Summary
Här presenterar vi protokoll för att undersöka nedsättning av neurovaskulära enheten under experimental autoimmune encephalomyelitis Invivo. Vi adress specifikt hur man bestämma blod - hjärnbarriären permeabilitet och gelatinase aktivitet deltar i leukocytmigration över den glia limitans.
Abstract
Neurovaskulära enheten (NVU) består av mikrovaskulära endotelceller som bildar den blod - hjärnbarriären (BBB), en endothelial basalmembranet med inbäddade pericyter, och den glia limitans komponerad av parenkymal basalmembranet och astrocytic slutet-feed omfamna den abluminal aspekten av centrala nervsystemet (CNS) microvesselsna. Förutom att bibehålla CNS styr homeostas på NVU immunceller handel till CNS. Under immunosurveillance i CNS kan låga antalet aktiverade lymfocyter korsa endotel barriären utan att orsaka BBB dysfunktion eller klinisk sjukdom. Däremot under neuroinflammation såsom multipel skleros eller dess djurmodell kan experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) ett stort antal immunceller passera BBB och därefter den glia limitans så småningom nå CNS parenkymet leder till klinisk sjukdom. Immunceller migration till CNS parenkymet är således en tvåstegsprocess som innebär en sekventiell migrering över endothelial och gliaceller barriären för den NVU sysselsätter olika molekylära mekanismer. Om efter deras passage över endotel barriären, T-celler stöta deras cognate antigen på perivaskulär antigen-presenterande celler deras lokala reaktivering kommer inleda efterföljande mekanismer leder till fokal aktivering av gelatinases, som kommer att aktivera T-cellerna att korsa gliaceller barriären och ange CNS parenkymet. Således tillåter att bedöma både BBB permeabilitet och MMP aktivitet i rumslig korrelation till immunceller ackumulering i CNS under EAE för att ange förlust av integritet av endothelial och gliaceller hindren för NVU. Här visar vi hur man framkalla EAE i C57BL/6 möss av aktiv immunisering och därefter analysera BBB permeabilitet i vivo med en kombination av exogena fluorescerande spårämnen. Vi ytterligare Visa hur man visualisera och lokalisera gelatinase aktivitet i EAE hjärnor av jordbaserad zymogaphy kopplat till Immunofluorescerande infärgning av BBB källaren membran och CD45 + invaderande immunceller.
Introduction
Det centrala nervsystemet (CNS) samordnar alla kropp och mentala funktioner hos ryggradsdjur, och CNS homeostas är avgörande för en korrekt kommunikation av nervceller. CNS homeostas rättsordning neurovaskulära enheten (NVU), som skyddar CNS från den föränderliga miljön i blodet. NVU består av CNS mikrovaskulära endotelceller, som är biokemiskt unika och upprätta den blood - brain barriären (BBB) i kontinuerlig överhörning med pericyter, astrocyter, nervceller och extracellulär matrix (ECM) komponenter, upprätta två distinkta källaren membran1. Endothelial basalmembranet som ensheathes den abluminal aspekten av BBB endotelceller hamnar en kick numrerar av pericyter och består av laminin α4 och laminin α5, förutom andra ECM proteiner2. Däremot parenkymal basalmembranet består av laminin α1 och laminin α2 och är omringad av astrocytic slutet-fötter. Parenkymal basalmembranet tillsammans med astrocyten slutet-fötterna komponerar den glia limitans som segregerar CNS neuronala nätverket från cerebrospinalvätska fylld perivaskulär eller subarachnoid utrymmen3. På grund av den unika arkitekturen av NVU är immunceller som människohandel i CNS skild från att i perifera vävnader eftersom det kräver en tvåstegsprocess med immuncellerna, först bryter mot endothelial BBB och därefter den glia limitans för att når CNS parenkymet.
Multipel skleros (MS) är en vanlig neuroinflammatoriska sjukdom i CNS, där ett stort antal cirkulerande immunceller ange CNS och orsaka neuroinflammation, demyelinisering och fokal förlust av BBB integritet4. Förlust av BBB integritet är en tidig MS, som anges av närvaron av gadolinium kontrast öka lesioner i CNS som visualiserade genom magnetisk resonanstomografi (MRT)5. Leukocyt extravasering till CNS uppstår i nivå med postcapillary venules; de exakta mekanismerna som är involverade i immunceller diapedesis över BBB basalmembranet och därefter gliaceller barriären återstår dock undersökas. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) fungerar som en djurmodell för MS och har väsentligt bidragit till vår nuvarande kunskap om MS patogenes. Exempelvis har med hjälp av EAE modellen man upptäckt att leukocyt extravasering sker i en process, inklusive en första fångsten och rullande steg medieras av selectins och mucin-liknande molekyler som P-selektin glykoprotein ligand (PSGL) -1, följt av integrin-beroende fast gripandet och genomsökning av T-celler på BBB endotelceller till tillåtande sidor för diapedesis6.
