Summary
Descriviamo un protocollo comportamentale progettato per valutare come personalità di zebrafish influenza la loro risposta ai cambiamenti delle acque correnti e campi magnetici deboli. Pesci con la stessa personalità vengono separati in base al loro comportamento esplorativo. Quindi, si osserva il loro comportamento di orientamento rheotactic in un tunnel con un tasso di flusso debole e condizioni magnetiche diverse.
Abstract
Per orientarsi nel loro ambiente, gli animali integrano una vasta gamma di indicazioni esterne, che interagiscono con diversi fattori interni, quali personalità. Qui, descriviamo un protocollo comportamentale progettato per lo studio dell'influenza della personalità di zebrafish per la loro risposta di orientamento a più stimoli ambientali esterni, in particolare correnti d'acqua e campi magnetici. Questo protocollo ha lo scopo di capire se proattivo o reattivo zebrafish visualizzare le soglie di rheotactic diverse (cioè, la velocità di flusso in cui il pesce inizia a nuotare a Monte) quando il campo magnetico circostante cambia la sua direzione. Per identificare zebrafish con la stessa personalità, pesce vengono introdotti al buio la metà di un serbatoio collegata con una stretta apertura per una metà luminosa. Solo proattivo pesce esplorare il romanzo, ambiente luminoso. Pesce reattive non uscire la metà oscura del serbatoio. Un tunnel con basse portate viene utilizzato per determinare la soglia di rheotactic. Descriviamo due configurazioni per controllare il campo magnetico nel tunnel, nel range di intensità del campo magnetico della terra: uno che controlla il campo magnetico lungo la direzione del flusso (una dimensione) e uno che permette un controllo tri-assiale del campo magnetico. Pesci sono filmati mentre vivendo un aumento graduale della velocità di flusso nel tunnel sotto diversi campi magnetici. Dati sul comportamento di orientamento sono raccolti attraverso una procedura di video-monitoraggio e applicati a un modello logistico per consentire la determinazione della soglia rheotactic. Segnaliamo i risultati rappresentativi raccolti da shoaling zebrafish. In particolare, questi dimostrano che solo reattive, prudente pesce mostrano variazioni della soglia rheotactic quando il campo magnetico varia nella sua direzione, mentre pesce proattive non rispondono alle variazioni di campo magnetico. Questa metodologia può essere applicata per lo studio della sensibilità magnetica e comportamento rheotactic di molte specie acquatiche, sia visualizzati da solitario o shoaling piscina strategie.
Introduction
Nello studio presente, descriviamo un protocollo comportamentale basato su laboratorio che ha lo scopo di investigare il ruolo della personalità di pesce sulla risposta orientamento di shoaling pesce a segnali di orientamento esterno, ad esempio correnti d'acqua e campi magnetici.
Le decisioni di orientamento degli animali dovute a varie informazioni sensoriali di pesatura. Il processo di decisione è influenzato dalla capacità dell'animale di navigare (ad esempio, la capacità di selezionare e mantenere una direzione), stato interno (ad es., esigenze di alimentazione o riproduttive), la capacità di movimento (ad es., biomeccanica di locomozione) e diversi ulteriori fattori esterni (ad es., ora del giorno, interazione con i conspecifici)1.
Il ruolo dello stato interno o animale personalità del comportamento di orientamento è spesso poco conosciuto o non esplorato2. Ulteriori sfide derivano nello studio dell'orientamento delle specie acquatiche sociale, che spesso eseguire coordinato e polarizzati gruppo movimento comportamento3.
Correnti d'acqua giocano un ruolo chiave nel processo di orientamento del pesce. Pesce orientano per acqua correnti attraverso una risposta di unconditioned chiamato rheotaxis4, che può essere positivo (cioè, a Monte orientato) o negativo (cioè a valle orientata) e viene utilizzati per diverse attività, che vanno dal foraggiamento alla minimizzazione degli dispendio energetico5,6. Inoltre, un corpo crescente di letteratura segnala che molte specie di pesci utilizzare il campo geomagnetico per orientamento e navigazione7,8,9.
Lo studio delle prestazioni rheotaxis e nuoto nel pesce si svolge generalmente in alloggiamenti di flusso (canale), dove pesci sono esposti all'aumento graduale della velocità del flusso, da bassa ad alta velocità, spesso fino ad esaurimento (chiamato velocità critica)10, 11. D'altra parte, gli studi precedenti studiato il ruolo del campo magnetico nell'orientamento attraverso l'osservazione del comportamento nuoto degli animali nelle arene con ancora acqua12,13. Qui, descriviamo una tecnica di laboratorio che permette ai ricercatori di studiare il comportamento del pesce durante la manipolazione sia le correnti di acqua ed il campo magnetico. Questo metodo è stato utilizzato per la prima volta su shoaling zebrafish (Danio rerio) nel nostro studio precedente, portando alla conclusione che la manipolazione del campo magnetico circostante determina la soglia di rheotactic (cioè, la velocità minima d'acqua presso quale shoaling pesce orient a Monte)14. Questo metodo si basa sull'uso di una camera di flume con lenti flussi combinati con un programma di installazione progettato per controllare il campo magnetico nel canale, all'interno della gamma di intensità del campo magnetico della terra.
