Summary
Se describe un protocolo de comportamiento diseñado para evaluar cómo influyen en su respuesta al agua corrientes y campos magnéticos débiles personalidades de pez cebra. Peces con los mismo personajes se separan en base a su comportamiento exploratorio. Luego, se observa su comportamiento de orientación rheotactic en un túnel de natación con un bajo caudal y bajo diferentes condiciones magnéticas.
Abstract
Para orientarse en su entorno, animales integran una amplia gama de estímulos externos, que interactúan con factores internos, como personalidad. Aquí, describimos un comportamiento protocolo diseñado para el estudio de la influencia de la personalidad de pez cebra en su respuesta de orientación a múltiples señales ambientales externos, específicamente las corrientes de agua y los campos magnéticos. Este protocolo intenta comprender si es proactiva o reactiva pez cebra Mostrar diferentes umbrales rheotactic (es decir, la velocidad del flujo en que el pescado comienza nadando contra la corriente) cuando el campo magnético circundante cambia su dirección. Para identificar el pez cebra con la misma personalidad, peces se introducen en la oscuridad de la mitad de un tanque conectada con una abertura estrecha a la mitad brillante. Sólo proactiva peces exploran la novela, brillante del ambiente. Pescado reactiva no salga la mitad oscura del tanque. Un túnel de natación con caudales bajos se utiliza para determinar el umbral de rheotactic. Se describen dos configuraciones para controlar el campo magnético en el túnel, en el rango de intensidad del campo magnético de la tierra: uno que controla el campo magnético a lo largo de la dirección del flujo (una dimensión) y que permite un control de tres axial del campo magnético. Pescado se filman mientras se experimentan un aumento gradual de la velocidad del flujo en el túnel bajo campos magnéticos diferentes. Datos sobre el comportamiento de orientación son recogidos a través de un procedimiento de seguimiento de video y aplicados a un modelo logístico para permitir la determinación del umbral rheotactic. Divulgamos resultados representativos de shoaling pez cebra. Específicamente, estos demuestran que pescado sólo reactiva, prudente Mostrar variaciones del umbral rheotactic cuando el campo magnético varía en su dirección, mientras que peces proactiva no responden a los cambios del campo magnético. Esta metodología puede aplicarse al estudio de la sensibilidad magnética y rheotactic comportamiento de muchas especies acuáticas, tanto mostrando a solitario o shoaling estrategias de natación.
Introduction
En el presente estudio, se describe un protocolo de comportamiento basado en el laboratorio que tiene el objetivo de investigar el papel de la personalidad de pescado en la respuesta de orientación de shoaling pescado a las señales de orientación externos, tales como campos magnéticos y corrientes de agua.
Las decisiones de orientación de los animales resultan de peso de diversas informaciones sensoriales. El proceso de decisión está influenciado por la capacidad del animal para navegar (por ejemplo, la capacidad para seleccionar y mantener una dirección), su estado interno (por ejemplo, necesidades de alimentación o reproducción), su capacidad de movimiento (e.g., biomecánica de la locomoción) y varios adicionales Factores externos (por ejemplo, hora del día, interacción con sus congéneres)1.
El papel del estado interno o animal personalidad en el comportamiento de la orientación es a menudo mal entendido o no explora2. Problemas adicionales surgen en el estudio de la orientación de especies acuáticas sociales, que a menudo realizan coordinada y polarizaron grupo movimiento comportamiento3.
Las corrientes de agua juegan un papel clave en el proceso de orientación de los peces. Pescado orientar las corrientes a través de una respuesta de unconditioned llamado rheotaxis4, que puede ser positivo (es decir, contra la corriente orientada) o negativo (es decir, aguas abajo orientado) de agua y se utiliza para diversas actividades, que van desde la alimentación a la minimización de gasto energético5,6. Por otra parte, un creciente cuerpo de literatura informes de que muchas especies utilizan el campo geomagnético para orientación y navegación7,8,9.
El estudio de rendimiento rheotaxis y natación en los peces se realiza en cámaras de flujo (flujo), donde peces están expuestos al progresivo aumento de la velocidad del flujo, de bajas a altas velocidades, a menudo hasta el agotamiento (llamada velocidad crítica)10, 11. Por otra parte, estudios previos investigaron el papel del campo magnético en la orientación a través de la observación del comportamiento de la natación de los animales en arenas con agua12,13. Aquí, describimos una técnica de laboratorio que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de los peces mientras manipula las corrientes de agua y el campo magnético. Este método fue utilizado por primera vez el shoaling pez cebra (Danio rerio) en nuestro estudio anterior, lleva a la conclusión de que la manipulación del campo magnético circundante determina el umbral de rheotactic (es decir, la mínima velocidad del agua en que shoaling pescado Oriente aguas arriba)14. Este método se basa en el uso de una cámara de canal con flujo lento combinado con una instalación diseñada para controlar el campo magnético en el canal, dentro de la gama de la intensidad del campo magnético de la tierra.
