Prøveforberedelsemetode for skanning og overføring elektron mikroskop for vedlegg av treboring beetle
Summary
For å observere ultrastruktur av insektssensilla, skanning og overføring elektron mikroskopi (SEM og TEM, henholdsvis) prøveforberedelse protokoll ble presentert i studien. Tween 20 ble lagt inn i fikserende for å unngå prøvedeformasjon i SEM. Fluorescence mikroskopi var nyttig for å forbedre kutting nøyaktighet i TEM.
Abstract
Denne rapporten beskrev eksempelforberedelsesmetoder som skanner og overføreelektronmikroskopobservasjoner, demonstrert ved å forberede vedlegg av trebeleiningsboblen, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), for begge typer elektronmikroskopi. Skanningelektronmikroskopi (SEM) prøveforberedelsesprotokollen var basert på prøvekjemisk fiksering, dehydrering i en serie etanolbad, tørking og sputter-belegg. Ved å legge Tween 20 (Polyoxyehylene sorbitan laurate) til fikserende og vaskeløsningen, ble insektkroppsoverflaten av trebetebille vasket rent i SEM. Denne studiens transmisjonselektronmikroskopi (TEM) prøveforberedelse involverte en rekke trinn, inkludert fiksering, etanoldehydrering, innebygging i harpiks, posisjonering ved hjelp av fluorescensmikroskopi, snitting og farging. Fikserende med Tween 20 aktivert trenge insektkroppen veggen av treboring bille lettere enn det ville ha vært uten Tween 20, og senere bedre faste vev og organer i kroppen, dermed gitt klar overføring elektron mikroskop observasjoner av insekt sensilla ultrastructures. Det neste trinnet i dette preparatet var å bestemme posisjonene til insektssensilla i prøven innebygd i harpiksblokken ved hjelp av fluorescensmikroskopi for å øke presisjonen til målsensilla posisjonering. Denne forbedrede kuttingnøyaktigheten.
Introduction
Skanning elektronmikroskopi er et viktig verktøy i mange morfologistudier, at SEM viser overflatestrukturer1,2. Transmisjonelektronmikroskopi appell er at den kan brukes til å studere et bredt spekter av biologiske strukturer på nanometerskalaen, fra arkitekturen av celler og ultrastrukturen av organeller, til strukturen av makromolekylære komplekser og proteiner. TEM viser indre strukturer3,4,5.
Coleoptera er den største gruppen insekter, inkludert om lag 182 familier og 350.000 arter. De fleste av coleopteran insekter, spesielt trebeleielse bille, mate på planter, hvorav mange er viktige av skog og frukttrær, forårsaker ødeleggende skade på trær6. I dag har forebygging og kontroll av basert på kjemisk økologiteori fått økende oppmerksomhet7. Effektive, lavgiftige, forurensningsfrie feromonkontrollmetoder har blitt en effektiv måte8. Å studere sensilla morfologi og ultrastruktur av insekter er en viktig del av insektkjemisk økologiforskning. Skanning og overføring elektron mikroskopi (SEM og TEM, henholdsvis) brukes til stor effekt for å studere deres morfologi og indre anatomi. Under utarbeidelse av insektprøver for elektronmikroskopi (EM) kan imidlertid objektiviteten og ektheten av observasjonsstedet påvirkes9. Generelt krever SEM-prøvefremstilling av insekter rengjøring, vevfiksering, dehydrering, metatese, tørking og sputter-belegg10. På grunn av det komplekse miljøet der trebeleielsesbille lever, har kroppsoverflaten ofte ulike forurensende stoffer, og deres vedlegg har ofte mange fine lange sensilla eller bust. Spesielt er noen treborere ikke tilgjengelige fra laboratorieheving, som samles direkte i feltet, og deretter satt i festevæske for å sikre friskhet og deretter vasket i laboratoriet. Hvis prøven først er fast og deretter vasket, er det åpenbart mye vanskeligere å fjerne rusk fordi glutaraldehyd løser det sterkt til prøven. Tween 20 er en overflateaktivt11,12,13,14, som spiller en viktig rolle i vaskeprosessen, inkludert å redusere overflatespenningen av vann og forbedre fuktbarheten av vann på overflaten av vaskeriet. I denne studien ble Tween 20 lagt til festeløsningen og PBS rengjøringsløsning for å redusere væskeens overflatespenning, og forhindre at smusset avponerer på trehusboblens kroppsoverflate, noe som gjorde kroppsoverflaten renere i SEM.
Ved hjelp av TEM kan sensilla på forskjellige organer av insekter kuttes for å avsløre de klare strukturene inni dem, og dermed gi grunnlag for å analysere sensilla-funksjoner. Når motivet insekt, som trebeleielse bille, er stor, og dens kroppsvegg har en betydelig grad av sclerotization, slik at fiksering kan ikke fullt ut mette organvev inne i insektkroppen. Tween 20 kan forbedre spredning og suspensjon kapasitet av smuss. I denne studien ble Tween 20 lagt til fikserende for å forbedre fikserende væskepenetrasjon i insektlegemeveggen til trebeleiningsbille, unngå deformasjon og kollaps av epidermi11,12,13. I tillegg, ved hjelp av generell kuttteknologi, er det vanskelig å nøyaktig finne ulike typer sensilla, spesielt for noen små sensilla15. Basert på tradisjonell TEM-prøveforberedelse kombinerte denne studien fluorescensmikroskopi og SEM for å bestemme plasseringen av insektssensilla i den innebygde blokken, og dermed forbedre kuttnøyaktigheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen presenterte vi et prøveforberedelsesskjema for skanning og overføring elektronmikroskopi for trebeleiningsbille. Ved hjelp av insektvedlegg som representativt studiefag demonstrerte vi flere forbedringer over tradisjonelle prøveforberedelsesmetoder.
Flytende olje som slippes ut fra den faste overflaten er emulgert i små dråper, som kan spres godt og suspenderes i vaskemediet for å redusere redeponering på overflaten av objektet. Vaskeytelse av overflateaktivt middel i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi setter pris på den sjenerøse hjelpen fra Beijing Vocational College of Agriculture, Institute for Application of Atomic Energy (Chinese Academy of Agricultural Science), Bioresearch Center of Beijing Forestry University og professor Shan-gan Zhang fra Institutt for zoologi, det kinesiske vitenskapsakademiet. Denne forskningen ble støttet av National Key R&D Program of China (2017YFD0600103), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Forest Scientific Research in the Public Welfare of China (201504304), Indre Mongolia Agricultural University High-level Talent Research Startup Plan (203206038), og Indre Mongolia Autonome Region Higher Education Research Project (NJZZ18047), Indre Mongolia autonome regionen Linxue “Double First-class” Construction Project (170001).
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
References
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
- Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
- Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
- Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
- Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
- Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
- Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , 1-40 (2006).
- Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
- Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
- Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
- Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
- Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
- Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
- Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
- Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, 1-69 (1985).
- Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
- Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
- Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
- Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
- Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
- Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
- Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
- Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
- Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
- Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
- Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
- Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
- Graef, M. D. . Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , 1 (2003).
