ einheitlich innerhalb des Tunnels; Dies kann überprüft werden, indem Sie die Sonde langsam bewegen, sowohl horizontal als auch vertikal.
  3. Trennen Sie die Sonde und verbinden Sie die Fluss-Tunnel auf den Swimming-Apparat.
  4. Beginnen Sie mit dem rheotactic-Protokoll (Abschnitt 5).

4. set Up des magnetischen Feldes mit dem dreidimensionalen Magnetfeld Manipulation27

  1. Schalten Sie die CPU, DAC und Spule Treiber (Abb. 2 b).
  2. Festlegen der gewählten Magnetfeldes auf jeder der drei Achsen (X, y und Z).
  3. Platzieren Sie den Tunnel in der Mitte der gesetzten Helmholtz-Paare.
  4. Beginnen Sie mit dem rheotactic-Protokoll (Abschnitt 5).

5. Test der Zebrafisch Rheotaxis in der Flow-Kammer

  1. Übertragen Sie ein bis fünf Fische bis zum Fluss-Tunnel mit einem 2 L Tank mit den Seiten und unten verdeckt.
  2. Schalten Sie die Pumpe und die Fließgeschwindigkeit in den Tunnel auf 1,7 cm/s.
    Hinweis: Dieses langsame Wasser hält das Wasser im Tunnel Sauerstoff und es erleichtert Tier Erholung.
  3. Lassen Sie die Tiere zum Schwimmen Tunnel für 1 h zu akklimatisieren.
  4. Starten Sie die video-Aufzeichnung des Verhaltens des Fisches im Tunnel.
    Hinweis: Wir nutzten eine Kamera (z. B. Yi 4K Aktion) mit Fernbedienung (z.B. Bluetooth) und das Video als MPG (30 Bilder/s) gespeichert.
  5. Starten Sie die schrittweise Erhöhung der Durchflussmenge gemäß dem gewählten experimentelle Protokoll (1,3 cm/s in dieser Studie; ( Abbildung 4).
    Hinweis: Für dieses Protokoll verwendet wir niedrige Durchflussmengen, die für Zebrafisch, im Bereich von 0 bis 2,8 BL (Körperlängen) / s. Diese Strömungsgeschwindigkeiten sind im unteren Bereich der Flussraten, die kontinuierliche orientierten Schwimmen im Zebrafisch (3 – 15 % der kritischen schwimmen Geschwindigkeit [UKrit])24zu induzieren. Die Verwendung von low-Flow-Rate (folgenden Brett Protokoll25) ist mit der spezifischen Verhaltensmerkmale dieser Spezies in Anwesenheit von Wasserströmungen verbunden. Zebrafisch tendenziell schwimmen entlang der Hauptachse der Kammer, häufig auch in Gegenwart von Wasser Fluss, drehen und neigen zu vor- und nachgelagerten24,26schwimmen. Dieses Verhalten wirkt sich durch die Wasser-Fluss-Rate, verschwinden bei relativ hohen Geschwindigkeiten (> 8 BL/s)26, wenn die Tiere ständig Schwimmen mit Blick auf die vorgelagerten (volle positive rheotactic Antwort). Vertikalen und transversale Verschiebungen sind sehr selten.
  6. Bilder von Fischen in einer Kammer morphometrische Morphometrie der Tiere (Geschlecht und die Gesamtlänge [TL], Gabellänge [FL] oder BL) führen.
    1. Wählen Sie das entsprechende Bild.
    2. Öffnen Sie das Bild in ImageJ.
    3. Beachten Sie das Geschlecht des Tieres (männliche Zebrafisch sind schlank und eher gelblich, während Weibchen mehr gerundet sind und blaue und weiße Farbstoffe haben tendenziell).
    4. Klicken Sie auf analysieren > Maßstab gesetzt und Set die Skalierung des Bildes in Zentimeter, die gesamte horizontale Länge des Tunnels als Referenz verwenden.
    5. Klicken Sie auf analysieren > Messung und Aufzeichnung der linearen Länge des Tieres.
    6. Seines Körpergewichts (BW) zu berechnen.
      Hinweis: BW errechnet sich aus Geschlecht-FL-BW Beziehungen zuvor im Labor gebaut oder Metadaten. Das gesamte Verfahren vermeidet Manipulation Stress für die Tiere.