El túnel de natación utilizado para observar el comportamiento del pez cebra se describe en la figura 1. El túnel (hecho de un cilindro de acrílico de nonreflecting con un diámetro de 7 cm y 15 cm de longitud) está conectado a una instalación para el control de la tasa de flujo14. Con esta configuración, el rango de caudales en el túnel varía entre 0 y 9 cm/s.
Para manipular el campo magnético en el túnel de natación, utilizamos dos enfoques metodológicos: el primero es unidimensional y la segunda es tridimensional. Para cualquier uso, estos métodos de manipulan el campo geomagnético para obtener condiciones magnéticas en un volumen definido de agua, por lo tanto, todos los valores de intensidad del campo magnético en este estudio incluyen el campo geomagnético.
En cuanto a la unidimensional enfoque15, el campo magnético se manipula a lo largo de la dirección del flujo de agua (definida como el eje x) usando un solenoide envuelto alrededor del túnel de la natación. Esto está conectada a una unidad de potencia y genera campos magnéticos estáticos uniforme (figura 2A). Del mismo modo, en el caso del enfoque tridimensional, el campo geomagnético en el volumen que contiene el túnel de natación se modifica usando bobinas de los cables eléctricos. Sin embargo, para controlar el campo magnético en tres dimensiones, las bobinas tienen el diseño de tres pares de Helmholtz ortogonales (figura 2B). Cada par de Helmholtz está compuesto por dos bobinas circulares orientadas a lo largo de las tres direcciones del espacio ortogonal (x, yy z) y equipado con un magnetómetro de tres axial en condiciones de circuito cerrado. El magnetómetro trabaja con intensidades de campo comparables con campo natural de la tierra, y está situado cerca del centro geométrico del conjunto de bobinas (donde se encuentra el túnel de natación).
Implementamos las técnicas descritas anteriormente para probar la hipótesis que los rasgos de personalidad de los peces que componen un banco influyen en la manera que responden a campos magnéticos16. Probamos la hipótesis de que los individuos con personalidad proactiva y reactiva17,18 responden de manera diferente cuando se expone a corrientes y campos magnéticos. Para probar esto, clasificamos primero pez cebra utilizando una metodología establecida para asignar y grupo de individuos que son proactivos o reactivos17,19,20,21. Luego, evaluamos el comportamiento rheotactic del pez cebra nadan en cardúmenes compuesto por sólo reactivos individuos o compuesto de sólo individuos proactivos en el tanque de arrastre magnético, que presentamos como datos de la muestra.
El método de ordenación se basa en la diferente tendencia de las personas proactivas y reactivas para explorar nuevos ambientes21. En concreto, utilizamos un tanque dividido en un brillante y un lado oscuro17,19,20,21 (figura 3). Animales son aclimatados al lado oscuro. Cuando acceso al lado brillante es abierta, proactivo individuos tienden a salir rápidamente de la mitad oscura del tanque para explorar el nuevo entorno, mientras que el reactivo pescado no deje el tanque oscuro.
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Protocol
El siguiente protocolo ha sido aprobado por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso del Universidad de Nápoles Federico II, Nápoles, Italia (2015).
1. animal mantenimiento
- Utilizar tanques de al menos 200 L a sede de un banco de por lo menos 50 individuos de ambos sexos en cada tanque.
Nota: La densidad de los peces en el tanque tiene que ser un animal por cada 2 litros o menos. Bajo estas condiciones, el pez cebra mostrará comportamiento shoaling normal. - Establecer las condiciones de mantenimiento como sigue: temperatura 27 – 28 º C; conductividad en < 500 μS; pH 6.5-7.5; NO3 en < 0,25 mg/L; y un fotoperíodo de luz: oscuridad a las 10 h de h:14.
Nota: Explotación idénticas condiciones deben usarse para la población mixta y las poblaciones separadas de proactivas y reactivas.
2. personalidad selección en pez cebra
- Preparar y colocar el depósito de selección de personalidad en una habitación tranquila (figura 3) con la misma agua utilizada en los tanques de mantenimiento.
- Coloque una cámara de video, encima o al lado del tanque. Conecte la cámara a un ordenador con un monitor ubicado en una zona donde no haya contacto visual con el tanque.
- Nueve seleccionados al azar de peces del tanque de mantenimiento y transferirlos al lado oscuro del tanque de selección de personalidad, con una red sin nudos.
