Summary
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un modello di somministrazione orale utilizzando larve di Galleria mellonella e come caratterizzare indotto risposte immunitarie innate. Usando questo protocollo, i ricercatori senza esperienza pratica sarà in grado di utilizzare la mellonella g. alimentazione forzata di metodo.
Abstract
L'indagine del potenziale immunogenico di batteri commensali il sistema immunitario dell'ospite è una componente essenziale nello studio di interazioni ospite-microbo intestinale. È affermato che diversi commensali esibiscono un diverso potenziale per stimolare il sistema immunitario intestinale di host. Tali indagini coinvolgono animali vertebrati, soprattutto roditori. Poiché crescenti preoccupazioni etiche sono collegate con esperimenti su vertebrati, c'è una forte domanda per i modelli di sostituzioni degli invertebrati.
Qui, forniamo un modello di somministrazione orale di Galleria mellonella utilizzando batteri commensali non patogeni e la possibile valutazione del potenziale immunogenico di commensali sul sistema immunitario mellonella g. . Dimostriamo che mellonella g. è un modello di sostituzione degli invertebrati alternativa utile che permette l'analisi di commensali con differente potenziale immunogenico quali Bacteroides vulgatus ed Escherichia coli. Interessante, i batteri hanno esibito alcun effetto di uccidere le larve, che è simile a quella dei mammiferi. Le risposte immunitarie di g. mellonella erano comparabili con la risposta immune innata dei vertebrati e coinvolgere il riconoscimento dei batteri e la produzione di molecole antimicrobiche. Proponiamo che mellonella g. era in grado di ristabilire l'equilibrio di microbiota precedente, che è ben noto da individui sani dei mammiferi. Anche se fornire risposte immunitarie innate paragonabile in entrambi mellonella g. e vertebrati, g. mellonella non porto un sistema immunitario adattativo. Poiché i componenti studiati del sistema immunitario innato sono evolutivi conservato, il modello consente un'analisi di preselezione e prima del batterica proprietà immunogeniche.
Introduction
Il microbioma intestinale è una componente essenziale per il mantenimento dell'omeostasi e coinvolge entrambi immunitaria innata e adattativa1,2. La comunità di microflora commensale è caratterizzata da diversi costituenti principali commensale: simbionti che conferiscono benefici effetti immunomodulatori importanti funzioni, e pathobionts che può avere effetti nocivi geneticamente predisposti ospita e promuovere e attivare l'infiammazione intestinale3,4. Molti studi su simbionti e pathobionts e la loro influenza sul sistema immunitario dell'ospite sono stati pubblicati soprattutto studiare risposte immunitarie.
Poiché questi studi coinvolgono molti animali per le indagini e la protezione e la sostituzione degli animali utilizzati per la sperimentazione è di crescente interesse pubblico, noi cerchiamo di trovare un modello di sostituzione per consentire una proiezione di diversi batteri immunogeno Proprietà. Gli insetti, soprattutto Galleria mellonella, sono un modello di sostituzione ampiamente usato nella ricerca di infezione. G. mellonella combina diversi vantaggi quali bassi costi e produttività elevata; consente la somministrazione orale di batteri, che è la via di esposizione naturale, e per infezioni sistemiche5,6. G. mellonella ulteriormente consente di incubazione a 37 ° C, che è la temperatura corporea fisiologica di mammiferi e l'optimum per la virulenza batterica fattore espressione5. Il vantaggio principale di g. mellonella è conservato sistema immune innato che consente la discriminazione di sé dal non-sé e codifica per una varietà di recettori di riconoscimento di pattern come apolipophorin o l'opsonina hemolin6, 7. al momento della rilevazione di microbo, g. mellonella può innescare diverse risposte immunitarie umorali a valle. Può indurre risposte allo stress ossidativo e secernono le specie reattive dell'ossigeno (ROS) che coinvolge l'attività della NOS (ossidasi nitrico sintasi) e NOX (NADPH ossidasi)6,8. Inoltre, g. mellonella attiva una risposta potente peptide antimicrobico (AMP), che provoca la secrezione di una miscela di diversi amplificatori quali gloverin, moricin, cecropin o la defensina-come gallerimycin6, 8,9,10. Generalmente, AMPs hanno specificità d'ospite piuttosto ampio contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi e funghi e devono fornire una risposta potente poiché gli insetti stanno mancando qualsiasi risposta adattativa10. Gloverin è un amplificatore attivo contro batteri e funghi e inibisce la formazione della membrana esterna6,11. Moricins esibiscono la loro funzione antimicrobica contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi di penetrare la membrana e formando un poro9,11. Cecropine fornire attività contro batteri e funghi e permeabilize la membrana allo stesso modo come moricins9,10. Gallerimycin è un peptide defensina-come con proprietà anti-fungine9. Interessante, è stato trovato che la combinazione di cecropin e gallerimycin aveva un'attività sinergica contro Escherichia coli10.