6. Video Tracking

  1. Öffnen Sie die Videodatei mit Tracker 4,84 Videoanalyse und Modeling Tool.
    Hinweis: Korrigieren Sie ggf. alle video Verzerrung mit Perspektive und radiale Verzerrung Filter.
  2. Klicken Sie im oberen Menü auf Koordinatensystem und die Längeneinheiten auf Zentimeter und die Zeiteinheiten auf Sekunden.
  3. Klicken Sie auf Datei > Importieren > Video und Öffnen eines Videos in Tracker 4,84.
  4. Klicken Sie auf "Koordinatenachsen" und das Bezugssystem, die Position der Fische im Laufe der Zeit mit der x-Achse entlang des Tunnels zu verfolgen. Legen Sie den Ursprung an der niedrigen Ecke der nachgelagerten Wand (am Wasser Steckdose) endet.
  5. Klicken Sie auf Track > New > Punkt der Masse und verfolgen einen Fisch zu einem Zeitpunkt starten. Verfolgen Sie die letzte 5 min der einzelnen Schritte, die die Fische bei jeder Durchflussrate ausgegeben.
  6. Vorab das Video manuell in Abständen von fünf-Frame (0,5 s) und markieren Sie die Zeit und die Position des Tieres bei jedem stromaufwärts stromabwärts (UDt, rote Punkte in Abbildung 5) und bei jeder downstream upstream (DUt; blaue Punkte in Abbildung 5).
    Hinweis: Verwenden Sie die Fisch Augenposition als Referenz für den Fisch-Position. Verfolgen Sie das Tier Position mit einer Punkt-Masse. Die Verfolgung ausschließen eines Zeitraums von nicht-orientierten schwimmen (d. h. manövrieren Zeit).
  7. Am Ende jeder Sitzung verfolgen wählen Sie die X-Werte und Werte aus der Tabelle auf der rechten unteren Ecke des Fensters Software. Mit der rechten Maustaste auf die Daten und klicken Sie auf Daten kopieren > volle Präzision.
  8. Speichern Sie die Zeitwerte und X-Werte von allen Drehpositionen auf eine Vorlage Tabellenkalkulationsdatei vorgelagerten Gesamtzeit (Summe aller Intervalle zwischen UDts und Prüflingen) sowie die nachgeschalteten Gesamtzeit (Summe der Intervalle zwischen den Prüflingen und UDt) und die Werte berechnen der rheotactic Index in Prozent (RI %) für jede Strömung Schritt (siehe Abbildung 5).
    Hinweis: Das rheotactic Verhalten wird durch den Anteil der orientierte Gesamtzeit, die die Fische verbringen mit Blick stromaufwärts quantifiziert (Schwimmen oder selten Einfrieren [d. h., sie bleiben immer noch am Ende des Tunnels]27). Dieser Anteil ist definiert als die RI % (Abbildung 5).
    Equation

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Representative Results

Als Beispieldaten präsentieren wir Ergebnisse, die das Magnetfeld entlang der Fließrichtung Wasser auf proaktive und reaktive shoaling Zebrafisch16 mit dem Setup, dargestellt in Abbildung 2A (siehe Abschnitt 3 des Protokolls) zu kontrollieren. Diese Ergebnisse zeigen, wie das beschriebene Protokoll Unterschiede in den Reaktionen auf das magnetische Feld in Fischen mit unterschiedlichen Persönlichkeiten hervorheben kann. Das Gesamtkonzept dieser Studien stützt sich auf die Feststellung, dass die Richtung des magnetischen Feldes im Verhältnis zu den Wasserfluss die rheotactic Schwelle im Zebrafisch14shoaling betrifft. So, wie Veränderungen im Magnetfeld modulieren die Rheotaxis, dieses Protokoll kann verwendet werden, um festzustellen, ob die Reaktion der Zebrafisch auf magnetische Felder unterscheiden sich nach ihrer proaktiven und reaktiven Persönlichkeit28.

Auf den ersten, die hell/dunkel Tank verwenden, wie in Abbildung 3dargestellt, wurden in verschiedenen Gruppen entsprechend ihrer proaktiven/reaktive Persönlichkeit Zebrafisch aufgeteilt. Nach solch einem Test wurden fünf Fischschwärme mit der gleichen Persönlichkeit dann im Magnetventil schwimmen Tunnel (Abbildung 1 und Abbildung 2A) getestet. Getestet wurden insgesamt 20 Fische: zwei Untiefen, bestehend aus fünf reaktiven Fisch jeder (10 reaktive Fisch) und zwei Untiefen, bestehend aus fünf aktive Fische jeder (10 proaktive Fisch).

Ein Schwarm zu einem Zeitpunkt war video aufgezeichnet während des Schwimmens im Tunnel und die Strömung beschleunigt wurde, mit einer schrittweisen Erhöhung der Durchflussmenge wie schematisch in Abbildung 4dargestellt. Die Fische durften für 1 h in den Tunnel zu akklimatisieren. Danach wir das Protokoll für die Quantifizierung des rheotactic Verhaltens, durch eine schrittweise Erhöhung der Durchflussmenge gemäß der klassischen Brett Protokoll25aufgetragen. Insbesondere erhöht die Durchflussmenge von 0,4 BL/n alle 10 Minuten für eine Gesamtmenge von sieben aufeinander folgenden Schritten (Abbildung 4). Das Verhalten der Zebrabärbling wurde während der gesamten Dauer des Laufs in den Tunnel (70 min) aufgenommen, und der RI-Wert bei jedem Schritt wurde berechnet (siehe Protokoll Schritt 6,8).

Während die Abfahrten in den Swimming-Tunnel wurde das magnetische Feld in einem der beiden folgenden Bedingungen gesetzt: 50 μT stromabwärts (d.h. die Horizontalkomponente [entlang der x-Achse] des magnetischen Feldes hatte die gleiche Richtung des Wasserflusses) und 50 μT stromaufwärts (d. h. die horizontale Komponente des Magnetfeldes hatte eine entgegengesetzte Richtung in Bezug auf den Wasserfluss)16. Die Intensität entlang der Achsen y und z nicht betroffen waren, sowie die Gesamtintensität und Neigung des magnetischen Feldvektors. Jeweils fünf Fischschwarm war nur eines der beiden magnetischen Bedingungen ausgesetzt. Zum Beispiel in Anbetracht proaktive Fisch, eine proaktive Untiefe hatte das Magnetfeld stromabwärts gerichtet und die proaktive Untiefe hatte das Magnetfeld ausgerichtet flussaufwärts.

Die Videos wurden dann mit der Video-Tracking-Software (Art. 6 des Protokolls) analysiert. Die Fische waren video aufgezeichnet für die gesamte Dauer des Laufs in den Swimming-Tunnel. Allerdings wurden nur die letzte 5 min jede 10 min lang schrittweise Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit (Abbildung 4) verfolgt. Solange die verfolgten, die Windungen der jeder Fisch bei jeder Durchflussrate wurden hervorgehoben (Abbildung 5, roten und blauen Datenpunkte). Diese wurden dann als Referenzen verwendet, um die RI jeden Fisch und jedes Strömungsgeschwindigkeit (Abbildung 5) zu berechnen. Die RI-Index bewegt sich zwischen 0 % und 100 %. Bei unter 50 %, gibt den RI-Index, dass die Fische angezeigt negative Rheotaxis (Prävalenz der nachgeschalteten Schwimmen); Wenn die RI höher als 50 % ist, zeigt es, dass das Tier eine positive rheotactic Reaktion (Prävalenz stromaufwärts schwimmen hatte). Eine RI nicht signifikant verschieden von 50 % würde eine keine rheotactic Antwort geben. Die Werte der RI % aller fünf Fische in einem Schwarm wurden dann bei jeder Durchflussrate gemittelt. Diese gemittelten Daten wurden arcsin umgewandelt und verwendet, um die Kurven in Abbildung 6Aangezeigt passen. Somit erhöht sich der rheotactic Index sigmoidally steigt die Wassergeschwindigkeit erlaubt die Quantifizierung der Rheotaxis mit einer einfachen mathematischen Methode. Die Beziehung zwischen der RI und der Durchflussmenge kann das folgende logistische sigmoidale Modell montiert werden.