Nota: Tratar de limitar las interacciones con los tanques y los peces a la menor cantidad de tiempo posible. Evitar ruidos y movimientos rápidos. Si es necesario, los animales en un pequeño volumen de transporte de tanque (aprox. 2 L) de agua desde el depósito de la transferencia. Para evitar la exposición al aire de los animales, utilizar un vaso de precipitados de 250 ml y suavemente inducir al animal a entrar en el vaso. Trate de minimizar el tiempo de captura, evitar que recogían los pescados múltiples ya que puede causar daño físico a los animales y no retener a los peces durante más de unos segundos en la red como estos factores pueden aumentar el estrés. Peces deben ser alimentados ad libitum antes de la transferencia al tanque experimental. Esto limita la posibilidad de que diversas tendencias de comportamiento de búsqueda de alimentos afectaría el comportamiento de los individuos durante el siguiente experimento22. Realizar experimentos repetidos en el mismo momento del día. Esto reduce al mínimo la variabilidad en el comportamiento de los grupos experimentales causadas por posibles ritmos circadianos23. - Después de 1 h de aclimatación, abrir la puerta corredera.
Nota: Individuos que salen del agujero, explorando el lado brillante del tanque dentro de 10 min, se consideran proactivo21. - Después de 10 minutos, suavemente saque a las personas proactiva del depósito y transferencia para el depósito de mantenimiento proactivo.
- Después de 15 minutos, recoger los peces que permanecen en la caja oscura, que se consideran reactivos21y transferirlos al tanque de mantenimiento reactivo.
Nota: Deseche los peces que se mueven hacia el lado brillante del tanque después de 10 min21. Realizar el test de personalidad con nueve peces hasta que se recoge el número de peces proactivas y reactivas necesarias para los ensayos descritos en la sección 5. Consistencia de la personalidad proactiva y reactiva puede comprobarse usando el mismo enfoque.
3. Configure el campo magnético con la manipulación de campo magnético unidimensional27
- Encienda la unidad de potencia (figura 2A).
- Coloque el túnel en espiral en el lugar donde será el protocolo de rheotactic realizada (sección 5) pero mantener desconectado de los aparatos de la piscina (figura 2A). Coloque una sonda magnética conectada con un Gauss/Teslameter dentro del túnel y verificar que voltaje es necesario para obtener el valor del campo magnético longitudinal del túnel.
Nota: Debido a las propiedades magnéticas de un solenoide, el campo es bastante uniforme dentro del túnel; Esto puede comprobarse moviendo lentamente la sonda tanto horizontal como verticalmente. - Desconectar la sonda y conectar el túnel de flujo para el aparato de la natación.
- Comience con el protocolo rheotactic (sección 5).
4. ajustar el campo magnético con el campo magnético tridimensional manipulación27
- Encienda la CPU, DAC y conductores de la bobina (figura 2B).
- Establecer el campo magnético sobre cada uno de los tres ejes (x, y y z).
- Lugar el túnel en el centro del conjunto de pares de Helmholtz.
- Comience con el protocolo rheotactic (sección 5).
5. prueba de los Rheotaxis de pez cebra en la cámara de flujo
- Transferencia de peces de uno a cinco para el túnel de flujo con un depósito de 2 L con los lados y el fondo oscurecido.
- Encienda la bomba y la velocidad de flujo en el túnel a 1.7 cm/s.
Nota: Esta agua de lento-mudanza mantendrá el agua en el túnel de oxigenada y facilitará la recuperación de animales. - Deje que los animales aclimatarse al túnel de nadar durante 1 hora.
- Iniciar la grabación de vídeo del comportamiento de los peces en el túnel.
Nota: Se utilizó una cámara (por ejemplo, acción de Yi 4K) con control remoto (por ejemplo, Bluetooth) y había guarda el video en .mpg (30 fotogramas/s). - Iniciar el aumento gradual de la velocidad de flujo según el protocolo experimental solicitada (1,3 cm/s en este estudio; Figura 4).
Nota: De este protocolo, se utilizaron tasas de flujo bajo que, para el pez cebra, van desde 0 hasta 2,8 BL (longitud de cuerpo) / s. Estas velocidades de flujo son en la gama más baja de las tasas de flujo que inducen natación continua orientada en el pez cebra (3 – 15% de la velocidad crítica de natación [Ucrit])24. La utilización de bajos caudales (protocolo25) de Brett siguiente está ligada a las características de comportamiento específicas de esta especie en presencia de corrientes de agua. Pez cebra tienden a nadar a lo largo del eje mayor de la cámara, girando con frecuencia, incluso en presencia de flujo de agua y tienden a nadar por aguas arriba y aguas abajo24,26. Este comportamiento se ve afectado por la tasa de flujo de agua, desapareciendo a velocidades relativamente altas (> 8 BL/s)26, cuando los animales continuamente nadan hacia aguas arriba (respuesta completa positiva rheotactic). Desplazamientos verticales y transversales son muy raros. -
Realizar morfometría de los animales (sexo y total Longitud [TL], longitud de horquilla [FL] o BL) sobre imágenes de peces en una cámara morfométricos.
