Här presenterar vi protokoll för att undersöka nedsättning av neurovaskulära enheten under experimental autoimmune encephalomyelitis Invivo. Vi adress specifikt hur man bestämma blod – hjärnbarriären permeabilitet och gelatinase aktivitet deltar i leukocytmigration över den glia limitans.
Neurovaskulära enheten (NVU) består av mikrovaskulära endotelceller som bildar den blod – hjärnbarriären (BBB), en endothelial basalmembranet med inbäddade pericyter, och den glia limitans komponerad av parenkymal basalmembranet och astrocytic slutet-feed omfamna den abluminal aspekten av centrala nervsystemet (CNS) microvesselsna. Förutom att bibehålla CNS styr homeostas på NVU immunceller handel till CNS. Under immunosurveillance i CNS kan låga antalet aktiverade lymfocyter korsa endotel barriären utan att orsaka BBB dysfunktion eller klinisk sjukdom. Däremot under neuroinflammation såsom multipel skleros eller dess djurmodell kan experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) ett stort antal immunceller passera BBB och därefter den glia limitans så småningom nå CNS parenkymet leder till klinisk sjukdom. Immunceller migration till CNS parenkymet är således en tvåstegsprocess som innebär en sekventiell migrering över endothelial och gliaceller barriären för den NVU sysselsätter olika molekylära mekanismer. Om efter deras passage över endotel barriären, T-celler stöta deras cognate antigen på perivaskulär antigen-presenterande celler deras lokala reaktivering kommer inleda efterföljande mekanismer leder till fokal aktivering av gelatinases, som kommer att aktivera T-cellerna att korsa gliaceller barriären och ange CNS parenkymet. Således tillåter att bedöma både BBB permeabilitet och MMP aktivitet i rumslig korrelation till immunceller ackumulering i CNS under EAE för att ange förlust av integritet av endothelial och gliaceller hindren för NVU. Här visar vi hur man framkalla EAE i C57BL/6 möss av aktiv immunisering och därefter analysera BBB permeabilitet i vivo med en kombination av exogena fluorescerande spårämnen. Vi ytterligare Visa hur man visualisera och lokalisera gelatinase aktivitet i EAE hjärnor av jordbaserad zymogaphy kopplat till Immunofluorescerande infärgning av BBB källaren membran och CD45 + invaderande immunceller.
Det centrala nervsystemet (CNS) samordnar alla kropp och mentala funktioner hos ryggradsdjur, och CNS homeostas är avgörande för en korrekt kommunikation av nervceller. CNS homeostas rättsordning neurovaskulära enheten (NVU), som skyddar CNS från den föränderliga miljön i blodet. NVU består av CNS mikrovaskulära endotelceller, som är biokemiskt unika och upprätta den blood – brain barriären (BBB) i kontinuerlig överhörning med pericyter, astrocyter, nervceller och extracellulär matrix (ECM) komponenter, upprätta två distinkta källaren membran1. Endothelial basalmembranet som ensheathes den abluminal aspekten av BBB endotelceller hamnar en kick numrerar av pericyter och består av laminin α4 och laminin α5, förutom andra ECM proteiner2. Däremot parenkymal basalmembranet består av laminin α1 och laminin α2 och är omringad av astrocytic slutet-fötter. Parenkymal basalmembranet tillsammans med astrocyten slutet-fötterna komponerar den glia limitans som segregerar CNS neuronala nätverket från cerebrospinalvätska fylld perivaskulär eller subarachnoid utrymmen3. På grund av den unika arkitekturen av NVU är immunceller som människohandel i CNS skild från att i perifera vävnader eftersom det kräver en tvåstegsprocess med immuncellerna, först bryter mot endothelial BBB och därefter den glia limitans för att når CNS parenkymet.