När T-celler har passerat endothelial BBB och endotel basalmembranet, behöver de stöta deras cognate antigen på makrofager och dendritiska celler strategiskt lokaliserade i leptomeningeal eller perivaskulär utrymmen. Denna interaktion inducerar fokal produktionen av pro-inflammatoriska mediatorer som utlöser de efterföljande mekanismerna krävs för CNS vävnad invasion av immunceller via glia limitans7,8,9. Focal aktivering av matrix-metalloproteinas (MMP) -2 och MMP-9 förändrar chemokine aktivering och inducerar nedbrytning av extracellulärmatrix receptorer på astrocyten slutet-fötter, som är en förutsättning för immun cell migration över den glia limitans i den CNS parenkymet och att framkalla kliniska symtomen av EAE10,11.
Läckage och gelatinase aktivitet i CNS vävnadssnitt kombinerar detektion av CNS infiltrera immunceller med BBB och ger värdefull information om funktionella integriteten av endothelial och gliaceller barriären i samband med neuroinflammation. Till exempel, vi nyligen undersökt konstituerande förlusten av endothelial åtsittande föreningspunkt molekyl Junktional vidhäftning molekylen (SYLT)-B i immunceller handel till CNS i samband med EAE. Jämfört med friska vildtyp C57BL/6 möss, friska JAM-B-brist littermates visade ingen försämring av BBB integritet som visas av Invivo permeabilitet bedömning använder endogena samt exogena spårämnen12. I samband med EAE, JAM-B-brist C57BL/6 möss visade förbättras sjukdomssymtom, som var associerade med inflammatoriska celler svällning i leptomeningeal och perivaskulär utrymmen12. För att undersöka detta fenomen vi tillämpat i situ zymography, möjliggör identifiering av gelatinase aktivitet för att testa om brist gelatinase aktivitet i SYLT-B-brist möss kan ansvara för det reducera antalet immunceller som kan bryta mot de glia limitans12.
Med tanke på tillgången på modifierade olika genetiskt mus modeller saknar, t.ex. olika BBB åtsittande föreningspunkt molekyler som kan orsaka förändringar i BBB funktion, metoder för att undersöka BBB integritet är viktigt. Nyutvecklade droger kan dessutom påverka NVU hinder. Här visar vi hur man framkalla EAE i C57BL/6 möss av aktiv immunisering med den myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)-peptid aa35-55 i komplett Freunds adjuvans. Sedan förklarar vi hur du lokalisera immunceller infiltration över NVU endothelial och gliaceller barriärer och studera Invivo endothelial och gliaceller barriär integritet genom jordbaserad upptäckt av exogena spårämnen och gelatinase aktivitet, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier genomfördes enligt riktlinjer enligt den schweiziska lagstiftningen om skydd av djur och godkändes av veterinärmedicinska byrån av kantonen Bern, Schweiz (tillstånd nummer: BE 31/17 och vara 77/18).
1. bostäder C57BL/6 möss i specifik patogen fri (SPF) villkor
- Hus möss i enskilda ventilerade burar med en 12/12 h ljus-mörker cykel. Ge mat och vatten ad libidum. För att övervaka mikrobiologiska kvaliteten på möss, genomgick den experimentella kohorten kvartalsvisa hälsoövervakning av smutsiga sängkläder vaktposter efter FELASA rekommendationer13.
- Använda örat stämplingar till individuellt mark 8-12 vecka gammal kvinnlig C57BL/6 möss.
2. immunisering av C57BL/6 möss
- Beredning av lösningar14:
- För komplett Freunds adjuvans (CFA), inaktiverat mix 30 mL av ofullständig Freunds adjuvans med 120 mg av nymalen pestled värme Mycobacterium tuberculosis (H37RA) under ett dragskåp. Lagra stamlösning vid 4 ° C.
- För MOGaa35-55-peptid stamlösning, lös MOGaa35-55-peptid i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (4 mg/mL) och lagra vid-80 ° C.
- Förbereda MOG-emulsionen:
- Späd CFA 1:2 med MOG-peptid stamlösning i en 2 mL mikrorör.
- Försegla mikroröret med tätning film och fixa på en Vortex mixer genom att fullständigt täcka röret med tejp. Vortex emulsion för 4 h vid 4 ° C.
- Förbereda sprutor med stabil emulsion:
- Ta mikroröret och snabbt snurra ner emulsionen med en liten tabell centrifug. Samla in emulsion i en spruta med en injektionsnål i 18G x 1½'' (1,2 mm x 40 mm).
- Beroende på antalet möss justera volymen emulsion i sprutan (100 µL/mus) och byt 18 G nål med en injektionsnål i 27G x ¾'' (0,4 mm x 19 mm). Försegla injektionsnålen fäst sprutan med tätning film.
- För kikhosta toxin (PTx) stamlösning, lös 50 µg frystorkade PTx i 500 µL sterilt PBS (100 ng/µL). Lagra stamlösning vid 4 ° C.
- För PTx arbetslösning, blanda 97 µL sterilt PBS med 3 µL av PTx stamlösning (300 ng/100 µL) per mus (för intraperitoneal injektion en 30G x ½'' (0.3 mm x 13 mm) nålen).
- EAE induktion
- Söva C57BL/6 möss med isofluorane använder en vaporizer system. För att inducera anestesi hos möss, exponera musen till 4,5% isofluorane i syre i en liten inkubation kammare före flyttningen musen till en ansiktsmask med 2,1% isofluorane. Använda en anestesi enhet utrustad med värmedyna för att förhindra hypotermi av musen.