A causa del loro carattere easy-to-use mellonella g. larve sono un modello di infezione spesso usato per valutare la patogenicità batterica. In particolare, studi in cui i dati ottenuti da g. mellonella correlano con i dati ottenuti da topi sostegno la forza di questo modello di host alternativi. Si è constatato che i sierotipi più patogeni di Listeria monocytogenes in un modello di infezione di topo conducono anche a più alti tassi di mortalità in g. mellonella dopo infezione sistemica. Inoltre, meno virulenti sierotipi che si è rivelati per essere anche meno virulento in g. mellonella modello12. Osservazioni simili sono stati fatti con i funghi patogeni umani Candida albicans. Virulenza di diversi albicans del c. ceppi è stato valutato dall'infezione sistemica e successivo monitoraggio di sopravvivenza larvale. Ceppi non virulenti del mouse erano anche non virulenti o esposte ridotta virulenza in mellonella g., mentre i ceppi virulenti del mouse conducono anche ad alta mortalità larvale13. Il modello g. mellonella ulteriormente possa essere utilizzato per identificare fattori di patogenicità di tipo 3 secrezione sistema di Pseudomonas aeruginosa14.
Poiché la maggior parte delle indagini che coinvolgono mellonella g. erano concentrata su fattori di virulenza utilizzando l'approccio di infezione sistemica eravamo particolarmente interessati a fornire un metodo adatto per l'analisi dei commensali intestinali in un'alimentazione orale forzata modello in cui possiamo applicare un dosaggio distinto di batteri per le larve e non solo osservare il tasso di mortalità larvale ma analizzare diversi tratti distintivi della risposta immunitaria innata per mantenere l'omeostasi intestinale.
Il nostro metodo contribuisce ad per aumentare l'uso di g. mellonella come un modello di sostituzione poiché uniamo l'applicazione dei batteri e l'analisi di espressione di RNA. Non solo è utile per rafforzare il significato degli studi di patogenesi batterica quando si include l'analisi delle risposte immunitarie dopo somministrazione orale e non solo l'osservazione dei tassi di mortalità dopo infezione sistemica. I nostri metodi consente per l'analisi delle proprietà immunogeniche di batterico non patogeni commensali poiché è offre condizioni più complesse rispetto a coltura cellulare offrendo una barriera intestinale in un organismo vivente.
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Protocol
1. g. mellonella allevamento e preparazione delle larve per gli esperimenti
Nota: Il ciclo da uovo ad instar Ultima larva dura circa 5-6 settimane.
- Trasferire le uova deposte da lepidotteri adulti per scatole da 2 L substrato Tarma della cera (granulosità di cereale del 22%, 22% di farina di frumento, 17,5% cera d'api, 11% latte scremato in polvere, miele di 11%, 11% glicerolo, lievito essiccato di 5.5%). Eseguire l'intero allevamento a 30 ° C al buio.
- Trasferire 25 g di substrato contenente le larve nel substrato fresco dopo circa 1-2 settimane, quando le larve di piccole e piccolissime erano visibili. Sincronizzare le larve dopo 2 settimane in base alle loro dimensioni e mantenere gruppi di 30-40 larve in contenitori 2 L su substrato di tarma della cera per 2 settimane supplementari.
- Selezionare le larve per esperimenti di peso. Utilizzare solo pallide e veloce movimento larve con una massa di 180-200 mg.
2. coltivazione e preparazione di Bacteroides vulgatus ed Escherichia coli per somministrazione orale
- Crescere il batterio anaerobico obbligano Bacteroides vulgatus mpk a 37 ° C anaerobicamente utilizzando vasi e bustine per la creazione di un ambiente anaerobico (vedere Tabella materiali)15,16. Coltivare b. vulgatus per 2 giorni e crescere una sottocultura pernottamento in brodo di cervello cuore infusione (BHI).
- Crescere la mpk di Escherichia coli batterio anaerobico facoltativo in condizioni aerobiche in brodo di Luria-Bertani (LB) a 37 ° C. Coltivare e. coli pernottamento in libbra di brodo e far crescere la sottocultura per 2 h a 37 ° C il giorno dell'esperimento.
- Raccogliere le culture mediante centrifugazione a 1.700 x g per 5 min. Risospendere il batterico pellet in DPBS (di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Determinare la densità ottica (OD) di colture batteriche a OD 600 nm e calcolare le concentrazioni batteriche. Le concentrazioni batteriche sono state adeguate a 109/ml.
3. alimentazione forzata delle larve di g. mellonella con sospensioni batteriche
- Ingozza ogni larva con 10 µ l di sospensione batterica adattata contenente 107 batteri per dose. Utilizzare una siringa da insulina con ago smussato-conclusa per applicazione orale della sospensione batterica.