Multipel skleros (MS) är en vanlig neuroinflammatoriska sjukdom i CNS, där ett stort antal cirkulerande immunceller ange CNS och orsaka neuroinflammation, demyelinisering och fokal förlust av BBB integritet4. Förlust av BBB integritet är en tidig MS, som anges av närvaron av gadolinium kontrast öka lesioner i CNS som visualiserade genom magnetisk resonanstomografi (MRT)5. Leukocyt extravasering till CNS uppstår i nivå med postcapillary venules; de exakta mekanismerna som är involverade i immunceller diapedesis över BBB basalmembranet och därefter gliaceller barriären återstår dock undersökas. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) fungerar som en djurmodell för MS och har väsentligt bidragit till vår nuvarande kunskap om MS patogenes. Exempelvis har med hjälp av EAE modellen man upptäckt att leukocyt extravasering sker i en process, inklusive en första fångsten och rullande steg medieras av selectins och mucin-liknande molekyler som P-selektin glykoprotein ligand (PSGL) -1, följt av integrin-beroende fast gripandet och genomsökning av T-celler på BBB endotelceller till tillåtande sidor för diapedesis6.
När T-celler har passerat endothelial BBB och endotel basalmembranet, behöver de stöta deras cognate antigen på makrofager och dendritiska celler strategiskt lokaliserade i leptomeningeal eller perivaskulär utrymmen. Denna interaktion inducerar fokal produktionen av pro-inflammatoriska mediatorer som utlöser de efterföljande mekanismerna krävs för CNS vävnad invasion av immunceller via glia limitans7,8,9. Focal aktivering av matrix-metalloproteinas (MMP) -2 och MMP-9 förändrar chemokine aktivering och inducerar nedbrytning av extracellulärmatrix receptorer på astrocyten slutet-fötter, som är en förutsättning för immun cell migration över den glia limitans i den CNS parenkymet och att framkalla kliniska symtomen av EAE10,11.
Läckage och gelatinase aktivitet i CNS vävnadssnitt kombinerar detektion av CNS infiltrera immunceller med BBB och ger värdefull information om funktionella integriteten av endothelial och gliaceller barriären i samband med neuroinflammation. Till exempel, vi nyligen undersökt konstituerande förlusten av endothelial åtsittande föreningspunkt molekyl Junktional vidhäftning molekylen (SYLT)-B i immunceller handel till CNS i samband med EAE. Jämfört med friska vildtyp C57BL/6 möss, friska JAM-B-brist littermates visade ingen försämring av BBB integritet som visas av Invivo permeabilitet bedömning använder endogena samt exogena spårämnen12. I samband med EAE, JAM-B-brist C57BL/6 möss visade förbättras sjukdomssymtom, som var associerade med inflammatoriska celler svällning i leptomeningeal och perivaskulär utrymmen12. För att undersöka detta fenomen vi tillämpat i situ zymography, möjliggör identifiering av gelatinase aktivitet för att testa om brist gelatinase aktivitet i SYLT-B-brist möss kan ansvara för det reducera antalet immunceller som kan bryta mot de glia limitans12.
Med tanke på tillgången på modifierade olika genetiskt mus modeller saknar, t.ex. olika BBB åtsittande föreningspunkt molekyler som kan orsaka förändringar i BBB funktion, metoder för att undersöka BBB integritet är viktigt. Nyutvecklade droger kan dessutom påverka NVU hinder. Här visar vi hur man framkalla EAE i C57BL/6 möss av aktiv immunisering med den myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)-peptid aa35-55 i komplett Freunds adjuvans. Sedan förklarar vi hur du lokalisera immunceller infiltration över NVU endothelial och gliaceller barriärer och studera Invivo endothelial och gliaceller barriär integritet genom jordbaserad upptäckt av exogena spårämnen och gelatinase aktivitet, respektive.
Här presenterar vi ett protokoll för att inducera och övervaka EAE i kvinnliga C57BL/6 möss. Honor är företrädesvis valt, och det finns en förekomst av kvinnor: män 3:1 i MS. För att bedöma svårighetsgraden av EAE, gjorde vi använder sig av ett 3-punkt scoring blad. EAE svårighetsgrad är generellt gjorde med avseende på svårighetsgraden av motor dysfunktioner. Möss med avancerade stadier av EAE, dvs uppvisar en poäng ovanför 2 bör offras för att undvika onödigt lidande för djuren. Därför är det…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner tacksamt Lydia Sorokin, som har delat sin ursprungliga i situ zymography protokoll10 med oss.
AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |