Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In vivo anvendelsen av fjernkontroll systemet for manipulering av endogene genuttrykk
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen beskriver trinnene for å generere et modellsystem som transkripsjon av en endogen genet av interesse kan være betinget kontrollert i levende dyr og celler ved hjelp av forbedret lac repressor og/eller tet aktivator systemer.
Transcript
Betydningen av vår metode er dens allsidighet og styrke. Det gjør det mulig for forskere å ha robust kontroll over endogene genuttrykk på måter som har vært utfordrende å oppnå ved hjelp av eksisterende metoder. Det gjør det mulig for forskere å undersøke et gens funksjon på ulike uttrykksnivåer og på en spatio-temporal måte.
Dermed gjør det det mulig å teste reversibilitet av en fenotype, noe som er nyttig når du studerer sykdomsrelaterte gener. For å oppnå undertrykkelse er målgenintron konstruert for å inneholde repron R, som inneholder 12 symmetriske Lac-operatører. Når LacIGY-undertrykkeren uttrykkes fra ønsket vevsspesifikk promotor, undertrykkes målgenet.
Undertrykkelse av målgenet kan reverseres eller justeres til ønsket uttrykksnivå ved administrering av IPTG, en antagonist av LacIGY-undertrykkeren. For å oppnå oppregulering er målgenarrangøren konstruert for å inneholde fire eller flere Tat-operatorer, T, som bindende steder for rtTA-M2-aktivatorene. Når aktivatoren uttrykkes fra ønsket vevsspesifikk promotor i nærvær av doxycyklin, induseres oppregulering av målgenet.
Oppregulering av målgenet kan reverseres eller justeres til ønsket uttrykksnivå ved å trekke tilbake eller endre konsentrasjonen av doxycyklin. For å oppnå både undertrykkelse og aktivering kan Lac-undertrykker- og Tat-aktivatorsystemene kombineres. For å endre genet av interesse for undertrykkelse, bør en transkripsjonelt inert intron mot den fem viktigste enden av genet av interesse identifiseres for innsetting av repronsekvensen.
For å få den genomiske sekvensen for genet av interesse, naviger til UCSC genomleseren og velg det nyeste utkastet til musegenomet under genomer-fanen. Skriv inn navnet eller symbolet på interessegenet i søkefeltet for å vise transkripsjonene for genet, og klikk deretter gå. Deretter velger du ønsket transkripsjonsvariant for interessekonfliktgenet og klikker på gensymbolet ved siden av transkripsjonsvarianten av interesse.
Deretter klikker du på den genomiske sekvenskoblingen under sekvensen og koblinger til verktøy og databasebanner. For alternativer for sekvenshentingsområde velger du bare eksoner, introner og standard én FASTA-post per gen. Hvis du vil sekvensere formateringsalternativer, velger du exons i store bokstaver, alt annet i små bokstaver og maske gjentas til N.Klikk deretter send.
Til slutt lagrer du denne sekvensen, og bevarer den store og små formateringen i et dokument eller program som kan kommenteres. For å unngå avbrudd av CpG-øyene, velg show for CpG-øyene spor under uttrykket og regulering banner av UCSC genom nettleser og klikk oppdater. Zoome inn på de fem førsteklasses intronene, klikk på hver CpG-øy vist i grønt, og velg se DNA for denne funksjonen.
Etter å ha valgt maske gjentar til N, klikk få DNA for å få CpG øyene sekvens. Til slutt legger du over disse sekvensene med den opprinnelige sekvensfilen, og kommenterer disse som intronic-områder du vil unngå. Hvis du vil unngå intronic-områder med forbedrede signaturer i interessevevet, navigerer du til ENCODE-database og velger eksperimentikonet.
For analysetypen velger du ChiP-seq eller DNase-seq og fyller ut de andre kategoriene i henhold til cellene som skal konstrueres. Etter funksjonsvalg velger du det mest piktogrammet til venstre i blått, som viser resultater som listen vises for. Deretter velger du datasettene for målene for h3k4 monometylering, h3k27 acetylering, DNase 1 og CTCF som best matchet cellene som skal konstrueres.