- Seleccionar la imagen adecuada.
- Abra la imagen en ImageJ.
- Tomar nota del sexo del animal (hombre pez cebra son delgada y tienden a ser amarillentas, mientras que las hembras son más redondas y tienden a tener colorantes azules y blancos).
- Haga clic en Analyze > Set escala y sistema de la escala de la imagen en centímetros, utilizando la longitud entera horizontal del túnel como referencia.
- Haga clic en analizar > mida y anote la longitud del animal.
- Calcular su peso corporal (BW).
Nota: BW se calcula de las relaciones sexo-FL-BW previamente construidas en el laboratorio o de metadatos. Todo el procedimiento evita el estrés de la manipulación de los animales.
6. vídeo de seguimiento
- Abra el archivo de vídeo con Tracker 4.84 Video herramienta de análisis y modelado.
Nota: Si es necesario, corregir cualquier distorsión de video usando perspectiva y distorsión radial ser. - Haga clic en sistema de coordenadas en el menú superior y definir las unidades de longitud en centímetros y las unidades de tiempo a segundos.
- Haga clic en archivo > importar > vídeo y abierto uno de los vídeos de Tracker 4.84.
- Haga clic en "Ejes de coordenadas" y el sistema de referencia para seguir la posición de los peces en el tiempo, con el eje x a lo largo del túnel. Establecer el origen en la esquina baja de las aguas abajo terminando la pared (a la salidadel agua).
- Haga clic en pista > nuevo > punto de masa y seguimiento un pez en un momento de inicio. Seguimiento de lo últimos 5 min de cada paso que el pescado a cada velocidad de flujo.
- Adelantar el video manualmente en el marco de cinco intervalos (0.5 s) y marca el tiempo y la posición del animal en cada vuelta ascendente descendente (UDt, puntos rojos en la figura 5) y en cada vuelta downstream upstream (DUt; puntos azules en la figura 5).
Nota: Utilice la posición del ojo peces como referencia para la posición de los peces. Seguimiento de la posición del animal con una masa del punto. Impedir el seguimiento de cualquier período de natación no orientado (es decir, tiempo de maniobrando). - Al final de cada sesión de seguimiento, seleccione los valores de x y tiempo valores de la tabla en la esquina inferior derecha de la ventana del software. Haga clic en los datos y haga clic en copiar datos > precisión.
- Guardar los valores de tiempo y valores de x de todas las posiciones de giro en un archivo de plantilla de hoja de cálculo para calcular el tiempo contra la corriente total (suma de todos los intervalos entre UDT y conducto) y el tiempo total (suma de los intervalos entre el conducto y UDt) que aguas abajo, así como los valores del índice rheotactic en porcentajes (% de RI) para cada flujo de paso (ver figura 5).
Nota: El comportamiento rheotactic se cuantifica por el porcentaje del tiempo total orientada a que los peces hacia aguas arriba (natación o congelación raramente [es decir, permanecen todavía en la parte inferior del túnel]27). Esta proporción se define como el % de RI (figura 5).
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Representative Results
Como datos de ejemplo presentamos resultados de controlar el campo magnético a lo largo de la dirección del flujo de agua en proactivas y reactivas shoaling pez cebra16 utilizando la configuración que se muestra en la figura 2A (ver artículo 3 del Protocolo). Estos resultados muestran cómo el protocolo descrito puede resaltar las diferencias en las respuestas al campo magnético en los peces con diferentes personalidades. El concepto general de estos ensayos se basa en el hallazgo de que la dirección del campo magnético en relación con el flujo de agua afecta el umbral rheotactic en shoaling pez cebra14. Así, como cambios en el campo magnético modular los rheotaxis, este protocolo puede utilizarse para evaluar si la respuesta del pez cebra a los campos magnéticos son diferentes según su personalidad proactiva o reactiva28.
Al principio, con el depósito oscuro/brillante como se muestra en la figura 3, pez cebra se dividieron en diferentes grupos según su personalidad proactiva/reactiva. Después de tal prueba, cardúmenes de cinco peces con la misma personalidad entonces fueron probados en el túnel de natación del solenoide ( figura 2Ayfigura 1 ). Se analizaron un total de 20 peces: dos bancos compuesta de cinco peces reactivas cada (10 peces reactivas) y dos bancos compuesta de cinco peces proactiva cada (10 peces proactivos).