Il tunnel di nuoto utilizzato per osservare il comportamento di zebrafish è descritto nella Figura 1. Il tunnel (costituito da un cilindro di acrilico nonreflecting con un diametro di 7 cm e 15 cm di lunghezza) è collegato a una configurazione per il controllo del flusso tasso14. Con questa configurazione, la gamma di velocità di flusso nel tunnel varia tra 0 e 9 cm/s.
Per manipolare il campo magnetico nella galleria del nuoto, usiamo due approcci metodologici: il primo è unidimensionale e il secondo è tridimensionale. Per qualsiasi applicazione, questi metodi modificano il campo geomagnetico per ottenere condizioni specifiche magnetiche in un volume definito di acqua — così, tutti i valori di intensità di campo magnetico riferiti in questo studio includono il campo geomagnetico.
Per quanto riguarda l'unidimensionale approccio15, il campo magnetico viene manipolato lungo la direzione del flusso dell'acqua (definita come l'asse x) utilizzando un solenoide avvolto attorno al tunnel di nuoto. Questo è collegato a un'unità di alimentazione, e che genera campi magnetici statici uniformi (Figura 2A). Allo stesso modo, nel caso l'approccio tridimensionale, viene modificato il campo geomagnetico del volume contenente il tunnel di nuoto usando le bobine di fili elettrici. Tuttavia, per controllare il campo magnetico in tre dimensioni, le bobine sono la progettazione di tre paia di Helmholtz ortogonale (Figura 2B). Ogni coppia di Helmholtz è composto da due bobine circolari orientati lungo le tre direzioni ortogonali spazio (x, ye z) e dotato di un magnetometro tri-assiale lavorando in condizioni di circuito chiuso. Il magnetometro funziona con le intensità di campo paragonabile con campo naturale della terra, e si trova vicino al centro geometrico del set di bobine (dove si trova il tunnel di nuoto).
Implementiamo le tecniche sopra descritte per testare l'ipotesi che i tratti di personalità del pesce che compongono una secca influenzano il modo che rispondono a campi magnetici16. Verifichiamo l'ipotesi che gli individui con personalità proattiva e reattiva17,18 rispondono in modo diverso quando esposti ai flussi di acqua e campi magnetici. Per eseguire questo test, abbiamo innanzitutto ordinare zebrafish utilizzando una metodologia consolidata per assegnare e gli individui del gruppo che sono proattivo o reattivo17,19,20,21. Quindi, valutiamo il comportamento rheotactic di zebrafish nuotare in branchi composti da solo reattivi individui o composto solo proattivi individui nel serbatoio magnetica flume, che presentiamo come dati di esempio.
Il metodo di ordinamento si basa sulla diversa tendenza degli individui proattivi e reattivi per esplorare nuovi ambienti21. In particolare, usiamo un serbatoio diviso in un brillante e un lato oscuro17,19,20,21 (Figura 3). Gli animali sono acclimatati al lato oscuro. Quando l'accesso al lato luminoso è aperta e proattiva gli individui tendono ad abbandonare la metà oscura del serbatoio per esplorare il nuovo ambiente, mentre il pesce reattivo non lasciare il serbatoio scuro.
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Protocol
Il seguente protocollo è stato approvato dal comitato di uso dell'Università di Napoli Federico II, Napoli, Italia (2015) e istituzionali Animal Care.
1. animale manutenzione
- Utilizzare serbatoi di almeno 200 L per ospitare un branco di almeno 50 individui di entrambi i sessi in ogni serbatoio.
Nota: La densità del pesce nel serbatoio deve essere un animale a L 2 o inferiore. In queste condizioni, zebrafish visualizzerà shoaling normale comportamento. - Impostare le condizioni di manutenzione come segue: temperatura a 27 – 28 ° C; conducibilità a < 500 μS; pH 6.5-7.5; Nessun3 a < 0,25 mg/L; e un fotoperiodo di luce: scuro a 10 h:14 h.
Nota: Condizioni di detenzione identici devono essere utilizzate per la popolazione mista e le popolazioni separate proattive e reattive.
2. la personalità selezione in Zebrafish
- Preparare e posizionare il serbatoio di selezione di personalità in una camera tranquilla (Figura 3) con la stessa acqua utilizzata nelle vasche di manutenzione.
- Posto una videocamera di sopra o a fianco del serbatoio. Collegare la fotocamera a un computer con un monitor situato in una zona dove non c'è nessun contatto visivo con il serbatoio.