- Fixa sövda musen i ena handen och först injicera 30 µL av MOG35-55/CFA-emulsion subkutant i bakben flanker (figur 1:1 + 2; totalt 60 µL; vänster flank 30 µL och högra flank 30 µL) i nära närhet till inguinal lymfkörtlar.
- Placera musen på sin mage och injicera 20 µL av MOGaa35-55/CFA-emulsion i vänster och höger mjuk fettvävnad svans roten (figur 1:3 + 4; totalt 40 µL; vänster svans rot 20 µL och höger svans rot 20 µL) och en liten droppe av MOGaa35-55/CFA-emulsion int o halsen på musen (figur 1: 5).
- Injicera 100 µL PTx lösning intraperitonealt i musen. Håll huvudet av musen under stadens kroppen undvika injektion i tarmen.
- Ersätta underhåll kost (extrudate stora näringsämnen: råprotein 18,5% rå fett 4,5% rå fiber 4,5%, råaska 6,5%; stärkelse 35%; metabolisk energi: 13,1 MJ/kg) till formeringen kost (extrudate stora näringsämnen: råprotein 23,5%, rå fett 5,5%, växttråd 3%; råaska 5,7%; stärkelse 36%; metabolisk energi: 14,3 MJ/kg) för att ge mössen med livsmedel av högre energiinnehåll före och under den förväntade klinisk sjukdomen.
- Avlägsna ansiktsmasken och föra musen till dess buren med en värmande pad. Kontrollera att musen är fullt vaken och rörliga efter 10 minuter.
- Upprepa PTx injektionen (2.2.4) 48 h efter första behandlingen.
3. scoring av EAE möss
- Kontrollera hälsotillståndet hos EAE möss varje morgon genom att ta en titt inuti burar.
- Poäng EAE möss varje eftermiddag.
- Ta varje individuell mus ingår i EAE experimentet ur buren och kontrollera huruvida svansen har tonus genom att flytta den uppåt med ett finger. En hälsosam mus kommer att hålla sin svans (svansen har en tonus). Om kliniska EAE har startat, blir svans tonus lägre, synliga genom en gradvis minskning av svansen. Så småningom kommer musen inte kunna lyfta sin svans alls.
- Placera varje individuell mus ingår i EAE experimentet på bänken ren och observera och dokumentera den vandrande beteenden. Se tabell 115 för poängkriterier för bedömning av sjukdomens svårighetsgrad (EAE poäng).
- Bedöma och dokumentera vikten av varje mus som ingår i experimentet.
- För att säkerställa tillräckligt med mat och vatten upptag av möss visar en klinisk EAE poäng 1 levererar fuktade mat i en plast skål på botten av buren och uppdatera dagligen.
4. In vivo permeabilitet assay
- Preparat av lösningar:
- För dextran stamlösningar, lös 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 samt 3 kDa Dextran Texas Red i 500 µL 0,9% natriumklorid lösning (20 mg/mL).
- Dextran arbetslösning, precis före injektion Pipettera 55 µL 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 stamlösning (20 mg/mL) på en bit tätning film och lägga till 55 µL av 3 kDa dextran Texas Red stamlösning (20 mg/mL). Blanda och samla in 100 µL i en fin engångsspruta (slutlig koncentration 2 mg/100 µL).
- För 10% formaldehyd (PFA) stamlösning, kombinera 10 g av PFA extra ren pulver, 100 mL PBS och 200 µL 1N NaOH i en rent glasbägare och värme upp till just 56 ° C under omrörning med en magnetomrörare; hålla vid 56 ° C i 30 min tills PFA är helt upplöst; svalna till rumstemperatur; Justera pH till 7.4. och filtrera genom ett pappersfilter. Förvaras vid - 20 ° C. Stamlösningen kan spädas ytterligare med PBS.
- Strax söva friska C57BL/6 möss eller C57BL/6 möss lider från EAE med isofluran (musen kommer sederas för ca 1 min). Använda ett automatiserat system som i steg 2.2.1 (möss kommer att vara utsatt för 4,5% isofluran i syre i en induktion kammare och överförs sedan till en ansiktsmask med 2,1% isofluran).
- Placera sövda musen i lateral position på bordet, sedan intravenöst (e.g. retro-orbitally) injicera 100 µL av fluorescerande spårämnen i musen innan musen vaknar.
- Omedelbart ta bort ansiktsmask och kontrollera musen är fullt vaken och rörliga efter den korta anestesi. Låt spårämne cirkulera i 15 min.
- Fortsätt med steg 5.1.
5. perfusion av möss
-
För Invivo permeabilitet bedömning:
- Inleda förfarandet 15 min efter fluorescerande spårämne injektion genom att framkalla djupa isofluran anestesi. För att framkalla djup anestesi hos möss använder 2,3% av isofluran i syre. Använd tass tillbakadragande reflexen för att bedöma djupet av anestesi (nyp ihop huden mellan tårna, bristande flexion indikerar en tillräckligt djup), och sond reflexer både forelimb och bakbenet i möss som utsätts för EAE.
- Fixa musen på ryggen och spraya magen med etanol. Öppna bröstkorgen med hjälp av en sax och ta bort membranet. Öppna höger förmak av slog hjärtat med en sax och BEGJUTA musen genom vänster kammare i hjärtat med 10 mL PBS följt av 10 mL 4% PFA i PBS.