Un banco en un momento fue video grabado mientras nadas en el túnel y la corriente de agua fue acelerada con un progresivo aumento de la tasa de flujo como esquemáticamente se muestra en la figura 4. Los peces podían aclimatar durante 1 h en el túnel. Después de eso, se aplicó el protocolo para la cuantificación del comportamiento rheotactic, con un aumento progresivo de la velocidad de flujo según el clásico Brett protocolo25. En concreto, la tasa de flujo aumentaron 0,4 BL/s cada 10 minutos para un total de siete pasos consecutivos (figura 4). El comportamiento del pez cebra se registró a lo largo de toda la duración de la carrera en el túnel (min 70), y se calculó el valor de RI en cada paso (ver protocolo paso 6.8).
Durante los funcionamientos en el túnel de la natación, el campo magnético se ha fijado en una de las dos condiciones siguientes: 50 μT aguas abajo (es decir, la componente horizontal [en el eje x] del campo magnético tenía la misma dirección del flujo de agua) y 50 μT aguas arriba (es decir, la componente horizontal del campo magnético tenía una dirección opuesta respecto a los flujos de agua)16. La intensidad a lo largo de los ejes y y z no se vieron afectados, así como la intensidad total y la inclinación del vector de campo magnético. Cada banco de cinco peces fue expuesto a una de las dos condiciones magnéticas. Por ejemplo, considerando peces proactiva, un banco proactivo tenía el campo magnético dirigido aguas abajo y el otro banco proactivo tenía el campo magnético dirigido aguas arriba.
Luego se analizaron los videos con el software de seguimiento de video (artículo 6 del Protocolo). Los peces fueron videos grabados para toda la duración de la carrera en el túnel de la natación. Sin embargo, sólo lo últimos 5 min de cada aumento de manera gradual 10 min de duración del caudal (figura 4) fueron seguidos. Durante el tiempo de seguimiento, se destacaron las vueltas de cada pescado a cada velocidad de flujo (figura 5, puntos rojos y azules). Éstos entonces fueron utilizados como referencia para calcular la RI de cada pez y cada velocidad de flujo (figura 5). El índice RI oscila entre 0% y 100%. Cuando menos del 50%, el índice RI indica que los peces muestran rheotaxis negativos (prevalencia de nadar aguas abajo); Cuando la RI es superior al 50%, muestra que el animal tenía una respuesta positiva rheotactic (prevalencia de nadar contra la corriente). Una RI no significativamente diferente del 50% indicaría una ausencia de respuesta rheotactic. Luego fueron un promedio de los valores de RI % de todos los cinco peces en un banco a cada velocidad de flujo. Estos datos promedio fueron arcoseno transformado y utilizado para adaptarse a las curvas mostradas en la figura 6A. Así, el índice rheotactic sigmoidally aumenta cuando aumenta la velocidad del agua, permitiendo la cuantificación de los rheotaxis con un método matemático simple. La relación entre la RI y la tasa de flujo puede montarse en el siguiente modelo logístico sigmoidal.
Tres parámetros y su variabilidad se pueden derivar la curva de ajuste. La RImeseta mide la máxima tendencia de los animales a Oriente aguas arriba en la gama de caudales utilizados en el experimento. RIinferior es el valor de RI en la ausencia de flujo de agua y, hipotéticamente, no debe diferenciarse del 50%. Rtr es la es la velocidad del flujo en que se produce la máxima pendiente de la curva, y puede ser utilizado como una medida del umbral rheotactic6.
Los resultados indican que el umbral de rheotactic (Rtr) de pez cebra es muy bajo, en el rango de unos pocos centímetros por segundo. Variaciones del campo magnético no afecta Rtr de peces proactiva (ningún efecto del campo magnético, t-test, P > 0.05). Opuesto, cambios de campo magnético tienen un efecto pronunciado sobre el comportamiento rheotactic del pez cebra reactiva. Cuando el componente del campo magnético a lo largo del túnel de natación se dirige aguas abajo, el Rtr es muy baja y similar a la de peces proactiva. El umbral fue significativamente mayor cuando el campo magnético se dirige aguas arriba (t-test, P < 0.01).