- Selezionare nove pesci in modo casuale dal serbatoio di manutenzione e trasferirli al lato oscuro della cisterna selezione personalità, con una rete priva di nodi.
Nota: Provare a limitare le interazioni con i carri armati e pesce per il minor tempo possibile. Evitare rumori e movimenti veloci. Se necessario, trasferire gli animali in un piccolo volume di trasporto serbatoio (circa 2 L) con acqua dal serbatoio di. Per evitare l'esposizione all'aria degli animali, utilizzare un becher da 250 ml e indurre delicatamente l'animale per entrare Becher. Cercare di ridurre al minimo il tempo di acquisizione, evitare di raccogliere più pesce in quanto potrebbe causare danni fisici agli animali e non in grado di tenere i pesci per più di pochi secondi nella rete come questi fattori possono aumentare lo stress. Pesce devono essere alimentati ad libitum prima del trasferimento al serbatoio sperimentale. Questo limita la possibilità che diverse tendenze di comportamento diricerca sarebbero influiscono sul comportamento degli individui durante il seguente esperimento22. Condurre esperimenti replicati allo stesso tempo del giorno. Questo riduce al minimo la variabilità nel comportamento dei gruppi sperimentali causato da possibili ritmi circadiani23. - Dopo 1 h di acclimatazione, aprire la porta scorrevole.
Nota: Persone che escono dal buco, esplorare il lato positivo del serbatoio entro 10 min, vengono considerate proattiva21. - Dopo 10 min, rimuovere gli individui proattivi dal serbatoio delicatamente e trasferirli al serbatoio di manutenzione proattiva.
- Dopo 15 min, raccogliere i pesci che rimangono nella casella di scura, che sono considerati reattiva21e trasferirli al serbatoio di manutenzione reattiva.
Nota: Gettare il pesce che si muovono al lato luminoso del serbatoio dopo 10 min21. Eseguire il test della personalità con nove pesci alla volta finché il numero desiderato di pesce proattivi e reattivi necessari per i test descritti nella sezione 5 è raccolti. La coerenza della personalità proattiva e reattiva può essere verificata regolarmente utilizzando lo stesso approccio.
3. messa a punto del campo magnetico con la manipolazione di campo magnetico unidimensionali27
- Accendere l'unità di potenza (Figura 2A).
- Posizionare il tunnel a spirale nel punto dove il protocollo rheotactic sarà eseguita (sezione 5) ma tenete che scollegato dall'apparato di nuoto (Figura 2A). Posizionare una sonda magnetica collegata con un Gauss/Teslametro all'interno del tunnel e verificare che la tensione è necessaria per ottenere il valore di selezionate campo magnetico lungo l'asse maggiore del tunnel.
Nota: A causa delle proprietà magnetiche di un elettromagnete, il campo è ragionevolmente uniforme all'interno del tunnel; Questo può essere controllato spostando lentamente la sonda sia orizzontalmente che verticalmente. - Staccare la sonda e collegare il tunnel di flusso all'apparato di nuoto.
- Iniziare con il protocollo rheotactic (sezione 5).
4. impostazione del campo magnetico con il campo magnetico tridimensionale manipolazione27
- Accendere la CPU, DAC e bobina driver (Figura 2B).
- Impostare il campo magnetico selezionato su ciascuno dei tre assi (x, y e z).
- Posizionare il tunnel al centro del set di coppie di Helmholtz.
- Iniziare con il protocollo rheotactic (sezione 5).
5. test del Rheotaxis di Zebrafish nella camera di flusso
- Trasferire un massimo di cinque pesci per il tunnel di flusso utilizzando un serbatoio 2L con i lati e la parte inferiore oscurato.
- Accendere la pompa e impostare la velocità di flusso nel tunnel a 1,7 cm/s.
Nota: Quest'acqua dispostamento manterrà l'acqua nel tunnel ossigenato e faciliterà il recupero degli animali. - Lasciate che gli animali acclimatare al traforo del nuoto per 1 h.
- Avviare la registrazione video del comportamento dei pesci nel tunnel.
Nota: Abbiamo usato una fotocamera (ad es., Yi 4K azione) con controllo remoto (ad esempio, Bluetooth) e salvato il video come MPG (30 fps). - Avviare l'aumento graduale della portata secondo il protocollo sperimentale selezionata (1,3 cm/s in questo studio; Figura 4).
