Summary
ここでは、我々 はハチミツガの幼虫を用いた経口投与モデルの詳細なプロトコルを提供し、特徴付ける方法による自然免疫応答。このプロトコルを使用して、実用的な経験のない研究者はg. mellonellaメソッドを強制的を使用することができます。
Abstract
ホストの免疫システムの共生細菌の免疫原性の可能性の調査は、腸宿主微生物間相互作用の勉強 1 つの重要なコンポーネントです。まあ、別の共生生物が宿主の腸管免疫系を刺激するために異なる可能性を示すことを設立します。このような調査は、脊椎動物、特に齧歯動物を含みます。増加の倫理的な問題は、脊椎動物を含む実験でリンクされるので、無脊椎動物の代替モデルのための高需要があります。
ここでは、 g. mellonellaの免疫システムの共生非病原性細菌と共生生物の免疫原性の可能性の可能な評価を使用してハチミツガ経口投与モデルを提案します。G. mellonellaがvulgatus バクテロイデスや大腸菌など別の免疫原性の可能性と共生生物を分析できるようにする有用な代わりとなる無脊椎動物取り替えモデルであることを示します。興味深いことに、細菌を起こしません殺害に及ぼす幼虫は、哺乳類に似ています。G. mellonellaの免疫応答は、脊椎動物の生得の免疫反応と同等であったし、細菌の認識および抗菌分子の生産を含みます。G. mellonellaが復元前の微生物叢バランスを健全な哺乳類の個人から知られていることを提案します。G. mellonellaと脊椎動物の両方に匹敵する自然免疫応答を提供しが、 G. mellonellaは適応免疫系を抱いていません。生得の免疫組織の調査のコンポーネントが保存されて進化を遂げて以来、モデルで細菌の免疫原性プロパティの事前チェックと分析できます。
Introduction
腸内マイクロバイ オームの恒常性の維持のために不可欠なコンポーネントをおよび両方の自然免疫と適応免疫応答1,2が含まれます。共生微生物叢コミュニティは異なった主成分共生によって特徴付けられる: 重要な免疫調節機能と遺伝的傾向有害な影響を持つことができます pathobionts の有益な効果を与える共生ホストを促進・炎症性腸3,4をトリガーします。共生と pathobionts に関する多くの研究とその宿主の免疫系に及ぼす影響は、適応免疫応答を主に勉強して公開されています。
免疫原性の異なる細菌のスクリーニングを可能にする交換用のモデルを検索しよう以来、これらの研究を含む多くの動物調査及び保護のため、実験に使用される動物の交換が公共の利益を増やすことでプロパティ。昆虫、特にハチミツガは、感染症の研究で広く使用されている交換用のモデルです。G. mellonellaは、低コスト、高スループットなど別の利点を組み合わせた自然暴露経路である細菌の経口投与し、全身性感染症5,6のこと。G. mellonellaさらには哺乳類と細菌の病原性因子式5のための最適の生理的体温である 37 ° C で培養できます。G. mellonellaの主な利点は、保存された自然免疫系は非自己から自己の差別を有効にし、さまざまな apolipophorin やオプソニン ヘモリン6,のようなパターン認識の受容器を符号化する7. g. mellonella微生物認識時に異なるダウン ストリーム体液性免疫を引き起こすことができます。酸化ストレス応答を誘導でき、NOS (硝酸酸化酵素合成酵素) や NOX (NADPH オキシダーゼ)6,8の活動では、活性酸素種 (ROS) を分泌します。さらに、 G. mellonellaは、gloverin、moricin、セクロピン ディフェンシンのような gallerimycin6,などの異なるアンプの混合物の分泌による強力な抗菌ペプチド (AMP) の応答をアクティブに8,9,10。一般に、アンプはグラム陽性およびグラム陰性の細菌やカビに対して非常に広い宿主特異性を有し、昆虫の適応応答10本が欠けているので、強力な応答を提供する必要があります。Gloverin は細菌やカビに対してアクティブ アンプで、外膜形成6,11を抑制します。Moricins は、膜を貫通し、細孔9,11を形成グラム陽性およびグラム陰性の細菌に対する抗菌機能を展示します。Cecropins は細菌および真菌に対して活動を提供し、同様に moricins9,10のような膜を permeabilize します。Gallerimycin は抗真菌特性9ディフェンシンのようなペプチドです。興味深いことに、セクロピンと gallerimycin の組み合わせがエシェリヒア属大腸菌10に対して相乗的な活性を持っていたことが分かった。