El valor de lameseta de RI de animales reactivos fue significativamente menor cuando el campo magnético se dirige aguas arriba (t-test, P < 0.01). Este resultado indica que con estas condiciones, pescado reactiva alcanzaría la plena positiva respuesta rheotactic (RI = 100%) sólo a velocidades de flujo muy alta. Por lo tanto, este resultado pone de relieve que, en comparación con Rtr, RImeseta proporciona menos información sobre el comportamiento de la natación de los peces. De hecho, basado en la fuerte diferencia en el reactivo RImeseta entre las dos condiciones magnéticas, podemos afirmar que, bajo el campo magnético orientado por aguas arriba, los animales reactivos probablemente mostrará una respuesta completa rheotactic en un agua más alta flujo.
Valores de RIinferior tienden a ser más alto (aunque no significativamente) que el 50% en los animales proactivos y el reactivos animales expuestos a un campo magnético orientado a aguas abajo. Esto puede indicar un sesgo en el protocolo, puesto que los animales que se caracterizan por un umbral muy bajo pueden recordar la dirección de flujo experimentada durante la aclimatación. Un protocolo adecuado podría ser ideado para poner a prueba esta posibilidad.
Figura 1: Aparatos utilizados en el presente estudio del túnel de representación simplificado de la natación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de campo magnético control. (A) representación del túnel de natación con un solenoide para la inducción de un campo magnético estático, horizontal dentro del túnel. El solenoide (0.83 vueltas/cm) está conectado a una unidad de potencia y genera campos en la gama de ±250 μT (rango de intensidad que incluye gama de campo magnético de la tierra). A la derecha, se muestra una foto del túnel de solenoide conectada al aparato de natación. El túnel se hace del acrílico y tiene placas acrílico perforadas dos, colocadas en la entrada de agua, que garantizan el flujo para estar cerca de laminar. (B) diagrama y Foto de los tres pares de Helmholtz ortogonales establecen para el control del campo magnético en la gama geomagnética de intensidades. Se muestran también la sonda de campo magnético, la CPU, el convertidor de digital a analógico y los controladores de bobina utilizados para cerrar el ciclo. Cada par de bobinas está compuesto por dos bobinas circulares con un radio (r) de 30 cm y N = 50 vueltas de 14 AWG de alambres de cobre. Un magnetómetro de tres ejes (sensores) con escala seleccionable (μT 88 ± a ± 810 μT) está situado cerca del centro del conjunto de la bobina. La gama del sensor se ajusta a valores que van a ±130 μT. Estos valores también fueron utilizados para las mediciones descritas en los resultados representativos (en estas condiciones, la resolución del sensor nominal es de 0,1 μT). La intensidad y la dirección del campo magnético son controlados con un sistema de retroalimentación digital. El sensor mide los tres componentes del vector campo magnético (los tres ejes), y se extraen las señales de error correspondientes. Entonces, las señales de corrección son generadas por un filtro integrador simple. Las señales de corrección digital convertidas a voltaje por un convertidor de digital a analógico y amplificadas por un conductor de la bobina adecuada. Estas últimas señales se utilizan para conducir los pares de Helmholtz. La frecuencia de muestreo es fijo a 5 Hz y la frecuencia de ganancia unidad de los lazos es de unos 0,16 Hz. Una vez establecidas las corrientes en los pares de las bobinas de Helmholtz, el campo magnético total varía menos del 2% de su valor de intensidad media en el volumen cúbico central (con borde [L] = 10 cm) de las bobinas. Durante las mediciones, el rms de campo magnético es menos de 0,2 μT. En tanto las configuraciones (paneles A y B) se genera un campo eléctrico estático por la corriente en las bobinas que producen el campo magnético de16. La intensidad del campo eléctrico es aproximadamente 0.4 V/m cuando se aplica la corriente máxima; Este valor es insignificante en comparación con los campos estáticos naturales o artificiales presentes en el ambiente cuya intensidad es del orden de 1 kV/m17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representación esquemática del tanque (40 cm x 40 cm x 40 cm) para separar proactiva de pez cebra reactiva individuos (no a escala), según Rey et al.21. El volumen del tanque de selección de personalidad es de 50 que l. mitad del tanque fue ocupado por una caja oscura con un agujero de 5 cm de diámetro en el lado de la caja hacia la mitad brillante del tanque. El agujero estaba cubierto por una puerta corredera (no mostrada), cuya apertura había firmado el inicio de un proceso de selección. El lado oscuro del tanque tiene una funda extraíble para permitir el acceso de redes de mano. Esto facilita la colocación o captura peces antes y después de los ensayos de comportamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diagrama de los caudales