Summary

Visualiser l’altération des barrières endothéliales et gliales de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale In Vivo

Published: March 26, 2019
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Summary

Nous présentons ici les protocoles pour enquêter sur la dépréciation de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale in vivo. Nous abordons plus précisément comment déterminer la perméabilité de la barrière hémato – encéphalique et activité de gélatinase impliquée dans la migration des leucocytes à travers la glia limitans.

Abstract

L’unité neurovasculaire (UNV) est composée de cellules endothéliales microvasculaires formant la barrière sang – encéphalique (BHE), une membrane basale endothéliale avec péricytes embarqués, et le glia limitans composé par la membrane basale parenchymateuse et astrocytes fin-feed embrassant l’aspect abluminal des microvaisseaux de système nerveux central (SNC). En plus de maintenir les CNS homéostasie l’UNV contrôle traite des cellules immunitaires dans le SNC. Au cours de l’immunosurveillance du SNC des lymphocytes activés en faibles effectifs peuvent traverser la barrière endothéliale sans causer le dysfonctionnement BBB ou cliniques de la maladie. En revanche, au cours de la neuro-inflammation comme dans la sclérose en plaques ou son modèle animal encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) un grand nombre de cellules immunitaires peut croiser le BBB et par la suite la glia limitans atteignant le parenchyme de la CNS conduisant à la maladie clinique. Migration de cellules immunitaires dans le parenchyme de la CNS est donc un processus en deux étapes qui implique une migration séquentielle à travers la barrière endothéliale et gliale de l’UNV employant les mécanismes moléculaires distincts. Si après leur passage à travers la barrière endothéliale, lymphocytes T rencontrent leur apparenté antigène sur les cellules présentatrices d’antigène périvasculaires, leur réactivation locale va initier les mécanismes conduisant à l’activation de focale des gélatinases, qui permettra aux lymphocytes T à traverser la barrière gliale et entrer dans le parenchyme de la CNS. Ainsi, évaluer tous les deux, perméabilité BBB et activité du MMP en corrélation spatiale à l’accumulation de cellules immunitaires dans le SNC au cours de l’EAE permet de spécifier la perte d’intégrité des barrières endothéliales et gliales de l’UNV. Ici, nous montrons comment induire EAE chez les souris C57BL/6 par immunisation active et analyser par la suite la perméabilité BBB in vivo à l’aide d’une combinaison des traceurs fluorescents exogènes. Nous montrons également, comment visualiser et localiser l’activité gélatinase dans les cerveaux de l’EAE en zymogaphy in situ, couplé à des salissures par immunofluorescence des membranes basales BBB et CD45 + invasion des cellules immunitaires.

Introduction

Le système nerveux central (CNS) coordonne tous les corps et les fonctions mentales chez les vertébrés, et homéostasie CNS est essentiel pour une bonne communication des neurones. L’homéostasie du CNS est justifié par l’unité neurovasculaire (UNV), qui protège le système nerveux central du milieu changeant de la circulation sanguine. Le NVU est composé de cellules endothéliales microvasculaires CNS, qui sont biochimiquement unique et mettre en place la barrière sang – encéphalique (BHE) en continu diaphonie avec les péricytes et astrocytes, neurones, constituants de la matrice extracellulaire (ECM), instituant deux distinctes des membranes basales1. La membrane basale endothéliale que cellules l’aspect abluminal des cellules endothéliales BBB recèle un nombre élevé de péricytes et se compose de la laminine α4 et laminine α5, en plus d’autres protéines de ECM2. En revanche, la membrane basale parenchymateuse se compose de la laminine α1 et α2 de laminine et est adoptée par fin-pieds astrocytaires. La membrane basale parenchymateuse ainsi que les astrocytes fin-pieds compose la glia limitans qui sépare le réseau neuronal CNS du périvasculaires rempli de liquide céphalo-rachidien ou espaces sous-arachnoïdienne3. En raison de l’architecture unique de l’UNV, des cellules immunitaires dans le SNC le trafic sont distinct que dans les tissus périphériques car il nécessite un processus en deux étapes avec les cellules immunitaires, tout d’abord viole la BHE endothéliale et par la suite le limitans glia afin de atteindre le parenchyme de la CNS.

Sclérose en plaques (MS) est une maladie fréquente des thérapeutiques de la CNS, dans lequel un grand nombre de cellules immunitaires circulantes entrer dans le SNC et provoquer la neuroinflammation et démyélinisation focale perte d’ intégrité BBB4. Perte d’intégrité BBB est un début de MS, comme en témoigne la présence de contraste gadolinium amélioration des lésions dans le système nerveux central comme visualisées par l’imagerie par résonance magnétique (IRM)5. Extravasation de leucocyte dans le SNC se produit au niveau des veinules postcapillaires ; Cependant, les mécanismes précis diapédèse des cellules immunitaires à travers la membrane basale BBB et par la suite la barrière gliale restent à explorer. Encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) sert un modèle animal de la SP et a largement contribué à nos connaissances actuelles sur la pathogénie de MS. Par exemple, en utilisant le modèle de l’EAE on a découvert qu’extravasation de leucocyte se produit dans un processus multipas, y compris une capture initiale et laminage étape par l’intermédiaire de sélectines et les molécules de type mucine comme ligand de glycoprotéine P-sélectine (se) -1, suivie de l’arrestation ferme intégrine-dépendante et rampant des lymphocytes T sur les cellules endothéliales de BBB à côtés permissives pour diapédèse6.