Drei Parameter und ihre Variabilität können aus der Fit-Kurve abgeleitet werden. Die RI-Plateau misst die maximale Neigung der Tiere flussaufwärts im Bereich von Durchflussmengen verwendet im Experiment zu orientieren. RIunten ist der RI-Wert in der Abwesenheit von Wasser-Strömung und hypothetisch, sollte nicht von 50 % abweichen. Rtr ist die ist die Durchflussmenge bei der die maximale Steigung der Kurve auftritt, und es kann als ein Maß für die rheotactic Schwelle6verwendet werden.

Die Ergebnisse zeigen, dass die rheotactic Schwelle (Rtr) der Zebrafisch sehr gering, im Bereich von wenigen Zentimetern pro Sekunde ist. Variationen des magnetischen Feldes haben keinen Einfluss auf Rtr proaktive Fische (keine Wirkung des magnetischen Feldes, t-test, P > 0.05). Entgegengesetzt, Magnetfeld Änderungen haben eine ausgeprägte Wirkung auf das rheotactic Verhalten der reaktiven Zebrafisch. Wenn die magnetische Feldkomponente entlang des Tunnels schwimmen stromabwärts gerichtet war, ist der R-tr sehr niedrig und proaktive Fisch ähnelt. Die Schwelle war signifikant höher, wenn das Magnetfeld stromaufwärts gerichtet war (t-test, P < 0,01).

Der RI Plateauwert von reaktiven Tieren war signifikant niedriger, wenn das Magnetfeld stromaufwärts gerichtet war (t-test, P < 0,01). Dieses Ergebnis zeigt, dass mit diesen Bedingungen reaktive Fische die volle positive rheotactic Antwort erreichen würde (RI = 100 %) nur bei sehr hohen Strömungsgeschwindigkeiten. So, dieses Ergebnis zeigt, dass, im Vergleich zu Rtr, RIPlateau bietet weniger Informationen über das Schwimmen-Verhalten der Fische. In der Tat können basierend auf den starken Unterschied in der reaktiven RIPlateau zwischen den zwei magnetischen Bedingungen, wir feststellen, dass unter den upstream-orientierte Magnetfeld, die reaktive Tiere an einem höheren Wasser wahrscheinlich eine volle rheotactic Antwort angezeigt wird Fluss.

RIunteren Werte tendenziell höher (wenn auch nicht signifikant) über 50 % in die proaktive Tiere und die reaktiven Tiere ein downstream-orientierte Magnetfeld ausgesetzt. Dies kann eine Vorspannung im Protokoll anzugeben, da die Tiere zeichnet sich durch eine sehr niedrige Schwelle die Fließrichtung erfahrenen während der Akklimatisierung erinnern können. Eine richtige Protokoll kann entwickelt werden, um diese Möglichkeit zu testen.