FÖRSIKTIGHET: Undvik att inandas PFA, BEGJUTA musen i dragskåp. - Fortsätt till avsnitt 6.
-
För i situ zymography:
- Framkalla djupa isofluran anestesi med 2,3% isofluran i syre i en mus som lider av EAE och kontrollera djup anestesi som i steg 5.1.1.
- Nästa, fix musen på ryggen och spraya magen med etanol. Öppna bröstkorgen med hjälp av en sax och ta bort membranet. Öppna höger förmak av slog hjärtat med en sax och BEGJUTA musen genom vänster kammare i hjärtat med 20 mL PBS.
- Fortsätt till avsnitt 6.
6. dissektion och frysning av hjärnor
- Beredning av kylning bad:
- Fyll en platt dewar behållare med krossade torr-is och Lägg till 2-methylbutane (isopentan) tills vätskan når ca 1 cm ovanför torr-is pack. Täck med ett löst lock – exempelvis en ishink täcker.
- Klipp av huvudet av perfunderade musen med vass sax och ta bort hud och öron med en mindre uppsättning saxar.
- Noggrant dissekera skullcap genom att skära från foramen magnum mot framsidan på vänster och höger sida gör det möjligt att upfold kalott över hjärnan. Sedan, lyft försiktigt ut intakt hjärnan från basen av skallen samtidigt bryta optiska nerverna med en platt metall spatel.
- Placera hjärnan på aluminiumfolie och skär hjärnan i tre delar (frontal hjärnan, mellersta hjärnan, och lillhjärnan + hjärnstammen) genom att placera två koronalt nedskärningar.
- Fyll en cryomold (25 x 20 x 5 mm) första kvartalet med optimal temperatur skärning (O.C.T.) matris, placera hjärnan skivor med den främre sidan av varje hjärna bit nedåt i cryomold och täcka vävnad helt med O.C.T. matris.
- Placera cryomold med vävnaden i en horisontell orientering in i 2-Methylbutane-badet och se till att vävnaden fryser från botten till toppen inom 1 minut genom att undvika doppa blocket hela vävnad i badet.
- Överföra fryst vävnad till-80 ° C för lagring och fortsätt med avsnitt 7.
7. förberedelse av frysta vävnadssnitt
- Temperera temperatur från fryst vävnad från-80 ° C till-20 ° C i kryostaten i 30 min.
- Ta bort vävnad block från cryomold och montera på kryostaten vävnad innehavaren (inställd på-15 ° C) med en O.C.T. matris.
- Trimma kanterna vävnad block på innehavaren av kryostaten med en vass skalpell och börja skära i vävnad blocket genom att ta bort 20 µm sektioner med kryostaten kniven tills vävnaden syns.
-
För analys av Invivo BBB permeabilitet:
- Minska 6-10 µm vävnadssnitt, samla dem på vidhäftning glasskivor och omedelbart bild avsnitten täckt med ett täckglas med fluorescens Mikroskop.
- Bedöma utseendet av blodkärl i hjärnan (uppmärksamma skarpa gränserna av icke-läckande blodkärl jämfört med diffus fluorescens mönster observerades för läckande blodkärl). Som positiv kontroll, kontrollera läckage av spårämne i stroma circumventricular organ eller plexus koroidea som saknar en BBB.
-
För i situ zymography:
- Skär 6 µm vävnadssnitt använder en kryostaten, samla dem på vidhäftning glasskivor och frysa vävnadssnitt vid-20 ° C i en frysning låda som innehåller kiselgel i locket.
8. in situ zymography kombinerat med laminin/CD45 immunofluorescens färgning
- Bered lösningar:
- Förbereda inbäddning lösning:
- Blanda 6 g glycerol (analyskvalitet), 2.4 g av poly (vinylalkohol), 6 mL ddH2O och 12 mL 0,2 M Tris buffert, pH 8, och rör om (magnetisk omrörare) lösningen för 4 h på RT.
- Överför lösningen till en 50 mL centrifugrör och låt det vila i 2 h på RT. Därefter Inkubera lösningen för 10 min vid 50 ° C (vattenbad) och Centrifugera i 20 min vid 2700 x g vid rumstemperatur.
- Ta supernatanten och frysa i alikvoter vid-20 ° C.
- Förbereda kalla gelatin lösningen:
- Lös 0,1 g kallt gelatin från nötkreatur hud i 10 mL ddH2O.
- Låt det Blötlägg i minst 1 dag och lagra alikvoter vid 4 ° C.
- Förbereda iskall metanol (-20 ° C):
- Lägg 100% metanol i en coplin-burk och kyla ner till-20 ° C.
- Förbereda 10% natrium natriumazid stamlösning:
- Tillsätt 1 g natriumazid 10 ml av ddH2O och förvara i rumstemperatur.
- Förbereda 0,1% natrium natriumazid fungerande lösning:
- Mix 99 µL i ddH2O med 1 µL 10% natrium natriumazid stamlösning.
- Lös 1 mg fluorescein konjugerat dye-kylda (DQ) gelatin från svin hud i 1 mL av natriumazid arbetar lösning och store 100 µL portioner skyddas från ljus vid 4 ° C.