Une fois que les cellules T ont traversé le BBB endothélial et la membrane basale endothéliale, ils doivent rencontrer leur antigène analogue sur les macrophages ou cellules dendritiques stratégiquement localisés dans les espaces méningées ou périvasculaires. Cette interaction induit focale production de médiateurs pro-inflammatoires que déclencher les mécanismes suivants requis pour invasion tissulaire CNS des cellules immunitaires par l’intermédiaire de la glia limitans7,8,9. Activation de focale-métalloprotéinases matricielles (MMP) -2, MMP-9 modifie chemokine activation et provoque la dégradation des récepteurs de la matrice extracellulaire sur astrocyte-embouts, qui est une condition sine qua non pour immunitaire cell migration à travers la limitans de cellules gliales dans le Parenchyme CNS et d’induire l’apparition des symptômes cliniques de l’EAE10,11.

La combinaison de détection des CNS s’infiltrer dans les cellules immunitaires avec BBB activité fuite et gélatinase dans des sections de tissu CNS fournit des informations précieuses sur l’intégrité fonctionnelle de la barrière endothéliale et gliale dans le contexte de la neuroinflammation. Par exemple, nous avons étudié récemment la perte constitutive de la molécule d’adhérence jonctionnelles molécule endothéliales jonction serrée (JAM)-B dans le trafic de cellules immunitaires dans le SNC dans le contexte de l’EAE. Chez la souris C57BL/6 type sauvage, sains littermates JAM-B-deficient montrent à sans altération de l’intégrité de la BBB comme indiqué par l’évaluation de la perméabilité in vivo à l’aide de traceurs tant endogène qu’exogène,12. Dans le contexte de l’EAE, JAM-B-deficient C57BL/6 souris ont montré des symptômes de maladie flexibilit, qui a été associée par piégeage de cellules inflammatoires dans les espaces méningées et périvasculaires à12. Pour étudier ce phénomène, nous avons appliqué in situ zymographie, permettant d’identifier l’activité gélatinase afin de tester si le manque d’activité de gélatinase dans les souris déficientes en B-confiture peut être responsable de la réduction du nombre de cellules immunitaires capables de rompre le glia limitans12.

Compte tenu de la disponibilité des différents génétiquement souris modèles n’ayant pas, par exemple, différentes molécules de jonction serrée BBB qui peuvent entraîner des modifications en fonction de la BBB, méthodologies d’enquête sur l’intégrité BBB sont importants. En outre, nouveaux médicaments pourraient avoir une incidence sur les obstacles NVU. Ici, nous montrons comment induire EAE chez les souris C57BL/6 par immunisation active avec la glycoprotéine oligodendrocyte de myéline (MOG)-peptide AA 35-55 en adjuvants de Freund complet. Puis, nous expliquons comment localiser l’infiltration de cellules immunitaires à travers les barrières endothéliales et gliales de l’UNV et étudier l’intégrité des barrière endothéliale et gliales in vivo par détection in situe des traceurs exogènes et activité de gélatinase, respectivement.

Protocol

Toutes les études ont été menées au titre des directives conformément à la législation suisse sur la protection des animaux et ont été approuvés par l’Office vétérinaire Suisse du Canton de Berne, (numéro d’autorisation : BE 31/17 et être 77/18). 1. logement de souris C57BL/6 dans les conditions (SPF) gratuites agent pathogène spécifique Cycle de souris communes dans des cages individuelles ventilés avec un 12/12 h lumière-obscurité. Fournir de la nourriture e…

Representative Results

Évaluation de l’évolution clinique de l’EAE chez les souris C57BL/6 devrait se traduire par une courbe de la maladie comme illustré à la Figure 2 a et variations dans le poids de corps de souris tels que présentés dans la Figure 2 b. C57BL/6 souris immunisées avec MOGaa35-55 habituellement commencent à développer des symptômes de la maladie autour de jour 10-12 après immunisation active (Figure 1 a). En général, sou…

Discussion

Nous présentons ici un protocole pour induire et contrôler l’EAE chez les souris C57BL/6 femelles. Les femelles sont préférentiellement choisies, et on observe une incidence des femmes : hommes de 3:1 dans la SP. Pour évaluer la gravité de l’EAE, nous avons fait utiliser une feuille de notation de 3 points. Gravité de l’EAE est généralement marquée par rapport à la gravité des dysfonctionnements moteurs. Souris avec pointe de stades de l’EAE, c’est-à-dire présentant un score supérieur à 2 devrait…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons avec Lydia Sorokine, qui a partagé son original in situ zymographie protocole10 avec nous.

Materials

AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis–a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

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Cite This Article
Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

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