Nota: Per questo protocollo, abbiamo usato basse portate che, per zebrafish, vanno da 0 a 2,8 BL (lunghezze di corpo) / s. Queste velocità di flusso sono nella gamma più bassa delle portate che inducono nuoto continuo orientato in zebrafish (3% – 15% di velocità di nuoto critica [Ucrit])24. L'uso di basse portate (protocollo25) di Brett seguente è legata alle specifiche caratteristiche comportamentali di questa specie in presenza di correnti d'acqua. Zebrafish tendono a nuotare lungo l'asse maggiore della sezione, girando spesso, anche in presenza di flusso di acqua e tendono a nuotare sia a Monte che a valle24,26. Questo comportamento è interessato dalla portata d'acqua, scomparendo a velocità relativamente elevate (> 8 BL/s)26, quando gli animali nuotare continuamente di fronte a Monte (risposta completa positiva rheotactic). Gli spostamenti verticali e trasversali sono molto rari. -
Eseguire la morfometria degli animali (sesso e totale lunghezza [TL], [FL] la lunghezza della forcella o BL) su immagini di pesci in una camera di morfometrica.
- Selezionare l'immagine appropriata.
- Aprire l'immagine in ImageJ.
- Prendere nota del sesso dell'animale (zebrafish maschile sono sottili e tendono ad essere giallastro, mentre le femmine sono più arrotondate e tendono ad avere colorazioni blu e bianchi).
- Fare clic su analizza > Imposta scala e impostare la scala dell'immagine in centimetri, utilizzando la lunghezza intera orizzontale del tunnel come riferimento.
- Fare clic su analizza > misurare e registrare la lunghezza lineare dell'animale.
- Calcolare il suo peso corporeo (BW).
Nota: BW è calcolata da sesso-FL-BW relazioni precedentemente costruite in laboratorio o dai metadati. L'intera procedura evita stress manipolazione sugli animali.
6. video Tracking
- Aprire il file video con Tracker 4,84 Video analisi e strumento di modellazione.
Nota: Se necessario, correggere qualsiasi distorsione video utilizzando la prospettiva e la distorsione radiale filtri. - Fare clic su sistema di Coordinate nel menu in alto e impostare le unità di lunghezza in centimetri e le unità di tempo in secondi.
- Fare clic su File > Import > Video e aprire uno dei video in 4,84 Tracker.
- Fare clic su "Assi cartesiani" e impostare il sistema di riferimento per monitorare la posizione del pesce nel corso del tempo, con l'asse x lungo il tunnel. Impostare l'origine nell'angolo basso della Valle termina parete (presso l'acqua presa).
- Fare clic sulla traccia > New > punto di massa e iniziare a rilevare un pesce in un momento. Traccia l'ultimo 5 min di ogni passo che il pesce trascorso ad ogni portata.
- Far avanzare il video manualmente a intervalli di cinque-telaio (0,5 s) e segnare il tempo e la posizione dell'animale ad ogni turno a Monte e a valle (UDt; puntini rossi in Figura 5) e ad ogni turno a valle a Monte (DUt; puntini blu nella Figura 5).
Nota: Utilizzare la posizione dell'occhio di pesce come un riferimento per posizione dei pesci. Controlla la posizione dell'animale utilizzando una messa a punto. Escludere dal tracking qualsiasi periodo di nuoto-orientato (vale a dire, tempo di manovra). - Alla fine di ogni sessione di tracciamento, selezionare i valori di x e ora i valori della tabella all'angolo inferiore destro della finestra del software. Pulsante destro del mouse sui dati e fare clic su copia dati > precisione completa.
- Salvare i valori di tempo e x-valori di tutte le posizioni di tornitura su un file di modello di foglio di calcolo per calcolare il tempo totale a Monte (somma di tutti gli intervalli tra gli UDT e DUts) e il tempo totale a valle (somma degli intervalli tra EUT e UDt), nonché i valori dell'indice rheotactic in percentuali (RI %) per ogni flusso di passaggio (Vedi Figura 5).
Nota: Il comportamento rheotactic è quantificato la percentuale del tempo totale orientato che il pesce trascorrere rivolto verso Monte (nuoto o raramente congelamento [cioè, rimangono ancora nella parte inferiore del tunnel]27). Questa proporzione è definita come il RI % (Figura 5).
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Representative Results
Come dati di esempio presentiamo risultati ottenuti controllando il campo magnetico lungo la direzione del flusso dell'acqua su proattivi e reattivi shoaling zebrafish16 utilizzando la configurazione mostrata in Figura 2A (vedere la sezione 3 del protocollo). Questi risultati mostrano come il protocollo descritto può evidenziare le differenze nelle risposte al campo magnetico nei pesci con diverse personalità. Il concetto generale di questi studi si basa sulla constatazione che la direzione del campo magnetico rispetto al flusso di acqua influenza la soglia rheotactic in shoaling zebrafish14. Così, come cambiamenti nel campo magnetico modulare il rheotaxis, questo protocollo può essere usato per valutare se la risposta di zebrafish ai campi magnetici differiscono secondo la loro personalità proattivo o reattivo28.