I hvert relevante datasett blar du til fildelen, kontrollerer at mm10 og UCSC er valgt, og klikker visualiseringsknappen. Nå, i UCSC genom nettleser, zoome inn på de fem prime introns og klikk på hver topp i de kommenterte toppsporene. Få DNA-sekvensen for hvert toppområde ved å klikke på kromosomale koordinater for hver topp.
Velg DNA på rullegardinmenyen for visning, og klikk masken gjentas til N.Endelig overlegg disse sekvensene med den opprinnelige sekvensfilen og kommenterer disse som intronic-områder du vil unngå. Hvis du vil identifisere en sgRNA i de gjenværende intronic-områdene med høy spesifisitet og forventet effektivitetspoeng, navigerer du til et nettbasert sgRNA-designverktøy, for eksempel CRISPOR. Angi sekvensen av det introniske interesseområdet, angi det relevante referansegenomet, og velg ønsket protospacer tilstøtende motiv.
Klikk deretter på Send inn. Deretter sorterer du de forventede sgRNA-ene etter spesifisitetspoeng og velger en eller flere sgRNA-er som også har en høy spådd effektivitetsscore. Til slutt, designe en DNA-mal som inneholder en PITT landing pad sekvens flankert på begge sider av 60-base homologi armer som tilsvarer sgRNA kuttet området.
For reversering av målgenrepressing, administrer IPTG i drikkevannet til homozygous avlet mus med modifisert allele av interesse ved å fullstendig oppløse ønsket mengde IPTG i sterilt destillert vann på administrasjonsdagen. Pakk flasken med folie og administrer IPTG-vannet i en lett beskyttet flaske til musene i riktig genotype og kontroller i minst en uke. Fortsett å analysere uttrykket av genet av interesse for målvevet.
For å indusere genoppreguleringen, administrer doxycyklin i dietten i en uke og fortsett å analysere uttrykket av genet av interesse for målvevet. qRT PCR anaylisis viste at DNMT1-uttrykket ble undertrykt til 15% av de uregulerte nivåene ved hjelp av den promoterbaserte tilnærmingen. Undertrykkelsen ble reversert på en doseavhengig måte ved å behandle mus med varierende mengder IPTG.
Den observerte DNMT1-undertrykkelsen og reverseringen av DNMT1-undertrykkelse ved IPTG-behandling ble validert på proteinnivå ved immunoppnåelse. qRT PCR-analyse av mKate2-uttrykk viste at den intronbaserte tilnærmingen oppnådde mer enn 90 % undertrykkelse fra operatører som ligger flere kilobaser nedstrøms av transkripsjonsstartstedet ved å dempe transkripsjonsutnelsen. Konfokale bilder av mKate2-uttrykket i musenes lille intenstin med eller uten LacIGY-undertrykkeren validerte den intronbaserte tilnærmingen.
Robust oppregulering og nedregulering av DNMT1-uttrykk ble oppnådd i embryonale stamceller som inneholder det modifiserte endogene DNMT1 allelet med Tat- og Lac-operatørsekvensene. Begge forskriftene var fullt reversible og indukelige ved behandling av IPTG og Dox. Sterk oppregulering av DNMT1 ble observert fra leveren, milten og nyre.
Det ble imidlertid ikke observert noen påviselig oppregulering i hjertet, noe som tyder på at cellesyklusavhengig uttrykksmønster av DMNT1 og knappheten på proliferative celler i hjertet kan være til grunn for denne observasjonen. Å studere in vivo-funksjonen til et kritisk gen ved å manipulere uttrykket har ofte vært utfordrende på grunn av dødelighet. Vår metode tillot oss å overvinne den dødelige fenotypen for vårt gen av interesse og gjorde oss i stand til å studere sin rolle i tumorogenese in vivo.
På samme måte vil denne teknologien muliggjøre undersøkelse av andre viktige gener som har vært vanskelige å studere.
Tags
Genetikk problemet 145 transkripsjon uttrykk reversibel lac repressor tet aktivator Dnmt1 undertrykkelse gene regulering induserbartRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