自分の使いやすい文字g. mellonella幼虫が細菌の病原性を評価するために頻繁に使用される感染症モデル。特に、 G. mellonellaから得られるデータの研究は、この代替ホスト モデルの強度マウス サポートから得られたデータと関連付けてください。全身性感染症後にマウス感染モデルにおけるリステリア菌の最も病原血清型をg. mellonellaの高い死亡率につながるもわかった。さらに、以下の病原血清型が判明もg. mellonellaモデル12により少なく劇毒性であること。人間の病原真菌カンジダ ・ アルビカンスと同様の観測が行われました。病原性全身性感染症と幼虫生存率のモニタリングによって異なるC. albicansの系統が評価されました。マウス非病原性菌株も非病原性または展示マウス病原性菌株リードも高いため幼虫死亡率13に対し、 g. mellonella、病原性を削減します。G. mellonellaモデルは、緑膿菌14の 3 型分泌システム病原性要因を識別するためにさらに使用できます。
特に経口強制的に腸内共生生物を解析に適した方法を提供することに興味を持っていたg. mellonellaを含むほとんどの調査された全身性感染症のアプローチを使用して病原因子に焦点を当てたのでモデル、我々 幼虫ごと細菌の異なる用量を適用しだけでなく幼虫の死亡率を観察が腸内の恒常性を維持するために免疫反応の異なる特徴を分析します。
本手法は、我々 は細菌のアプリケーションおよび RNA 発現の解析を組み合わせるため交換用のモデルとしてg. mellonellaの使用を増やすのに役立ちます。じゃないだけ経口投与だけでなく全身性感染症後の死亡率の観察後の免疫応答の解析を含むとき病原細菌研究の意味を強化するために役立ちます。私たちの方法は、細菌の免疫原性の性質の解析非病原性共生生物だから生きている有機体の腸粘膜バリアーを提供することによって細胞培養よりも複雑な条件を提供します。
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Protocol
1. g. mellonellaの飼育や幼虫の実験のための準備
注: 終齢幼虫を卵からサイクルは約 5-6 週間かかります。
- ワックス蛾基板 (ひき割りトウモロコシ 22%、22% 小麦の食事、17.5% 蜜蝋、11% 脱脂粉乳、11% 蜂蜜、11% のグリセロール、5.5% の乾燥酵母) を含む 2 L ボックスに蛾の卵を転送します。暗闇の中で 30 ° C で繁殖全体を実行します。
- 新鮮な基板に小さく、小さい幼虫が表示されていたとき約 1-2 週間後に幼虫を含む基質の 25 g を転送します。サイズによると 2 週間後に幼虫を同期し、さらに 2 週間のワックス蛾基板上 2 L 容器に 30-40 の幼虫のグループを維持します。
- 重量によって実験の幼虫を選択します。180-200 mg の質量だけ薄いと高速移動幼虫を使用します。
2 栽培と経口投与用vulgatus バクテロイデスや大腸菌の作製
- 嫌気嫌気性の環境を作成するための瓶や袋を使用して 37 ° C で義務づける嫌気性菌バクテロイデス vulgatus mpk を成長 (参照材料表)15,16。2 日間B. vulgatusを育成し、ブレインハートインフュー ジョン (BHI) で一晩サブカルチャーを成長します。
- 37 ° C でルリア ベルターニカミラ (LB) スープの好気性条件下で通性嫌気性細菌エシェリヒア属大腸菌mpk を成長します。流体培養基 LB で一晩大腸菌を育成し、実験の日に 37 ° C で 2 h のサブカルチャーを成長します。
- 細菌の DPBS (ダルベッコ Phosphate-Buffered 生理食塩水) でペレットを再懸濁します 5 分 1,700 × gで遠心分離することで文化を収穫します。外径 600 nm 細菌文化の光学濃度 (OD) を決定し、細菌の濃度を計算します。細菌の濃度は、109/mL に調整されました。
3. 細菌懸濁液とg. mellonellaの幼虫の強制的
- 線量ごとの 10 の7菌を含む細菌調整の懸濁液の 10 μ L で各幼虫を強制的には。細菌懸濁液の経口投与の鈍終了針インスリン注射器を使用します。
- マイクロシリンジ ポンプ (図 1) 各幼虫に適用される懸濁液量の精度を確保するために注射器を修正 (材料の表を参照してください)。顎間慎重にシリンジを挿入します。下顎骨間シリンジを押し込まないでください。幼虫の口器を開き、挿入し、注射器を待ちます。