- Lös 30 mg 1,10-phenanthroline monohydrat i 76 µL etanol och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 25 x proteas hämmare lösning:
- Lägg till 1 tablett av EDTA gratis proteashämmare i 2 mL av ddH2O. Förvaras vid-20 ° C.
- Precis innan användning, förbereda reaktion lösning (150 µL/avsnitt):
- Centrifugera 1 mg/mL DQ gelatin lösningen för 5 min vid 13,300 x g.
- Blanda 127,2 µL av ddH2O, 15 µL 10 x reaktion buffert (Gelatinase/kollagenas Assay Kit, se Tabell för material), 0,3 µL av 20 mg/mL kall gelatin, 1,5 µL av 1 mg/mL DQ gelatin och 6 µL av 25 x proteas hämmare lösning.
- Precis innan användning, förbereda phenantroline negativ kontroll reaktion lösning (150 µL/avsnitt):
- Blanda 125,2 µL av ddH2O, 15 µL 10 x reaktion buffert, 0,3 µL 20 mg/mL kall gelatin, 1,5 µL av 1 mg/mL DQ gelatin, 6 µL av 25 x proteashämmare EDTA gratis och 2 µL av 2 M 1,10-phenantroline (MMP-hämmare).
- Precis innan användning, förbereda kalla gelatin (icke-fluorescerande) negativ kontroll reaktion lösning (150 µL/avsnitt):
- Blanda 128,7 µL av ddH2O, 15 µL 10 x reaktion buffert, 0,3 µL av 20 mg/mL kall gelatin och 6 µL av EDTA-fria 25 x proteashämmare.
- Förbereda primär antikropp cocktail för counterstaining, till exempel, 0.95 µg/mL polyklonala kanin-anti-laminin-antikropp och 10 µg/mL polyklonala råtta anti-CD45 antikropp i 1% BSA i PBS, och förbereda lämpliga isotypen kontroll primär antikropp cocktails.
- Förbereda sekundär antikropp lösning, exempelvis 7,5 µg/mL Cy3 get anti råtta + 15 µg/mL AMCA anti-kanin i 1% BSA i PBS (ljuskänsligt).
- Förbereda inbäddning lösning:
- Tina 6 µm icke-fast hjärnan vävnadssnitt från EAE möss inne plast frysning rutan som innehåller kiselgel i locket i dragskåp att undvika lagring av vatten i vävnad och separata 2 vävnadssnitt på en bild genom att rita linjer med vatten repellerande penna
- Förbereda reaktion lösningar (steg 8.1.9-8.1.11), Centrifugera i 5 min vid 13.400 x g vid rumstemperatur, och före varma till 37 ° C med ett vattenbad.
- Rehydrera avsnitten vävnad för 5 min vid 37 ° C med 1 x reaktion buffert. Häll sedan av 1 x reaktion buffert, lägga till reaktion lösning på vävnadssnitt och inkubera i 4 timmar vid 37 ° C. Tvätta diabilder 5 gånger i ddH2O.
- Fixa avsnitt för 5 min med iskall metanol vid-20 ° C och därefter tvätta avsnitt en gång med PBS i rumstemperatur.
- Tillsätt 1% BSA i PBS avsnitten och Inkubera under 20 minuter vid rumstemperatur (ljuskänsligt). Sedan, kasta 1% BSA i PBS från avsnitten genom att vända glasen på vävnad, Lägg till primär antikropp cocktail och inkubera i 1 h i rumstemperatur (ljuskänsligt).
- Tvätta två gånger med PBS, lägga till sekundära antikroppar cocktail och inkubera i 1 h i rumstemperatur (ljuskänsligt).
- Tvätta två gånger med PBS, montera bilderna med inbäddning lösning, låt monterade sektioner torka över natten i rumstemperatur (ljuskänsligt). Slutligen analysera färgade vävnadssnitt med fluorescerande Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bedömning av det kliniska förloppet av EAE i C57BL/6 möss bör resultera i en sjukdom kurva som skildras i figur 2A och förändringar i kroppsvikten mus som presenteras i figur 2B. C57BL/6 möss immuniserats med MOGaa35-55 brukar börja utveckla sjukdomssymptom runt dag 10-12 efter aktiv immunisering (figur 1A). Immuniserade möss visar vanligtvis, en övergående minskning av kroppsvikt dagen efter injektion av emulsionen och den första dosen av kikhosta toxin (figur 1B). Från dag 2 efter EAE induktion ökar kroppsvikt immuniserade mössen sedan gradvis tills den sjukdom börjar, när kroppsvikten normalt sjunker en dag före utvecklingen av kliniska symtom och fortsätter att minska korrelera till den ökande sjukdomssymtom (figur 1A,B). EAE sjukdom svårighetsgraden ökar fram till toppen av sjukdomen, som kan förväntas mellan dagar 16 och 20 efter EAE induktion (figur 2A). På toppen av kliniska EAE visar möss också den lägsta kroppsvikt (figur 2B), vilket ökar i korrelation till förbättringen av EAE i fasen remission av sjukdomen (figur 2A,B). EAE induktion i C57BL/6 möss med MOGaa35-55-resultat i en kronisk sjukdom patologi och möss normalt tillfrisknar inte fullt (figur 1A).