utilizados durante los ensayos para determinar el umbral rheotactic del pez cebra. El flujo durante el período de aclimatación de 1 h fue suficiente para garantizar un suministro de oxígeno adecuado a los animales. Se puede suponer que, con este diseño, el suministro de oxígeno no es un límite, incluso en el primer paso de 10 minutos con flujo 0. De hecho, con un contenido de oxígeno del agua a 27 ° C de aproximadamente 7,9 mg/L y un consumo de oxígeno del animal de 1 mg/h.g (una aproximación exceso de consumo de oxígeno del pez cebra en condiciones rutinarias [Uliano et al29] y en la natación lenta [Palstra et otros30]), es posible calcular que, en ausencia de flujo, la Po2 en el canal no disminuirá más del 2% por animal, queda muy por encima de la crítica Po2 (cerca de 40 torr de pez cebra). Esta figura ha sido modificada desde Cresci et al14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Comportamiento de los animales en el túnel y el cálculo de los RI. Los gráficos presentan la posición de un animal individual a lo largo del eje x en un expediente s 300 en tres valores de velocidad de flujo. Los puntos rojos representan las vueltas aguas abajo para aguas arriba, el azul puntea las vueltas aguas arriba a aguas abajo. El correspondiente tiempo intervalos pasados por los animales río abajo o río arriba también se divulgan y se reportan los tiempos totales de aguas arriba y aguas abajo, de que se puede calcular un valor de RI. Puede observarse al aumentar el caudal, el tiempo arriba y aumentan los valores de RI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Resultados representativos. (A) relación entre valores transformados por arcoseno de RI (RI es el porcentaje del tiempo total orientado que peces pasan hacia arriba) y el caudal de pez cebra shoaling proactiva y reactiva en dos condiciones de campo magnético a lo largo de la corriente Dirección de velocidad (control de dimensión uno). Cada punto de datos es el promedio de los valores de RI de los cinco peces componen el Banco, a cada velocidad de flujo. Diferencias significativas entre las curvas fueron probadas mediante una suma de cuadrados F-prueba (alpha = 0.05)14. Hachas de campo magnético (B) y la dirección del agua del flujo en el túnel. También se muestra una representación tridimensional de los vectores magnéticos en las condiciones de dos campo magnético utilizados en este estudio. El campo magnético en el laboratorio (40 ° N, 14 ° E) es: F = 62 μT; I = 64°; D = 44°. Esta figura ha sido modificada desde Cresci et al16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito en este estudio permite a los científicos a cuantificar las respuestas de orientación complejo de especies acuáticas resultante de la integración entre dos señales externas (agua corriente y geomagnético campo) y uno de los factores interno del animal, tales como personalidad. El concepto general es crear un diseño experimental que permite a los científicos separar a individuos de personalidad diferente e investigar su comportamiento de orientación mientras que controlar por separado o simultáneamente las señales ambientales externas.
El protocolo descrito en este estudio, junto con la definición matemática del índice rheotactic (RI), fue diseñado siguiendo observaciones preliminares del comportamiento del pez cebra en el túnel de la natación. Cuando se coloca en un túnel, estos animales mostrar dos tipos de patrones de comportamiento, tanto en la ausencia o presencia de flujo de agua: orientada a natación y maniobras. Pasan la mayoría del tiempo orientado (por lo general, los peces fueron videos grabados para más del 95% del tiempo) a lo largo del túnel (es decir, orientadas a lo largo del eje con un ángulo inferior a 45°), hacia adelante y hacia atrás, girando en la proximidad de las paredes laterales y a menudo sh debido thigmotaxis (es decir, nadar cerca de las paredes del túnel)27.
Este protocolo tenga éxito, es importante que quien realiza la experiencia presta atención al estrés de los animales. El transporte de los peces entre las configuraciones experimentales debe ser ejecutado con cuidado. El uso de redes de mano debe ser tan rápido como sea posible y algunos de formación antes de que la experimento real es muy recomendable como pez cebra son nadadores rápidos y difíciles de atrapar en un tanque. El estrés puede afectar considerablemente el comportamiento de estos animales, y en el caso del pez cebra, puede cambiar significativamente su natación comportamiento27. Esto probablemente afectaría a los resultados, como peces pueden mostrar comportamiento hiperactivo y ser menos sensibles a los flujos de agua y cambios de campo magnético. Contacto con los animales en la configuración experimental debe ser tan rápida y corta como sea posible. El análisis del comportamiento requiere observación remota, que también requiere práctica. Por otra parte, es importante analizar los videos oculto (es decir, sin saber los protocolos y tratamientos).