- 強制的に幼虫の処理するため潜在的なストレス反応を除外するモック背景コントロールとして 1-24 h. 使用 DPBS 投与幼虫間 37 ° C で暗闇の中で詰め込み幼虫を孵化させなさい。
4. 経口投与の幼虫と RNA の隔離の処理
- フードの下で動作し、安全眼鏡を着用します。RNase の混入を防ぐためにフードとスプレーの試薬をクリーンアップします。
- スナップ-生きている幼虫孵化後に凍結液体窒素とそれらをホモジナイズしてください。均質化のモルタルと雌しべを使用します。液体窒素モルタルとグリッドを幼虫個々 まで追加粉末ホモジネートを生産します。
- ボートの重量を量る使い捨てに磨砕液を注ぎ、蒸発させるため液体窒素を待ちます。
- 2 mL 管に 1 ml Trizol の粉末のホモジネートを冷凍窒素フリー液体を混合し、1 時間室温で混合物を孵化させなさい。
- 室温で 15 分間 8,000 × gで混合物を遠心分離機および新鮮なチューブに上清を移すペレットを破棄します。1-ブロモ-3-クロロ (BCP) の 200 μ L で上澄みをミックスします。ボルテックスし、混合物は室温で 5 分間と氷で 10 分間加温します。
- 遠心分離機の 4 ° C で 15 分間 18,000 × gで BCP 付加反応上の透明な層を新しい 2 mL チューブに転送し、残りを破棄します。5 分間チューブを反転と混合して 500 μ L のイソプロパノールを転送された上側のレイヤーの RNA を沈殿させます。
- 4 ° C で 15 分間 18,000 × gでチューブを遠心分離します。75% エタノール 500 μ L で沈殿した RNA の餌を洗います。
- 室温 5-10 分の RNA ペレットを乾燥します。上乾燥は後で解散するは難しいことが、注意してください。
- リボヌクレアーゼ阻害剤 (1: 100) ヌクレアーゼ フリー水を希釈し、溶液 100 μ L を使用して乾燥の RNA ペレットを再懸濁します。渦管、ペレットを完全に溶解するまで慎重に。
- メジャー RNA の質と量。260/280 の比率が約 2.0 と 260/230 比 2.0 2.2 (材料の表参照) の範囲内であることを確認します。
- DNase 消化のため隔離された RNA の 5 μ g を使用します。RNA およびヌクレアーゼ フリーでいっぱいの 5 μ g 水のバッファー、リボヌクレアーゼ阻害剤酵素の 1 μ L、DNase 酵素の 2 μ L x 10 のミックス 5 μ L、最大 50 μ L 室温 30 分間加温。
- 不活化試薬の 6 μ L を追加し、時折 RT と渦の反応で 2 分間インキュベートします。遠心分離機の新しい 1.5 mL チューブに 1 分転送上清の 10,000 x gで反応。
注: 幼虫の RNA として経口投与用それぞれの緊張の細菌の RNA、RNA が含まれます。
- 不活化試薬の 6 μ L を追加し、時折 RT と渦の反応で 2 分間インキュベートします。遠心分離機の新しい 1.5 mL チューブに 1 分転送上清の 10,000 x gで反応。
5. 強制的後細菌 16S コピー数の定量
注: 表現の細菌の 16S のコピー数は、4 章で抽出した RNA から合成した cDNA をにより決定されました。B. vulgatusや大腸菌の 16S PCR のフラグメントがクローニングしたプラスミドの標準曲線の助けを借りて、最終的な数量が計算されます。
- プラスミド基準の作成
- 大腸菌mpk またはB. vulgatus mpk PCR によるゲノム DNA からの 16S のフラグメントを増幅します。バッファー、1 μ L の 10 mM dNTP ソリューション、10 μ M 前方プライマーの 2.5 μ L および 2.5 μ 10 μ M 逆プライマー希釈、DMSO、ゲノム DNA テンプレートの 1 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 31.5 μ L、校正酵素の 0.5 μ L の 1 μ L x 5 のミックス 10 μ L。
- PCR を実行 (初期変性: 98 ° C、30 s、変性: 98 ° C、10 s、アニーリング: 60 ° C で 30 代、拡張: 72 ° C、30 s、最終的な拡張: 5 分、繰り返し変性、アニーリングおよび 30 サイクルの拡張のための 72 ° C)。