Figur 3A visar en representativ bild av plexus koroidea och intilliggande hjärnparenkymet C57BL/6 musklick lider av EAE som injicerades intravenöst med fluorescerande 3 kDa Dextran (röd) och 10 kDa Dextran (grön) 15 min innan att offra ; skala bar 50 µm. Som vi tidigare har visat, anges spårämnen lätt diffus över den fenestrated microvesselsna till stomi i plexus koroidea (vänstra och mittersta bilden), medan BBB inte tillåter diffusion av cirkulerande spårämnen i hjärnparenkymet, av den streckade linjen (högra bilden), som saknar således någon fluorescerande signal. Figur 3B visar representativa läckande blodkärl i lillhjärnan C57BL/6 musklick lider av EAE som injicerades intravenöst med fluorescerande 3 kDa Dextran (röd) och 10 kDa Dextran (grön) 15 min innan att offra. Pilen huvuden ange spårämnen spridas ut över den hjärnan microvesselsna i CNS parenkymet (vänstra och mittersta bilden), vilket tyder på att funktionen BBB är nedsatt hos dessa fartyg. I CNS parenkymet är gröna och röda fluorescerande signal synliga utanför blodkärlens väggar, vilket indikeras av streckade linjer. I EAE, kan i lillhjärnan där inflammatoriska manschetter visas spårämnen också hittas i perivaskulär utrymmet mellan endotelceller basalmembranet och den glia limitans som visar funktionella förlust av endothelial BBB integritet. Om tracer befinns diffunderar in hjärnparenkymet, visar det ytterligare dysfunktion av gliaceller barriär12.
Figur 4 visar representativa bilder av analysen av gelatinase (MMP) aktivitet i en EAE hjärna C57BL/6 musklick visualiseras av jordbaserad zymography och lokaliserad till specifika hjärna barriären fack av anti-pan-laminin (blå) och förekomsten av inflammatoriska celler av anti-CD45 (röd) immunofluorescens färgning. Proteolytisk klyvning av färgämne-kylda (DQ) gelatin unquenches en fluorescein signal, som tillåter lokalisering av gelatinase aktivitet på avsnittet vävnad. När kall gelatin (icke-fluorescerande kontroll) inkuberas, inget grönt fluorescerande signal kan upptäckas i avsnitten hjärnan från EAE möss (övre raden) samt i avsnitt som har inkuberats med DQ-gelatin kombinerat med phenantroline, en potent Zn +- komplexbildaren och MMP-hämmare (mellersta raden). I den nedre raden är fokala gelatinase/MMP aktivitet synlig som typiska granulat ljusa grön fluorescens signal, som framhållits av pilspetsar. I inflammatorisk manschetter i lillhjärnan av en EAE mus sker specifika MMP aktivitet utöver den glia limitans (blå) på platser av infiltration av inflammatoriska celler (röd).
Figur 1 : Grafisk representation av injektionsställen för EAE induktion. (1) injektionsstället för 30 µL MOG-emulsion i den högra flanken, 2) injektionsstället för 30 µL MOG-emulsion i den vänstra flanken, 3) injektionsstället för 20 µL MOG-emulsion till vänster svans roten, 4) injektionsstället för 30 µL MOG-emulsion i rätt svans roten 5) injektionsstället för en liten droppe av MOG-emulsion i halsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa kursen av EAE. (A) sjukdomssymtom av EAE i C57BL/6 möss över tid. Medelvärdet +/-SEM visas. (B) förändring av kroppsvikt under EAE över tid. Medelvärdet +/-SEM visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativ bild av Invivo permeabilitet. (A) vänster bild: grön fluorescerande 10 kDa dextran i nivå med plexus koroidea. Mitten bilden: röd fluorescerande 3 kDa dextran i nivå med plexus koroidea. Högra bilden: sammanfoga vänstra och mittersta bilder. Skala bar 50 µm. (B) vänster bild: grön fluorescerande 10 kDa dextran i mus lillhjärnan. Mitten bilden: röd fluorescerande 3 kDa dextran i mus lillhjärnan. Högra bilden: sammanfogning av den vänstra och mittersta bilden. Streckade linjer är vägledande för blodkärlens väggar; pilen huvuden peka på fluorescerande spårämnen i CNS parenkymet. Skala bar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa bilder av i situ zymography. Första kolumnen: grön fluorescerande kanal (OSLÄCKT signal dye-kylda (DQ) gelatin). Andra kolumnen: blå fluorescerande kanal (laminin). Tredje kolumnen: röda fluorescerande kanalen (CD45). Fjärde kolumnen: sammanfogning av fluorescerande kanaler. Övre raden: kall gelatin (icke-fluorescerande) negativ kontroll. Mellersta raden: phenantroline (MMP-hämmare) negativ kontroll. Nedre raden: DQ gelatin. Skala bar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| 0 till 3 poäng | kriterier | viktförändring |
| 0 | inga tecken | normal vikt |
| ~ | svag svans (svag tonus) - inhouse kriterier: inte ingår i dokumenterade scoring | viktminskning (vägledande för 2nd check) |
| 0,5 | halta svans (svans droppar) | viktminskning |
| 1 | hindleg svaghet, ostadig gång (musen går på bänken som en anka) | viktminskning |
| 2 | hindleg paraplegi (musen flyttas inte dess bakbenen) | kraftig viktminskning (vägledande för 2nd check) |
| 3 | hindleg paraplegi, inkontinens förlust av lägre kroppskontroll (mus falls till en sida men kan flytta i buren med ist frontlegs + inkontinens; döende) | mycket låg kroppsvikt (vägledande för 2nd check) |