Se ha estudiado el comportamiento rheotactic de muchas especies de peces con natación túneles5,10,11,31. Numerosos estudios previos centraron en la estimación de la velocidad de natación que peces pueden sostener hasta el agotamiento, que se define como Ucrit, principalmente para probar hipótesis fisiológicas y ecológicas11,32, 33. el método descrito en este estudio se centra, en cambio, en el comportamiento rheotactic a velocidades de flujo bajas. Esta elección se hizo porque el objetivo de este estudio es evaluar la sensibilidad a una señal débil y sutil como el campo magnético a través de la observación de un comportamiento de orientación conocido y robusto de los peces, los rheotaxis positivos. En los representativos reportados aquí, pez cebra muestra un umbral muy bajo de rheotactic (sólo unos pocos centímetros por segundo). Esta observación podría ser ecológicamente relevante para esta especie, que habita en entornos donde la velocidad de las corrientes de agua puede variar significativamente. Pez cebra viven en ríos34 y en cuerpos de agua donde el agua se mueve lentamente, como arrozales, lagos y llanuras aluviales35. Cuando el agua se mueve lentamente, la capacidad para detectar y orientar a las velocidades de flujo bajo (un umbral bajo rheotactic) podría ser ventajosa, aumenta las posibilidades de interceptar deriva aguas abajo presa36 y la respuesta rheotactic estímulos direccionales para migración37.
Estas observaciones no podrían hacerse con flujos altos. Esto provocaría una fuerte respuesta locomotor que dependería más de la condición corporal y natación alto de animales en lugar de señales externas como el campo magnético. El protocolo que presentamos se aplicó en el pez cebra, pero es probablemente adecuado para cualquier especies de agua dulce o marinas que habitan entornos con movimiento de agua y pueden ser manejadas en condiciones de laboratorio.
Sin embargo, este protocolo presenta algunas limitaciones. Mientras que claramente pone de relieve si una especie es sensible o a los campos magnéticos, no revela los mecanismos de orientación a través del cual el animal utiliza campos magnéticos para las decisiones del movimiento. Para investigar los mecanismos de orientación magnética en especies acuáticas, comúnmente se utilizan configuraciones con arenas circular y agua7,38,39 o laberintos13 . Sin embargo, peces (y animales acuáticos en general) no viven en entornos donde las corrientes son ausentes, y el método presentado es un primer intento de investigar la respuesta conductual integradora al omnipresentes señales direccionales, como corrientes de agua y magnética campos. Otra limitación de este protocolo es el procedimiento de seguimiento de video manual. Integración con un software de seguimiento automático de esta configuración podría mejorar el momento del proceso de análisis de datos enteros.
El protocolo experimental que se presenta aquí es el primero diseñado para investigar la influencia de la personalidad animal sobre la sensibilidad magnética y rheotaxis. Este tema ha sido pasado por alto en la literatura y debe ser explorado más. Individuos de la misma especie, o incluso dentro de una población o un grupo pequeño (como un banco de peces), se caracterizan por la diversa personalidad rasgos22,40, que puede ser un factor importante en estudios migratorios, exploratorio, navegación y el comportamiento de orientación. No todos los individuos integran las señales ambientales de la misma manera. Así, teniendo en cuenta los factores internos, tales como personalidad, podrían ayudar a reducir la variabilidad de los datos que se observa comúnmente en estudios de Ecología del movimiento16.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado por la Fundación de investigación básica del Departamento de física y el Departamento de Biología de la Universidad de Nápoles Federico II. Los autores agradecen a Dr. Claudia Angelini (Instituto de aplicar cálculo, Consiglio Nazionale delle Ricerche [CNR], Italia) para el apoyo estadístico. Los autores agradecen su ayuda técnica con la recolección de los datos y los técnicos departamentales F. Cassese, Passeggio G. y R. Rocco por su asistencia experta en el diseño y realización de la instalación experimental Martina Scanu y Silvia Frassinet. Agradecemos a Laura Gentile para ayudar a llevar a cabo el experimento durante el rodaje del video. Agradecemos a Diana Rose Udel de la Universidad de Miami para tomar las declaraciones de la entrevista de Alessandro Cresci.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9500 G meter | FWBell | N/A | Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT |
| AD5755-1 | Analog Devices | EVAL-AD5755SDZ | Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter |
| ALR3003D | ELC | 3760244880031 | DC Double Regulated power supply |
| BeagleBone Black | Beagleboard.org | N/A | Single Board Computer |
| Coil driver | Home made | N/A | Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI) |
| Helmholtz pairs | Home made | N/A | Coils made with standard AWG-14 wire |
| HMC588L | Honeywell | 900405 Rev E | Digital three-axis magnetometer |
| MO99-2506 | FWBell | 129966 | Single axis magnetic probe |
| Swimming apparatus | M2M Engineering Custom Scientific Equipment | N/A | Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback |
| TECO 278 | TECO | N/A | Thermo-cryostat |
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