- 16S大腸菌プライマーを使用 (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) または 16 B. vulgatusプライマー (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) の増幅。
- クローニング ベクトルへの鈍終りのクローニングのためのエシェリヒア属大腸菌およびB. vulgatus 16S PCR のフラグメントを使用します。結紮を設定し、バッファー、非精製 PCR 産物の 1 μ、1 μ L の鈍終りのクローニング プラスミド、ヌクレアーゼ フリー水 7 μ、1 μ L T4 DNA リガーゼの × 2 の 10 μ L をミックスします。室温 10 分結紮を孵化させなさい
- 大腸菌DH5α 有能なセルを準備します。
- 一晩文化の 1 mL を三角フラスコに LB 培地 100 mL を接種します。外径 600 nm は 0.4 〜 0.6 の間までは、文化を育てます。2 つの 50 mL チューブに生成されたカルチャを分割し、10 分間氷の上文化を孵化させなさい。
- 遠心分離機の 4 ° C で 10 分間 1,700 x gで文化上澄みを廃棄し、慎重 RFI 溶液 5 mL にペレットを再懸濁します (30 mM CH3クック、100 mM KCl、10 mM 50 mM MnCl2、CaCl 調整 pH 5.8 氷河酸、滅菌フィルター)。RFI ソリューションの追加 45 mL で各管を埋めます。
- 遠心分離機の 4 ° C で 10 分間 1,700 x gで文化上澄みを廃棄し、RFII (10 mM モップ、CaCl2、15 mM 10 mM KCl、15% のグリセロール、オートクレーブ) 6 mL で慎重にペレットを再懸濁しますソリューション。両方の分数をプール、15 分準備細胞懸濁液因数 (200 μ L) の氷の上 12 mL サスペンションを孵化させなさい。因数-80 ° C で保存します。
- 有能なエシェリヒア属大腸菌の 1 つの因数に ligation の反作用を転送 DH5α 細胞と 15 分熱のため氷の上を残す反応ショック 45 セル 42 ° C で s の LB 培地 1 mL を追加。
- 37 ° C で 45 分の変換を孵化させなさいアンピシリンを含む LB 寒天培地プレートに変換の 100 μ L を追加し、37 ° C で一晩インキュベート
- 5.1.5 のステップの LB 寒天培地プレートからコロニー 8 結果 transformants の PCR を実行します。つまようじで各植民地を選ぶ、アンピシリン (マスター プレート) を含む新鮮な LB プレート上にそれを浸し、ヌクレアーゼ フリー水 PCR ストライプも含む 5.5 μ L に同じつまようじを浸し。
- 2 x PCR ミックスの 7.5 μ、10 μ M 前方プライマーの 0.5 μ、10 μ M 逆プライマー希釈の 0.5 μ L を追加します。セクション 5.1.1 に記載されている同じプライマーを使用します。
- PCR を実行 (初期変性: 95 ° C、5 分変性: 95 ° C 1 分、アニーリング: 60 ° C で 30 代、延長: 1 分、最後の拡張のための 72 ° C: 7 分、繰り返し変性、アニーリングおよび 35 サイクルの拡張のための 72 ° C)。
- 1% アガロースゲルの 16S フラグメントのサイズを確認します。0.5 x Tris ホウ酸 EDTA (TBE) バッファーを使用して、寒天 1 g を溶解し、電子レンジで沸騰させます。ゲル、それを注ぐ 1:50,000 染料を追加します。、ゲルのコロニー PCR の反作用と 100 bp の DNA の梯子を追加し、110 V で 45 分のためのゲルを実行します。
- 正しい挿入サイズを含む各のエシェリヒア属大腸菌およびB. vulgatus 16S プラスミド用のマスター プレート (セクション 5.1.6) から 1 つのクローンとアンピシリンを含む 5 mL LB 一晩文化を接種します。
- 1,700 x gで 2 mL 管細菌一晩文化を遠心します。上澄みを廃棄し、600 μ L の滅菌水にペレットを再懸濁します。
- 6 回チューブを反転して 100 μ L の換散バッファーとミックスを追加します。風邪 (4 ° C) の 350 μ l 添加中和ソリューションとチューブを反転で徹底的にミックス。
- 3 分遠心力で最大速度で遠心分離機回転カラムと 15 の遠心分離機で最大速度で遠心分離機に清 (~ 900 μ L) を転送 s。