Figure 1
Abbildung 1: Vereinfachte Darstellung der das Schwimmen tunnel Apparat in der vorliegenden Studie genutzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Setup für magnetische Feldsteuerelement. (A) Darstellung des Tunnels Schwimmen mit ein Magnetventil für die Induktion von einem statischen, horizontale Magnetfeld innerhalb des Tunnels. Das Magnetventil (0,83 Umdrehungen/cm) an ein Netzteil angeschlossen ist und es generiert Felder im Bereich von ±250 µT (Intensitätsbereich, das Magnetfeld der Erde umfasst). Auf der rechten Seite zeigt ein Foto von der Magnetspule Tunnel an den Swimming-Apparat angeschlossen. Der Tunnel besteht aus Acryl und es hat zwei Acryl Lochbleche an der Wassereinlass platziert, die den Fluss in der Nähe von laminar zu garantieren. (B) Diagramm und Foto der drei orthogonalen Helmholtz-Paare set für die Kontrolle des magnetischen Feldes im Bereich von geomagnetischen Intensitäten. Die Magnetfeld-Sonde, die CPU, die Digital-Analog-Wandler und die Spule-Treiber verwendet, um den Kreislauf zu schließen, werden auch angezeigt. Jedes Paar von Spulen besteht aus zwei kreisförmigen Spulen mit einem Radius (R) von 30 cm und N = 50 Windungen der AWG-14 Kupfer-Drähte. Ein drei-Achsen Magnetometer (Sensor) mit wählbarer Skala (± 88 µT bis ± 810 µT) befindet sich nahe dem Zentrum der Spule Set. Die Reichweite des Sensors ist auf Werte bis hin zu ±130 µT festgelegt. Diese Werte wurden auch verwendet für die Messungen in die repräsentativen Ergebnisse beschrieben (unter diesen Bedingungen ist die nominellen Sensorauflösung etwa 0,1 µT). Die Intensität und die Richtung des magnetischen Feldes werden mit einer digitalen Feedback-System gesteuert. Der Sensor misst die drei Komponenten des Magnetfeldes Vektors (die drei Achsen), und die entsprechenden Fehlersignale werden extrahiert. Die Korrektursignale werden dann durch einen einfachen Integrator-Filter erzeugt. Die digitale Korrektur-Signale werden durch einen Digital-Analog-Wandler in Spannung umgewandelt und verstärkt durch einen geeigneten Spule-Treiber. Diese letzten Signale werden verwendet, um die Helmholtz-Paare zu fahren. Die Sampling-Frequenz wird auf 5 Hz fixiert und die Einheit Gewinn Frequenz der Schlaufen ist etwa 0,16 Hz. Wenn die Ströme in den Helmholtz-Paaren der Spulen eingestellt sind, variiert das gesamte Magnetfeld weniger als 2 % von seinem mittleren Intensitätswert im zentralen kubischen Volumen (mit Rand [L] = 10 cm) der Spulen. Während der Messungen ist die Magnetfeld rms weniger als 0,2 µT. In beiden Setups (Platten A und B) wird von der Strömung in den Spulen erzeugen magnetische Feld16ein statisches elektrisches Feld erzeugt. Die Intensität des elektrischen Feldes ist etwa 0,4 V/m, wenn der maximale Strom angewendet wird; Dieser Wert ist vernachlässigbar im Vergleich zu natürlichen oder künstlichen statische Felder in der Umgebung, deren Intensität des Ordens 1 kV/m17ist, vorhanden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Tanks (40 x 40 cm x 40 cm) verwendet, um proaktiv von reaktiven Zebrafisch Einzelpersonen (nicht im Maßstab), laut Rey Et Al.21trennen. Das Volumen der Persönlichkeit Auswahl Tanks beträgt 50 L. Hälfte des Behälters von einem dunklen Kasten mit einem Loch von 5 cm im Durchmesser an der Seite der Box mit Blick auf die helle Hälfte des Tanks besetzt war. Das Loch wurde durch eine Schiebetür (nicht dargestellt), umfaßt deren Eröffnung der Beginn der Auswahl Prüfung unterzeichnet. Die dunkle Seite des Tanks braucht einen abnehmbaren Deckel, Zugang von Hand Netze ermöglichen. Dies erleichtert die Platzierung oder fangen Fische vor und nach der behavioralen Studien. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Diagramm der Flussraten während der Tests verwendet, um festzustellen, die rheotactic Schwelle von Zebrafisch. Die Strömung im Zeitraum 1 h Akklimatisierung war genug, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung der Tiere zu gewährleisten. Es ist davon auszugehen, dass mit diesem Design Sauerstoffversorgung nie eine Grenze, auch in den ersten 10 min Schritt mit Flow 0 ist. In der Tat mit einem Sauerstoffgehalt des Wassers bei 27 ° C von etwa 7,9 mg/L und ein Tier Sauerstoffverbrauch der 1 mg/h.g (eine überschüssige Näherung für Zebrafisch Sauerstoffverbrauch unter Routinebedingungen [Uliano Et Al.29] und bei niedriger Geschwindigkeit schwimmen [Palstra et al.30]), ist es möglich zu berechnen, dass bei fehlender Strömung, die Po-2 in die Klamm nicht mehr als 2 % pro Tier, bleibt weit über die kritische Po-2 (ca. 40 Torr für Zebrafisch) sinkt. Diese Zahl wurde von Cresci Et Al.14geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Verhalten der Tiere in den Tunnel und die Berechnung von RI. Die Diagramme präsentieren die Position eines einzelnen Tieres entlang der x-Achse während ein 300 s-Rekord bei drei Werte der Durchflussmenge. Die roten Punkte stellen die downstream, upstream Windungen, die blauen Punkte der upstream, downstream dreht. Die entsprechenden Zeitintervalle verbrachten die Tiere flussabwärts oder flussaufwärts sind auch berichtet, und vor- und nachgelagerten Gesamtzeiten werden gemeldet, von denen ein RI-Wert berechnet werden kann. Es ist festzustellen, dass wenn die Durchflussmenge vorgelagerten stetig und RI-Werte erhöhen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse. (A) Beziehung zwischen arcsin-transformierten RI Werten (RI ist der Prozentsatz der Gesamtzeit orientiert, dass Fische verbringen mit Blick stromaufwärts) und der Durchfluss für proaktive und reaktive shoaling Zebrafisch unter zwei magnetische Feldbedingungen entlang dem Fluss Kurs Richtung (ein-Dimension Control). Jeder Datenpunkt ist der Durchschnitt der RI Werte der fünf Fische die Untiefe bei jedem Durchfluss zu komponieren. Signifikante Unterschiede zwischen den Kurven wurden getestet, über eine Summe von Quadraten F-test (Alpha = 0,05)14. (B) Magnetfeld Achsen und Richtung des Wassers fließen in den Tunnel. Eine dreidimensionale Darstellung der magnetischen Vektoren in zwei magnetische Feldbedingungen in dieser Studie verwendet wird ebenfalls angezeigt. Das Magnetfeld im Labor (40 ° N, 14 ° E) war: F = 62 μT; Ich = 64°; D = 44°. Diese Zahl wurde von Cresci Et Al.16geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In dieser Studie beschriebene Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, komplexe Orientierung Antworten von aquatischen Arten, die aus der Integration zwischen zwei externen Cues (Wasser aktuelle und geomagnetische Feld) und einem internen Faktor des Tieres, wie z. B. zu quantifizieren Persönlichkeit. Das Gesamtkonzept ist ein experimentelles Design erstellen, das können Wissenschaftler zu trennen Personen unterschiedlicher Persönlichkeit und deren Orientierungsverhalten während Steuerung separat oder gleichzeitig die externe Umwelt Cues zu untersuchen.