Tabell 1: Poängkriterier för bedömning av EAE sjukdomens svårighetsgrad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för att inducera och övervaka EAE i kvinnliga C57BL/6 möss. Honor är företrädesvis valt, och det finns en förekomst av kvinnor: män 3:1 i MS. För att bedöma svårighetsgraden av EAE, gjorde vi använder sig av ett 3-punkt scoring blad. EAE svårighetsgrad är generellt gjorde med avseende på svårighetsgraden av motor dysfunktioner. Möss med avancerade stadier av EAE, dvs uppvisar en poäng ovanför 2 bör offras för att undvika onödigt lidande för djuren. Därför är det rekommenderat att poäng möss med täta intervall t.ex. två gånger dagligen som förklaras i protokollet. Det finns flera scoring rutiner sysselsatt, sträcker sig från 0-3 pekar på 0-6 punkter16,17,18,19 eller ännu mer subpoints20. Vi har dock tidigare visat att förment raffinerade EAE scoring inte leder till någon förbättring i att bestämma potentiella statistiskt signifikanta skillnader i sjukdom betyg mellan grupper, när man överväger de övergripande sjukdom svårighetsgrad15. Baserat på denna iakttagelse vi gjort använda av en 3-gradig skala för att utvärdera sjukdomsprogression vid EAE för att minska mus hanteringstid och således nöd för möss tillämpning av 3R-reglerna. En annan kritisk punkt med hjälp av EAE modellen för att studera skillnader mellan knockout och vildtyps-möss eller skillnader mellan behandlingsgrupperna är att inrätta en noggrann experimentell planering. Jämfört med vildtyp möss är knockoutmöss, är det viktigt att jämföra littermates med ursprung från heterozygot parningar för att säkerställa identiska genetiska bakgrunder av vildtyp och knockout möss jämfört i EAE experimentet. Det är också viktigt att hålla samma villkor för alla möss som ingår i ett experiment, e.g. bur förändringar, administration av våt mat, och särskilt musen bostadsförhållanden (hälsotillstånd). För att undvika bur-specifika fenomen inducerad av prövaren, bör cross-immunisering utföras. Mer exakt, om mer än en spruta behövs att vaccinera ett visst antal möss, bör de slumpmässigt tilldelas olika sprutor används. Den senare bör jämväl tillämpas för utförandet av behandlingsstudier. Sist men inte minst, hälsotillståndet hos möss inrymt i olika djurs faciliteter kan påverka sjukdomen incidens och svårighetsgrad och därmed mer21 eller mindre Mycobacterium tuberculosis22 kan krävas att inducera en korrekt klinisk sjukdom. Injektionsstället kan dessutom påverka sjukdomsutvecklingen. I detta protokoll föreslår vi att injicera relativt små volymer i fem olika subkutan platser: 30 µL till två flankerna, 20 µL till vänster och höger svans roten, och en liten droppe i nacken. Andra protokoll placeras 50 µL depåer subkutant till svans roten bara23 eller till de fyra sidor21. Injektioner av mindre depåer, dock minimera risken för orsakar hudirritation, som möss kan försöka skrapa.
In vivo permeabilitet kan utföras att bedöma BBB läckage under EAE men också att bedöma huruvida specifika genetiska borttagning av en molekyl eller en läkemedelsbehandling påverkar BBB integritet Invivo. Detta kan vara utförs antingen genom påvisande av endogena plasma spårämnen såsom IgG insättningar12 eller exogena trance som tillämpas till spridningen av en levande mus24. I detta protokoll gjorde vi användning av två olika exogena spårämnen (3 kDa och 10 kDa Dextran) som samtidigt var injiceras och tillåts cirkulera för en definierad tid 15 min. med två spårämnen med olika storlekar gör det möjligt för att bestämma svårighetsgraden av BBB dysfunktion och tillåta för att definiera en cutoff för tracer storlekar det diffusa eller inte över BBB. Fluorescerande dextrans är hydrofil polysackarider kännetecknas av bra vattenlöslighet, låg toxicitet, och låg relativt immunogenicitet. Dessutom består dextrans av poly-(α-D-1,6 glukos), som är resistenta mot klyvning av endogena cellulär glycosidases. Här använde vi dextran varianter som har lysin rester införlivas med dextran konjugatet. Lysinated dextrans är aldehyd fastställbara, vilket gör för att fixa spårämne i vävnaden. Förutom fluorescently märkt dextrans, kan andra kemikalier användas för att bedöma Invivo permeabilitet, t.ex., Hoechst färgämne i kombination med Evan's blue, som binder till en stor del till serum albumin. Hoechst fläckar BBB endotelceller atomkärnor foder CNS microvesselsna, och Evan's blue kan upptäckas i perivaskulär utrymmet på BBB dysfunktion och sprider vidare när den glia limitans är störd25,26. Däremot ger bedömer Invivo permeabilitet av Immunofluorescerande färgning av endogena markörer inblick i ansamling av, t ex IgG-molekyler eller fibrinogen, ett glykoprotein som cirkulerar i blodet, över tid. I sunda förhållanden, perivaskulär utrymmet är mycket smal och endothelial basalmembranet och den glia limitans förbinds nära och, således, visualisera de två ECM-hinder för NVU kräver laminin isoform-specifika antikroppar färgning27 .