- 吸収を破棄し、15 の遠心分離機で最大速度でエンドトキシン除去洗浄、遠心分離機の 200 μ L を追加 s。
- 列に洗浄ソリューションの 400 μ L を追加、30 s. 転送のため、遠心分離機で最大速度で遠心分離機のきれいな 1.5 mL チューブに列溶出バッファー列の 30 μ L インキュベートそれ室温で 1 分追加。
- 30 のため、遠心分離機で最大速度で遠心分離機 s (材料の表を参照してください)。
- 実用的なソリューション (各反作用のためのバッファーの 199 μ L あたり蛍光色素の 1 μ L) の 199 μ L でプラスミド DNA の 1 μ L を混合することによってプラスミド DNA 濃度を決定します。190 μ L の標準 2 の標準的な 1 または 10 μ L の 10 μ L を混合することによって 2 つの規格を準備渦サンプルおよび標準的なチューブと 2 分濃度測定のための反作用を孵化させなさい (材料の表を参照してください)。
- 標準濃度 10 100,000 コピーの範囲で 10 倍のシリアル希薄を準備: 計算単一のプラスミッドの質量 (m = (1.096x10 21 g/bp)、x (n) は n = プラスミド サイズ m = 質量)。プラスミド DNA の興味の目的のコピー番号を格納するために必要な量を計算 (目的の数をコピー x の単一のプラスミッドの質量 = 必要な DNA のプラスミッドの質量)。
- 定量用試料の調製
- CDNA を合成します。7 x バッファー 2 μ、1 μ L のヌクレアーゼ フリー水のセクション 4、11 μ L からの RNA の DNase 消化をミックスします。42 ° C で 2 分間インキュベートします。
- 氷の上の反応をすぐに配置します。RT バッファー、RT (逆転写酵素) プライマー ミックスの 1 μ L、RT 酵素の 1 μ L、ステップ 5.2.1 の反応 x 5 のミックス 4 μ L。42 ° C で 15 分間インキュベートします。RT 酵素を不活化する 95 ° C で 3 分間インキュベートします。
- 5.1.9 の手順に記載されている濃度のクマリンような cDNA を定量化します。
- CDNA を合成します。7 x バッファー 2 μ、1 μ L のヌクレアーゼ フリー水のセクション 4、11 μ L からの RNA の DNase 消化をミックスします。42 ° C で 2 分間インキュベートします。
- 細菌負荷の測定
- 5 に cDNA 濃度を調整する量的な PCR のための 12 の μ L 反応あたり ng。2 x RT-PCR ミックス、100 μ M 前方プライマーの 0.25 μ L、100 μ M 逆プライマー (5.1.1) の 0.25 μ L、12 μ L 調整 cDNA の混ぜます。QPCR を実行 (初期変性: 95 ° C、5 分変性: 95 ° C、10 s、アニーリング: 60 ° C、30 s、繰り返し変性、35 サイクル、溶融の熱処理: 95 ° C、4 ° C まで冷却)。
- 対応する ct 値 (y 軸) に対してプラスミド標準曲線 (10 100,000 コピー)、すなわち 1-5 (x 軸) のログ10濃度をプロットします。回帰式を取得する線形回帰を実行します。(濃度) x の方程式を解きます。Ct 値を数式に挿入してコピー数ログ10を計算するのに数式を使用します。コピーの番号を取得する逆対数を計算します。
6. 定量的 RT-PCR を用いた生得免疫マーカー遺伝子の定量
- プライマー PCR およびその後アガロースによる遺伝子特異性のゲル電気泳動法正しいフラグメント サイズを確認して確認してください。第 5.1.5 節で説明したような PCR を実行します。
ユビキチン 130 bp: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC に転送、逆に CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (ハウスキーピング)
Nox 4 159 bp: TGGCACGGCATCAGTTATCA、逆 ACAGCGACTGTCATGTGGAA8を転送
番76 bp: ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA、逆 GCCATTTTACAATCGCCACAA8を転送