In un primo momento, utilizzando il serbatoio/scura, come mostrato nella Figura 3, zebrafish sono stati suddivisi in diversi gruppi secondo la loro personalità proattiva/reattiva. A seguito di tale prova, banchi di cinque pesci con la stessa personalità quindi sono stati testati nella Galleria di nuoto del solenoide (Figura 1 e Figura 2A). Sono stati testati un totale di 20 pesci: due banchi composto di cinque pesci reattive (ogni 10 pesci reattive) e due banchi è composto da cinque pesci proattive (ogni 10 pesci proattive).
Uno shoal alla volta è stato video registrato mentre si nuota nel tunnel e l'acqua corrente è stata accelerata con un aumento graduale della portata come schematicamente mostrato in Figura 4. I pesci sono stati permessi di acclimatare per 1 h nel tunnel. Dopo di che, abbiamo applicato il protocollo per la quantificazione del comportamento rheotactic, con un aumento graduale della portata secondo il classico Brett protocollo25. In particolare, la portata aumentata di 0,4 BL/s ogni 10 min per un totale di sette passaggi consecutivi (Figura 4). Il comportamento di zebrafish è stato registrato tutta la durata della corsa nel tunnel (70 min), e il valore di RI ad ogni passo è stato calcolato (Vedi protocollo punto 6.8).
Durante l'esecuzione nella galleria del nuoto, il campo magnetico è stato fissato a una delle due condizioni seguenti: 50 μT a valle (cioè, la componente orizzontale [lungo l'asse x] del campo magnetico aveva la stessa direzione del flusso d'acqua) e 50 μT a Monte (cioè, il componente orizzontale del campo magnetico ha avuto una direzione opposta rispetto al flusso di acqua)16. L'intensità lungo gli assi y e z non sono stati colpiti, come pure l'intensità totale e l'inclinazione del vettore campo magnetico. Ogni banco di cinque pesci è stato esposto a una sola delle due condizioni magnetiche. Ad esempio, considerando proattiva pesce, uno shoal proattiva aveva il campo magnetico diretto a valle e altri Sika proattiva aveva campo magnetico diretto a Monte.
I video sono stati poi analizzati con il software di video-monitoraggio (sezione 6 del protocollo). I pesci erano dei video registrati per tutta la durata della corsa nel tunnel del nuoto. Tuttavia, sono stati registrati solo gli ultimi 5 minuti di ogni 10 min-lungo graduale aumento del tasso di flusso (Figura 4). Durante l'ora di revisione, sono stati evidenziati i giri di ogni pesce ad ogni portata (Figura 5, punti dati rosso e blu). Questi sono stati poi utilizzati come riferimenti per calcolare l'indice di rifrazione di ogni pesce e ogni velocità di flusso (Figura 5). L'indice di RI è compreso tra 0% e 100%. Quando sotto il 50%, l'indice di RI indica che il pesce visualizzato negativo rheotaxis (prevalenza di nuoto a valle); Quando il RI è superiore al 50%, Mostra che l'animale ha avuto una risposta positiva di rheotactic (prevalenza di nuoto a Monte). Un RI non significativamente differente da 50% indica un'assenza di risposta rheotactic. I valori di RI % di tutti i cinque pesci in una secca erano fatte la media poi ad ogni portata. Questi dati medi erano arcoseno trasformato e utilizzato per adattare le curve visualizzate in Figura 6A. Quindi, l'indice rheotactic sigmoidally aumenta quando la velocità dell'acqua aumenta, permettendo la quantificazione della rheotaxis con un semplice metodo matematico. Il rapporto tra il RI e la portata può essere montato al seguente modello logistico sigmoidale.
Tre parametri e la loro variabilità può essere derivati dalla curva. L'altopiano di RI misura la tendenza di massima degli animali per orientare a Monte nella gamma di velocità di flusso utilizzato nell'esperimento. RIbasso è il valore di RI in assenza di flusso d'acqua e, ipoteticamente, non dovrebbe differire da 50%. Rtr è la è la portata in cui si verifica la massima pendenza della curva, e può essere utilizzato come una misura della soglia rheotactic6.
I risultati indicano che la soglia di rheotactic (Rtr) di zebrafish è molto bassa, nell'intervallo di pochi centimetri al secondo. Variazioni del campo magnetico non influenzano la Rtr di pesce proattiva (nessun effetto del campo magnetico, t-test, P > 0.05). In modo opposto, cambiamenti di campo magnetico hanno un marcato effetto sul comportamento rheotactic di zebrafish reattiva. Quando la componente del campo magnetico lungo il tunnel di nuoto è stato diretto a valle, Rtr è molto bassa e simile a quello del pesce proattiva. La soglia era significativamente più alta quando il campo magnetico è stato diretto a Monte (t-test, P < 0.01).
Il valore delplateau di RI di animali reattivi era significativamente più basso quando il campo magnetico è stato diretto a Monte (t-test, P < 0.01). Questo risultato indica che con queste condizioni, reattiva pesce avrebbe raggiunto la risposta completa positiva rheotactic (RI = 100%) solo a portate molto elevate. Così, questo risultato evidenzia che, rispetto a Rtr, RIaltopiano fornisce meno informazioni sul comportamento di nuoto del pesce. In realtà, basata sulla forte differenza nel reattivo RIaltopiano fra le due circostanze magnetiche, possiamo affermare che, sotto il campo magnetico a Monte-oriented, gli animali reattivi probabilmente visualizzerà una risposta completa rheotactic a un'acqua superiore flusso.
I valori difondo di RI tendono ad essere più alto (anche se non significativamente) oltre il 50% negli animali proattivi e reattivi animali esposti ad un campo magnetico a valle-oriented. Ciò potrebbe indicare un bias nel protocollo poiché gli animali caratterizzati da una soglia molto bassa possono ricordare la direzione del flusso con esperienza durante l'acclimatazione. Un protocollo adeguato potrebbe essere messo a punto per verificare questa possibilità.
Figura 1: Rappresentazione semplificata di nuoto del tunnel apparato utilizzato nel presente studio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Programma di installazione per il controllo del campo magnetico. (A) Rendering del traforo del nuoto con un solenoide per l'induzione di un campo magnetico statico, orizzontale all'interno del tunnel. Il solenoide (0.83 giri/cm) è collegato a un'unità di alimentazione e genera campi nel range di ± 250 µT (gamma di intensità che include intervallo di campo magnetico terrestre). Sul lato destro, viene visualizzata una foto del tunnel solenoide collegato all'apparato di nuoto. Il tunnel è fatta di acrilico e ha due lastre acriliche perforati collocati presso l'ingresso dell'acqua, che garantiscono il flusso per essere vicino a laminare. (B) diagramma e foto delle tre coppie di Helmholtz ortogonale impostato per il controllo del campo magnetico nel campo geomagnetico di intensità. La sonda di campo magnetico, la CPU, il convertitore digitale-analogico e i driver della bobina utilizzati per chiudere il ciclo vengono anche visualizzati. Ogni accoppiamento delle bobine è composto da due bobine di circolare con un raggio (r) di 30 cm e N = 50 giri di AWG-14 fili in rame. Un magnetometro a tre assi (sensore) con scala selezionabile (± 88 µT a ± 810 µT) è posizionato vicino al centro del set della bobina. Gamma del sensore è impostata su valori che vanno a ±130 µT. Questi valori sono stati utilizzati anche per le misure descritte nei risultati rappresentativi (in queste condizioni, la risoluzione del sensore nominale è circa 0,1 µT). L'intensità e la direzione del campo magnetico sono controllati con un sistema di feedback digitale. Il sensore misura le tre componenti del vettore del campo magnetico (i tre assi), e i segnali di errore corrispondenti vengono estratti. Quindi, i segnali di correzione vengono generati da un semplice integratore del filtro. I segnali di correzione digitale vengono convertiti in tensione da un convertitore digitale-analogico e amplificati da un driver adatto della bobina. Questi ultimi segnali sono utilizzati per guidare le coppie di Helmholtz. La frequenza di campionamento è fissata a 5 Hz e la frequenza di guadagno di unità delle Anse è circa 0,16 Hz. Una volta impostate le correnti nelle coppie delle bobine di Helmholtz, il campo magnetico totale varia meno del 2% rispetto al valore di intensità media del volume cubico centrale (con bordo [L] = 10cm) delle bobine. Durante le misurazioni, il campo magnetico rms è inferiore a 0,2 µT. In entrambe le configurazioni (pannelli A e B) un campo elettrico statico è generato dalla corrente nelle bobine produce il campo magnetico16. L'intensità del campo elettrico è circa 0,4 V/m quando viene applicata la corrente massima; Questo valore è trascurabile rispetto ai campi statici naturali o artificiali presenti nell'ambiente in cui l'intensità è dell'ordine di 1 kV/m17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione schematica del serbatoio (40 x 40 cm x 40 cm) utilizzata per separare proattiva da individui di zebrafish reattive (non in scala), secondo Rey et al.21. Il volume del serbatoio di selezione di personalità è 50 che l. metà del serbatoio era occupata da una casella scura con un foro di 5 cm di diametro sul lato della scatola rivolto verso la metà luminosa del serbatoio. Il foro era coperto da una porta scorrevole (non mostrata), cui apertura firmato all'inizio di un processo di selezionando. Il lato oscuro del serbatoio ha bisogno di una copertura rimovibile per consentire l'accesso delle reti di mano. Questo facilita l'immissione o cattura pesce prima e dopo le prove comportamentali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Diagramma