Endogent IgG-molekyler är närvarande vid hälsa och sjukdom inuti blodkärlen samt som i vävnaden i circumventricular organ, där ingen BBB är etablerade12. I gen modifierade möss med hjärna barriären defekter, under läkemedelsbehandling eller under neuroinflammation endogena molekyler som normalt cirkulerar i blodet kan deponeras i CNS parenkymet, som kan visualiseras genom counterstaining med anti-laminin antikroppar som antingen erkänner alla laminin isoformer (pan-laminin antikroppar) eller laminin isoform-specifika antikroppar gör det möjligt för att skilja lamininer, laminin α4 och α5 från endotelceller basalmembranet och laminin α1 och laminin α2 från glia limitans. Under neuroinflammatoriska villkor kan perivaskulär utrymmet utvidgas genom att infiltrera immunceller som gör det möjligt för att identifiera både endothelial basalmembranet och den glia limitans med en pan-laminin-antikroppen. Counterstaining av lamininer närvarande vid NVU gör det möjligt för att bedöma om endogena men också exogena spårämnen deponeras i CNS parenkymet och counterstaining av CD45 gör det möjligt för att bedöma om fokala läckaget av BBB är associerade med immunceller infiltration.
Immunceller migration till CNS parenkymet kräver sekventiell passage av två distinkta hinder inom NVU, endothelial BBB och därefter i glia limitans28. Korsa glia limitans och CNS tillträdeet av immunceller korrelerar med uppkomsten av kliniska EAE29, medan CNS infiltrera celler fastnar i leptomeningeal och perivaskulär utrymmen utlösa inte kliniska EAE. Immunceller svällning i leptomeningeal och perivaskulär blanksteg mellan källaren membran har observerats i flera gen-modifierade musmodeller t.ex. L-selektin knockout möss30, TNF knockout möss23, MMP2/MMP9 dubbel knockoutmöss10 , och SYLT-B knockout möss12. Dessa fynd understreck att avsaknaden av dessa molekyler inte påverkar immunceller migration över BBB men snarare över den glia limitans, betonar att molekylära mekanismer medla immunceller migration över BBB och den glia limitans är distinkta. Hjärnan i situ zymography är en metod att undersöka för focal gelatinase aktivitet i en vävnad avsnitt i exakt rumslig korrelation till CNS patologi. Påvisande av Invivo BBB permeabilitet tillsammans med utför jordbaserad zymography för att upptäcka MMP2/MMP9 verksamhet således tillåter för att avgränsa endothelial kontra glia barriär störning i korrelation till immunceller infiltration. Kombination med pan-laminin och CD45 immunofluorescens färgning på EAE hjärnan sektioner, gör det både lokalisering av gelatinase aktivitet av unquenching DQ-gelatin och lokalisering av infiltrera immunceller samtidigt. Unquenching av fluorescein från DQ-gelatin resulterar i en typisk granulat ljusa grön fluorescens signal, medan fläckvis svagt fluorescerande grönområden på vävnadssnitt måste anses som ospecifik signal12. Således, noggrann utvärdering av vävnadssnitt och ordentliga kontroller är oumbärlig när du utför i situ zymography. I detta protokoll utfört vi i situ zymography i kombination med CD45 och laminin färgning. Primära antikroppar mot både CD45 och laminin inkuberades som en blandning på samma gång. Sekundära antikroppar inkuberades på samma sätt som en blandning i ett andra steg för färgning. En sådan kombination av antikroppar behöver tester för att säkerställa att andra skede antikroppar absorberas mot andra IgG för att undvika korsreaktivitet.
De protokoll som presenteras här tillsammans och tillhandahålla verktyg för att undersöka i detalj vilket element av NVU är nedsatt hos neuroinflammatoriska villkorar av EAE. In vivo permeabilitet bedömning av exogena spårämnen kan identifiera nuvarande försämring av mikrovaskulära endotelceller integritet eller nuvarande nedskrivning av NVU. Dessutom möjliggör införandet av spårämnen med olika storlekar för att uppskatta svårighetsgraden av BBB njurfunktion. Ytterligare jordbaserad zymography avslöjar fokala gelatinase aktivitet i astrocyterna och potentiellt inflammatoriska celler, som behövs för att bryta den glia limitans som ett sista hinder innan du får tillgång till CNS parenkymet10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt Lydia Sorokin, som har delat sin ursprungliga i situ zymography protokoll10 med oss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
References
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
- Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
- Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
- Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
- Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
- Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
- Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
- Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
- Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
- Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Miller, S. D., Karpus, W. J.
- Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
- Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
- Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
- Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
- Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
- Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
- Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
- Hawkins, B. T., Egleton, R. D.
- Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
- Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
- Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
- Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).