Gst 156 bp: GACAGAAGTCCTCCGGTCAG、逆 TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8を転送
ApoIII 265 bp: AGACTTGCACGCCATCAAGA、逆 TGCATGCTGTTTGTCACTGC8を転送
ヘモリン 267 bp: CTCCCTCACGGAGGACAAAC、逆 GCCACGCACATGTATTCACC8を転送
gallerimycin 161 bp: GAAGTCTACAGAATCACACGA、逆 ATCGAAGACATTGACATCCA8を転送
セクロピン 158 bp: CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT、逆 GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8を転送
gloverin 101 bp: GTGTTGAGCCCGTATGGGAA、逆 CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8を転送
bp moricin 124: GCTGTACTCGCTGCACTGAT、逆 TGGCGATCATTGCCCTCTTT8に転送) - プライマーの効率を評価する E = 2。
- 2 μ L の 5-10 の異なる正のサンプル (すなわち、遺伝子のプライマー対を調査する必要がありますを表現しているサンプル) をプールします。
- サンプル プールの 1:5 希釈系列を調製する: 標準 1 (S1): プールを原液S2: S1 + 8 μ L ヌクレアーゼ フリー水 2 μ LS3: S2 + 8 μ L ヌクレアーゼ フリー水 2 μ LS4: S3 + 8 μ L ヌクレアーゼ フリー水 2 μ L。
- QPCR 96 ウェル プレートに 1 μ L の S1 S4 と非テンプレート コントロール (ヌクレアーゼ フリー水) を適用します。0.1 μ L/ウェル RT ミックスのヌクレアーゼ フリー水の 3.7 μ L、100 μ M 前方および逆プライマーを各 0.1 μ L RT マスター ミックスの 5 μ L を追加します。
- 定量的 RT-PCR を実行 (逆転写: 50 ° C 10 分、初期変性: 95 ° C、5 分変性: 95 ° C、10 s、アニーリング: 60 ° C、30 s、繰り返し変性、融点 40 サイクルの熱処理: 95 ° C、4 ° C まで冷却)。
- 印刷ログ S1 S4 (1、0.2、0.04、0.008) の相対的な単位の10 (x 軸) に対して対応する ct 値 (y 軸) です。線形回帰を実行し、標準の曲線の傾きを決定します。効率 e: E = 10-(1/slope)を計算します。20
注:-3.32 の斜面は、理想的な反応条件と E = 2.00 のプライマー効率を示します。つまり: 各サイクル中に PCR の製品の量が 2 倍します。
- 消化された RNA の使用 100 ng (100 ng/μ L) RT-PCR のテンプレートとして。ミックス RT-PCR 試薬と実行 RT-PCR 法に記載されているセクション 6.2 のましょう。ハウスキーピングのプライマーとターゲット プライマー対細菌および DPBS 管理のすべてのサンプルを測定します。ターゲットのプライマーとハウスキーピングのプライマーと S1 S4 効率の決定の同じプレートに S1 S4 希釈を実行する常に。
- 家事とターゲットのプライマー対の実験的決定プライマー効率を用いた次の式に従って RNA 遺伝子の発現の比 (R) を計算します。細菌を正規化コントロール20のモックを作成するためのサンプルを刺激します。
R: 比
Eターゲット: ターゲット プライマーと S1 4 の効率を測定
Eハウスキーピング: ハウスキーピング プライマーと S1 4 の効率を測定
Δctターゲット(コントロール サンプル): (DPBS 給電サンプルの ct) の Δct-(細菌供給サンプルの ct) 測定対象プライマー
Δctハウスキーピング(コントロール サンプル): (DPBS 給電サンプルの ct) の Δct-ハウスキーピング プライマーで測定 (細菌供給サンプルの ct)
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Representative Results