delle portate utilizzate durante le prove per determinare la soglia di rheotactic di zebrafish. Il flusso durante il periodo di acclimatazione di 1h era sufficiente a garantire un apporto di ossigeno adeguato agli animali. Si può presumere che, con questo disegno, rifornimento di ossigeno è mai un limite, anche nel primo passaggio 10 min con flusso 0. Infatti, con un tenore di ossigeno dell'acqua a 27 ° C di circa 7,9 mg/L e un consumo di ossigeno animale di 1 mg/h.g (un'approssimazione in eccesso per zebrafish consumo di ossigeno a bassa velocità nuoto sia in condizioni di routine [Uliano et al.29] [Palstra et altri30]), è possibile calcolare che, in assenza di flusso, il Po2 e il flume non diminuirà più del 2% per animale, rimanendo ben di sopra della critica Po2 (circa 40 torr per zebrafish). Questa figura è stata modificata da Cresci et al.14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Comportamento animale in tunnel e il calcolo del RI. I grafici presentano la posizione di un singolo animale lungo l'asse x durante un record s 300 a tre valori di portata. I punti rossi rappresentano le curve a valle-di-upstream, il blu punti le curve di tipo padre-figlio. Il corrispondente tempo gli intervalli spesi dagli animali a valle o a Monte sono anche riportati, e i tempi totali di upstream e downstream sono segnalati, da cui può essere calcolato un valore di RI. Si può osservare che quando si aumenta la portata, il tempo a Monte e aumentano i valori di RI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati rappresentativi. (A) rapporto tra valori di RI arcoseno-trasformate (RI è la percentuale del tempo totale orientato che pesce trascorrere rivolto verso Monte) e la portata per zebrafish shoaling proattivi e reattivi in due condizioni di campo magnetico lungo il flusso direzione del tasso (uno-dimensione controllo). Ogni punto di dati è la media dei valori di RI del cinque pesce che compongono la secca, ad ogni portata. Differenze significative tra le curve sono stata analizzate tramite una somma di quadrati F-prova (alfa = 0,05)14. Assi di campo magnetico (B) e la direzione dell'acqua il flusso nel tunnel. Viene mostrata anche una rappresentazione tridimensionale dei vettori magnetici nelle condizioni due campo magnetico utilizzate in questo studio. Il campo magnetico in laboratorio (40 ° N, 14 ° E) è: F = 62 μT; Io = 64°; D = 44°. Questa figura è stata modificata da Cresci et al.16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto in questo studio permette agli scienziati di quantificare le risposte di orientamento complesso di specie acquatiche derivanti dall'integrazione tra due indicazioni esterne (campo geomagnetico e corrente di acqua) e un fattore interno dell'animale, come personalità. Il concetto generale è quello di creare un disegno sperimentale che permette agli scienziati di separare gli individui di diverse personalità e studiare il loro comportamento di orientamento mentre controllando separatamente o simultaneamente gli stimoli ambientali esterni.
Il protocollo descritto in questo studio, insieme con la definizione matematica dell'indice rheotactic (RI), è stato progettato seguendo osservazioni preliminari del comportamento di zebrafish nel tunnel del nuoto. Quando sono immessi in un tunnel, questi animali visualizzano due tipi di modelli comportamentali, sia nell'assenza o nella presenza di acqua portata: orientato al nuoto e manovra. Trascorrono la maggior parte del tempo orientato (di solito, i pesci erano dei video registrati per oltre il 95% del tempo) nuotare lungo il tunnel (cioè, orientato lungo l'asse con un angolo inferiore a 45°), avanti e indietro, girando in prossimità delle pareti fine e spesso sh a causa della tigmotassia (cioè, nuoto a ridosso delle mura del tunnel)27.
Per questo protocollo avere successo, è importante che chi effettua l'esperimento presta attenzione allo stress degli animali. Il trasporto del pesce tra le messe a punto sperimentali deve essere eseguito con cura. L'utilizzo di reti di mano dovrebbe essere come veloce come possibile e qualche formazione prima l'esperimento vero e proprio è altamente raccomandato come zebrafish sono veloci nuotatori e difficile da catturare in un serbatoio. Lo stress può influenzare notevolmente il comportamento di questi animali, e nel caso di zebrafish, può significativamente cambiare loro nuoto comportamento27. Questo probabilmente potrebbe influenzare i risultati, come pesce potrebbe visualizzare il comportamento iperattivo ed essere meno sensibili ai cambiamenti di campo magnetico e flussi d'acqua. Contatto con gli animali nel setup sperimentale dovrebbe essere più rapido e breve possibile. L'analisi comportamentale richiede osservazione a distanza, che inoltre richiede pratica. Inoltre, è importante analizzare i video ciecamente (cioè, senza sapere di protocolli e trattamenti).