Das Protokoll beschrieben in dieser Studie, sowie die mathematische Definition des rheotactic Index (RI), wurde nach vorläufigen Beobachtungen des Verhaltens der Zebrafisch im Schwimmen Tunnel konzipiert. Wenn in einen Tunnel gelegt, diese Tiere zeigen zwei Arten von Verhaltensmustern, sowohl in das Fehlen oder Vorhandensein von Wasser Fluss: orientierten schwimmen und manövrieren. Sie verbringen den größten Teil der ausgerichteten Zeit (in der Regel die Fische waren video für mehr als 95 % der Zeit aufgezeichnet) schwimmen entlang des Tunnels (d. h. entlang der Längsachse mit einem Winkel unter 45° orientiert), hin und her drehen in der Nähe von den Stirnwänden und oft sh Thigmotaxis (d.h., Schwimmen in der Nähe von den Wänden des Tunnels)27zu verdanken.

Für dieses Protokoll um erfolgreich zu sein ist es wichtig, daß, wer das Experiment führt auf den Stress der Tiere achtet. Der Transport von Fischen zwischen den Versuchsaufbauten muss mit Sorgfalt ausgeführt werden. Die Verwendung von Hand Netze sollte so schnell wie möglich, und einige Ausbildung, bevor das eigentliche Experiment als Zebrafisch empfehlenswert schnelle Schwimmer sind und schwer zu fangen in einem Tank. Stress kann dramatisch beeinflussen das Verhalten dieser Tiere, und im Falle der Zebrafisch, kann es deutlich ändern ihre schwimmen Verhalten27. Dies würde wahrscheinlich die Ergebnisse beeinflussen, wie Fische können hyperaktives Verhalten und unempfindlicher gegen Wasser fließt und Magnetfeldes ändert. Kontakt mit den Tieren in den Versuchsaufbau sollte möglichst schnell und möglichst kurz sein. Die Verhaltensanalyse erfordert remote Beobachtung, wonach auch Praxis. Darüber hinaus ist es wichtig, die Videos analysieren blind (d.h., ohne zu wissen, Protokolle und Behandlungen).

Das rheotactic Verhalten der vielen Fischarten wurde untersucht, mit Schwimmen Tunnel5,10,11,31. Zahlreiche frühere Studien konzentrierten sich auf die Schätzung der Geschwindigkeit schwimmen, dass Fisch bis zur Erschöpfung,, definiert als UCrit aufrechterhalten können, um meist zu testen, physiologischen und ökologischen Hypothesen11,32, 33. in dieser Studie beschriebene Methode konzentriert sich stattdessen auf das rheotactic Verhalten bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten. Diese Wahl wurde getroffen, da das Ziel dieser Studie ist es, die Empfindlichkeit auf eine subtile und schwach Cue wie das Magnetfeld durch die Beobachtung des bekannten und robusten Orientierungsverhalten von Fischen, die positive Rheotaxis zu beurteilen. Zebrafisch angezeigt in die repräsentativen Ergebnisse hier berichtet eine sehr niedrige rheotactic Schwelle (nur ein paar Zentimeter pro Sekunde). Diese Beobachtung könnte ökologisch relevant für diese Spezies, die Umgebungen bewohnt, wobei die Geschwindigkeit der Strömungen erheblich variieren kann. Zebrafisch Leben beide in turbulenten Flüsse34 und in Gewässern, wo das Wasser langsam bewegt, wie Reisfelder, Teiche und Auen35. Wenn Wasser langsam bewegt, könnte die Fähigkeit zu erkennen und zu orientieren bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten (eine niedrige rheotactic Schwelle) möglicherweise vorteilhaft, als die rheotactic Reaktion die Chancen erhöht, stromabwärts treiben Beute36 abzufangen und bietet gerichtete Impulse für Migration37.

Diese Beobachtungen konnte nicht hergestellt werden, fließt mit hohen Raten. Diese würde eine starke Muskeln Reaktion auslösen, die mehr auf die körperlichen Zustand und hohe schwimmen Leistungen der Tiere als externe Signale wie das magnetische Feld abhängen würde. Die hier vorgestellten Protokoll auf Zebrafisch angewendet wurde, aber es ist wahrscheinlich, geeignet für alle Süßwassersee oder Meerwasser Arten, die in Umgebungen mit bewegten Leben Wasser und unter Laborbedingungen umgegangen werden können.

Dieses Protokoll stellt jedoch einige Einschränkungen. Während es deutlich hervorgehoben sei eine Art empfindlich oder nonsensitive auf magnetische Felder, kann nicht es die Orientierungsmechanismen verraten, das Tier durch die Magnetfelder für Bewegung Entscheidungen verwendet. Um die magnetische Ausrichtung Mechanismen in aquatischen Arten zu untersuchen, sind Setups mit kreisförmigen Arenen und stilles Wasser7,38,39 oder Labyrinthe13 gebräuchlich. Allerdings leben Fische (und Wassertiere im Allgemeinen) nicht in Umgebungen, wo Ströme sind nicht vorhanden, und die vorgestellte Methode ist ein erster Versuch, die integrative Verhaltensreaktion zum allgegenwärtigen gerichtete Signale zu untersuchen, wie Wasser fließt und magnetischen Felder. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist die manuelle Video-Tracking-Verfahren. Dieses Setup mit einer automatischen Tracking-Software zu integrieren, würde das Timing der gesamten Daten Analyse verbessern.

Das experimentelle Protokoll hier vorgestellten ist der erste entwickelt, um den Einfluss der tierischen Persönlichkeit auf magnetische Empfindlichkeit und Rheotaxis zu untersuchen. Dieses Thema in der Literatur übersehen wurde und weiter untersucht werden muss. Individuen derselben Art oder sogar innerhalb einer Bevölkerung oder eine kleine Gruppe (z. B. einem Fischschwarm), zeichnen sich durch unterschiedliche Persönlichkeit Züge22,40, die ein wichtiger Faktor in Studien über wandernde sein können, explorative, Navigation und Orientierungsverhalten. Nicht alle Individuen integrieren die ökologische Hinweise auf die gleiche Weise. So konnte unter Berücksichtigung interner Faktoren, wie Persönlichkeit, helfen, um die Variabilität der Daten zu verringern, die häufig in Studien über die Bewegung Ökologie16beobachtet wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Studie wurde unterstützt durch die grundlegende Forschung Gründung des Fachbereichs Physik und die Biologie-Abteilung der Universität Federico II Neapel. Die Autoren danken Dr. Claudia Angelini (Institut für angewandte Kalkül, Consiglio Nazionale Delle Ricerche [CNR], Italien) für die statistische Unterstützung. Die Autoren danken Martina Scanu und Silvia Frassinet für ihre technische Unterstützung bei Erhebung der Daten und die Abteilungs-Techniker F. Cassese, G. Spazierweg und R. Rocco für ihre geschickte Unterstützung bei der Gestaltung und Realisierung des experimentellen Aufbaus. Wir danken für die Unterstützung der Durchführung des Experiments während der Videoaufnahme Laura Gentile. Wir bedanken uns bei Diana Rose Udel von der University of Miami für die Interview-Aussagen von Alessandro Cresci schießen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
9500 G meter FWBell N/A Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution:  0.01 μT 
AD5755-1 Analog Devices EVAL-AD5755SDZ Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D ELC 3760244880031 DC Double Regulated power supply
BeagleBone Black Beagleboard.org N/A Single Board Computer
Coil driver Home made N/A Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs Home made N/A Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L Honeywell 900405 Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506 FWBell 129966 Single axis magnetic probe
Swimming apparatus M2M Engineering Custom Scientific Equipment N/A Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278 TECO N/A Thermo-cryostat 

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Bewerten den Einfluss der Persönlichkeit auf Empfindlichkeit gegenüber Magnetfeldern im Zebrafisch
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Cresci, A., De Rosa, R., Agnisola, C. Assessing the Influence of Personality on Sensitivity to Magnetic Fields in Zebrafish. J. Vis. Exp. (145), e59229, doi:10.3791/59229 (2019).

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