G. mellonella体液感染モデルは広く巨大な様々 な病原体の病原性因子を分析します。ほとんどの計測には、かなり簡単な方法です幼虫の死亡率の分析が含まれます。それにもかかわらず、このメソッドはない免疫反応についての結論を一般的に許可する、脊椎動物の免疫機構とg. mellonellaの免疫応答の結果をリンクします。G. mellonella経口投与モデル一方、まれにしか使用経口感染症または困難であるため幼虫の植民地化の正確な感染用量9を取得します。さらに、少しだけ非病原性細菌特に哺乳類の腸内共生生物に向かってG. mellonella免疫反応について知られています。
病原体とは対照的共生生物チャレンジ ホストとトリガーの免疫応答がホストの免疫システムは免疫恒常性を維持することができます。G. mellonellaは、最終的に細菌は検出されなかったもうまで (図 2)8初期の詰め込みの細菌負荷をオフにすることです。16 B. vulgatus エシェリヒア属大腸菌の遺伝子のコピー数が 24 h 以内大幅に減少します。
実証共生投与したG. mellonella幼虫は異なる免疫マーカー遺伝子の RNA 遺伝子発現を誘導する: LPS 認識分子 - apolipophorin (ApoIII) とヘモリン (図 3A, B)高いエシェリヒア属大腸菌に表現される一般的に示されていた- B. vulgatusと比較して幼虫を管理-幼虫8を投与します。さらに、2 種類の抗菌分子マーカー遺伝子の発現を監視できます。B. に比べて大腸菌強制的に誘導を強くなるために示されたNosとNox 4の遺伝子発現の測定による活性酸素および窒素種 (ROS/RNS) の生産を推定できます。vulgatus (図 4A, B)8。さらに、抗Gst遺伝子の発現には、(図 4C) を観察できます。8
さらに我々 は別の抗菌ペプチド発現をB. vulgatus強制的に応答よりも大腸菌投与後より強力な誘導された示した。セクロピン、moricin (図 5A, B, C, D)8、gloverin ペプチドの組合と相互作用するペプチド ディフェンシンのような gallerimycin の発現を観察した.
図 1:, マイクロシリンジ ポンプを使用してセットアップを強制的します。細菌の正確な注入が可能, マイクロシリンジ ポンプに鈍終了針を調整します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 強制的後ハチミツガの幼虫の細菌負荷の永続性です。B. vulgatus- と大腸菌の数をコピー-特定の 16s rDNA 遺伝子を 5 から求めた RT-PCR を使用して異なる時点で cDNA の ng。データ ポイントの中央値を示すが表示されます。参照 8 から変更。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: G. mellonellaによる細菌の差分パターン認識します。幼虫を投与し 2 つの異なる腸内共生生物と、RNA は 1-6 h 後分離された LPS 認識分子 apolipophorin (ApoIII) (A) と (B) ヘモリンの mRNA 発現が決定されました。データ ポイントを表す幾何平均を平均値の標準誤差と (SEM) (p > 0.05; *、p < 0.05; * *、p < 0.01; * * *、< p 0.001)。8この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ROS マーカー遺伝子発現細菌チャレンジ後。エシェリヒア属大腸菌およびB. vulgatus詰め込み、ROS 防衛マーカー遺伝子発現を時間をかけて行った。Nos(A)、 Nox 4 (B) およびGst (C) 隔離された幼虫 RNA mRNA の発現を測定しました。データ ポイントを表す幾何平均を平均値の標準誤差と (SEM) (p > 0.05; *、p < 0.05; * *、p < 0.01; * * *、< p 0.001)。参照 8 から変更。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: G. mellonella幼虫とひと上皮細胞共生誘起ディフェンシンのような抗菌ペプチド発現。幼虫はB. vulgatusや大腸菌を経口投与し、免疫反応が時間をかけてみ、RNA が幼虫の個体から分離されました。gallerimycin (A) セクロピン (B) gloverin (C) moricin (D) mRNA の発現を決定しました。データ ポイントを表す幾何平均を平均値の標準誤差と (SEM) (p > 0.05; *、p < 0.05; * *、p < 0.01; * * *、< p 0.001)。参照 8 から変更。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