Il comportamento rheotactic di molte specie di pesci è stato studiato utilizzando nuoto tunnel5,10,11,31. Numerosi studi precedenti concentrati sulla stima della velocità di nuoto che il pesce può sostenere fino ad esaurimento, che è definita come Ucrit, principalmente per testare ipotesi fisiologiche ed ecologiche11,32, 33. il metodo descritto in questo studio si concentra, invece, il comportamento rheotactic a velocità di flusso debole. Questa scelta è stata fatta perché l'obiettivo di questo studio è di valutare la sensibilità a cue sottile e debole come il campo magnetico attraverso l'osservazione di un comportamento ben noto e affidabile orientamento di pesce, il rheotaxis positivo. Nei risultati rappresentativi riportati qui, zebrafish visualizzata una soglia molto bassa di rheotactic (pochi centimetri al secondo). Questa osservazione potrebbe essere ecologicamente rilevante per questa specie, che vive in ambienti dove la velocità delle correnti d'acqua significativamente può variare. Zebrafish vivono in fiumi turbolenti34 e nei corpi idrici dove l'acqua si muove lentamente, come risaie, stagni e zone golenali35. Quando l'acqua si muove lentamente, la capacità di rilevare e orientare a velocità di flusso debole (una soglia bassa rheotactic) potrebbe essere vantaggiosa, come la risposta rheotactic aumenta le probabilità di intercettare a valle-drifting preda36 e fornisce direzionali stimoli per migrazione37.
Queste osservazioni non avrebbe potute essere utilizzando flussi con i tassi alti. Questi sarebbe suscitare una forte risposta motorio che dipenderebbe più sulle condizioni di corpo e piscina ad alta performance degli animali piuttosto che indicazioni esterne come il campo magnetico. Il protocollo presentato qui è stato applicato su zebrafish, ma è probabile adatto a qualsiasi specie d'acqua dolce o marine che popolano gli ambienti con lo spostamento d'acqua e possono essere gestite in condizioni di laboratorio.
Tuttavia, questo protocollo presenta alcune limitazioni. Mentre si evidenzia chiaramente se una specie è sensibile o visualizzazione ai campi magnetici, essa non può rivelare i meccanismi di orientamento attraverso il quale l'animale utilizza campi magnetici per le decisioni di movimento. Al fine di indagare i meccanismi di orientamento magnetico nelle specie acquatiche, configurazioni con arene circolari e ancora acqua7,38,39 o labirinti13 sono comunemente usati. Tuttavia, pesce (e animali acquatici in generale) non vivono in ambienti dove le correnti sono assenti, e il metodo proposto è un primo tentativo di indagare la risposta comportamentale integrativa ai segnali direzionali onnipresente, come l'acqua scorre e magnetico campi. Un'altra limitazione di questo protocollo è la procedura di rilevamento video manuale. Integrare il programma di installazione con un software di tracking automatico migliorerebbe la tempistica del processo di analisi di dati interi.
Il protocollo sperimentale qui presentato è il primo progettato per studiare l'influenza della personalità degli animali sulla sensibilità magnetica e rheotaxis. Questo argomento è stato trascurato nella letteratura e ha bisogno di essere ulteriormente esplorato. Individui della stessa specie, o anche all'interno di una popolazione o un piccolo gruppo (ad esempio un banco di pesci), sono caratterizzati da diverse personalità tratti22,40, che può essere un fattore importante negli studi sui migratori, esplorativo, navigazione e il comportamento di orientamento. Non tutti gli individui si integrano gli stimoli ambientali nello stesso modo. Così, tenendo conto dei fattori interni, quali personalità, potrebbe contribuire a ridurre la variabilità di dati che è comunemente osservata negli studi sul movimento ecologia16.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto da Fondazione ricerca base del dipartimento di fisica e il dipartimento di biologia dell'Università Napoli Federico II. Gli autori ringraziano il Dr. Claudia Angelini (Istituto di applicata calcolo, Consiglio Nazionale delle Ricerche [CNR], Italia) per il supporto statistico. Gli autori ringraziano Martina Scanu e Silvia Frassinet per il loro aiuto tecnico con la raccolta dei dati e i tecnici dipartimentali F. Cassese, Passeggio di G. e R. Rocco per la loro assistenza abile nella progettazione e realizzazione dell'apparato sperimentale. Ringraziamo Laura Gentile per aiutare a condurre l'esperimento durante le riprese video. Ringraziamo Diana Rose Udel presso l'Università di Miami per le riprese le dichiarazioni di intervista di Alessandro Cresci.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9500 G meter | FWBell | N/A | Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT |
| AD5755-1 | Analog Devices | EVAL-AD5755SDZ | Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter |
| ALR3003D | ELC | 3760244880031 | DC Double Regulated power supply |
| BeagleBone Black | Beagleboard.org | N/A | Single Board Computer |
| Coil driver | Home made | N/A | Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI) |
| Helmholtz pairs | Home made | N/A | Coils made with standard AWG-14 wire |
| HMC588L | Honeywell | 900405 Rev E | Digital three-axis magnetometer |
| MO99-2506 | FWBell | 129966 | Single axis magnetic probe |
| Swimming apparatus | M2M Engineering Custom Scientific Equipment | N/A | Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback |
| TECO 278 | TECO | N/A | Thermo-cryostat |
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