G. mellonellaモデル全身性感染症アプローチ21で細菌の病原性因子を評価するために頻繁に使用されるモデルです。多くの病原体や細菌、口腔の植民地や感染ルート経由でホストを入力、新しい洞察力口腔植民地化および伝染のためのモデルとしてg. mellonellaの評価を発見する必要があります。
後部G. mellonella 15-37 ° C の間に可能性は大きな利点は、ほとんどの哺乳類モデル537 ° C の体温を維持します。G. mellonella幼虫はサプライヤーから購入することができますが、独自の繁殖人口の確立、アッセイに干渉、実験を開始するときは、推定をより抗生物質の不在など多くの利点を提供します。仕入先がないため常に輸送や温度変化に起因する準備段階とストレス反応における幼虫が回避されます。G. mellonellaの温度の許容のために繁殖を行うことが温度は高いです。高い温度が幼虫の飼育温度によると迅速な開発につながる、終齢幼虫を卵からライフ サイクルを見積もることができます。幼虫は、実験のために選ばれた、だけ薄いと高速移動個人が任意の応力と実験を妨害する免疫反応を避けるために選ばれました。
強制モデルを確立するために, 経口投与が成功したことを保証するため必要です。したがって、強いブロモフェノール色素は強制的向けソリューションに追加するいくつかの試験を設定すると便利でした。これは任意の負傷した幼虫を除外し、22自分の腸内でのみ青の色素を持っている幼虫を選択するのに役立ちます。
このモデルを使用して、 G. mellonella幼虫がある特定のマーカー遺伝子の生得の免疫反応の動力学を調査するため有用であることがわかった。経口投与モデルの確立および免疫反応の速度論の研究中に中腸におけるローカル表現ない遺伝子の発現を発見しました。共生細菌の経口投与後腸 RNA を抽出する最初の実験は、決定的な結果を提供しませんでした。したがって、免疫応答は、個人として全体で「グローバルに」決定されました。これらの調査結果は、腸内受容体を介したグローバルな認識の仮説、腸管外発現をトリガー信号の伝送をサポートします。一般的に、 G. mellonellaは脂肪体に主にアンプを誘導することができるが、さらに血球と腸システム9で。感染後G. mellonella幼虫における抗菌分子の組織固有の生産に関する正確な情報がないので全幼虫の RNA が完全な個人から抽出され RNA 遺伝子を試金するために使用式です。全幼虫の RNA 抽出のそれ以上の利点は、腸の細菌の負荷を定量化する可能性中生きた細菌の完全な原子格納容器です。腸の解剖は、準備のため細菌の損失につながる可能性があります。
細菌の病原性の特性のほとんどのg. mellonella研究を行うので、特に興味がある場合、幼虫が哺乳類の微生物叢の一部である非病原性細菌に対する免疫応答をトリガーする方法としました。最近では、 g. mellonellaと哺乳類の両方相同である生得の免疫反応の類似コンポーネントを共有し、進化的に保存しました。硝酸酸化窒素合成酵素 (Nos) と NADPH オキシダーゼ (Nox) 遺伝子は、類似度8の高度を共有します。G. mellonella港湾さらに哺乳類の β-ディフェンシン 2 と構造類似性を共有するディフェンシンなどの抗菌ペプチド gallerimycin8。
経口投与モデルを用いた抗炎症共生B. vulgatusまたはプロ炎症性 pathobioticエシェリヒア属大腸菌の細菌認識の差動を示すことは可能だった。さらに下流の酸化ストレス応答と抗菌ペプチッドの生産高いB. vulgatus管理8に比べて大腸菌投与後誘導されました。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は感染症研究 (DZIF) のためのドイツ センター同毛皮 Bildung und 上海虹橋 (BMBF)、DFG 研究訓練グループ 1708 DFG (SPP1656) によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
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