- Difficoltà la siringa nella pompa microsiringa (Figura 1) per assicurare l'accuratezza del volume sospensione applicata ad ogni larva (Vedi Tabella materiali). Inserire la siringa con attenzione tra le mandibole. Non forzare la siringa tra le mandibole. Attendere per le larve di aprirlo apparato boccale e poi inserire la siringa.
- Incubare le larve ad alimentazione forzate al buio a 37 ° C tra le larve di h. 1-24 uso DPBS-amministrato come sfondo finto controlli per escludere potenziali risposte allo stress indotte a causa della gestione delle larve durante l'alimentazione forzata.
4. elaborazione di larve somministrate per via orale e di isolamento del RNA
- Lavorare sotto una cappa e indossare occhiali di sicurezza. Pulire il cappuccio e spray reagente per evitare la contaminazione RNasi.
- Snap-congelare le larve viventi dopo incubazione in azoto liquido e omogeneizzarle. Utilizzare un mortaio e un pistillo per omogeneizzazione. Aggiungere azoto liquido per il mortaio e la griglia ogni individuo larvale fino a quando non sono prodotti in polvere omogeneati.
- Versare l'omogeneizzato per un USA e getta pesatura barca e attendere che l'azoto liquido evapori.
- Mescolare il liquido esente da azoto congelato omogeneati in polvere con 1 mL di Trizol in una provetta da 2 mL e incubare la miscela a temperatura ambiente per 1 h.
- Centrifugare la miscela a 8.000 x g per 15 min a temperatura ambiente e trasferire il surnatante in una nuova provetta e gettare il pellet. Mescolare il surnatante con 200 µ l di 1-Bromo-3-cloropropano (BCP). Vortex e incubare la miscela per 5 min a temperatura ambiente e per 10 minuti in ghiaccio.
- Centrifugare le reazioni BCP-aggiunto a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C. Trasferire lo strato superiore trasparente in una nuova provetta da 2 mL e scartare il resto. Precipitare il RNA dello strato superiore trasferito con 500 µ l isopropanolo miscelazione ed invertendo il tubo per 5 min.
- Centrifugare la provetta a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C. Lavare il precipitato pellet di RNA con 500 µ l di etanolo al 75%.
- Asciugare il pellet di RNA per 5-10 minuti a TA. Fare attenzione a non sopra a secco come sarà difficile da sciogliere più tardi.
- Diluire l'inibitore della ribonucleasi (1: 100) in acqua priva di nucleasi e utilizzare 100 µ l della soluzione per risospendere il pellet di RNA secco. Vortice il tubo con attenzione fino a quando la pallina è completamente sciolto.
- Misura RNA qualità e quantità. Assicurare che il rapporto di 260/280 è approssimativamente 2.0 e 260/230 rapporto nella gamma di 2.0-2.2 (Vedi Tabella materiali).
- Utilizzare 5 µ g di RNA isolato per digestione dnasi. Mix 5 µ l di tampone, 1 µ l di enzima inibitore della ribonucleasi, 2 µ l di enzima dnasi: 10x, 5 µ g di RNA e riempire con nucleasi-libero dell'acqua fino a 50 µ l. Incubare per 30 minuti a TA.
- Aggiungere 6 µ l di reagente di inattivazione e incubare per 2 min a RT e vortice reazione occasionalmente. Centrifugare la reazione a 10.000 x g per 1 min. trasferimento surnatante in provetta da 1,5 mL fresco.
Nota: il RNA contiene il RNA larvale, come pure il RNA batterico del rispettivo ceppo utilizzato per la somministrazione orale.
- Aggiungere 6 µ l di reagente di inattivazione e incubare per 2 min a RT e vortice reazione occasionalmente. Centrifugare la reazione a 10.000 x g per 1 min. trasferimento surnatante in provetta da 1,5 mL fresco.
5. quantificazione dei numeri batterici 16S copia dopo alimentazione forzata
Nota: I numeri di copia del 16S batterica espressa è stato determinato usando il cDNA sintetizzato dal RNA estratto nella sezione 4. Quantificazione finale viene calcolato con l'aiuto di una curva standard del plasmide in cui è stato clonato il frammento della PCR 16S di b. vulgatus o e. coli .
- Preparazione di standard di plasmide
- Amplificare i frammenti 16S da e. coli mpk o b. vulgatus mpk DNA genomic di PCR. Miscelare 10 µ l di tampone, 1 µ l di soluzione dNTP 10 mM, 2,5 µ l di primer in avanti di 10 µM e 2,5 µ l della diluizione di 10 µM primer reverse, 1 µ l di DMSO, 1 µ l della mascherina del DNA genomico, 31,5 µ l di acqua priva di nucleasi e 0,5 µ l di enzima di bozze: 5x.
- Eseguire la PCR (denaturazione iniziale: 98 ° C per 30 s, denaturazione: 98 ° C per 10 s, ricottura: 60 ° C per 30s, estensione: 72 ° C per 30 s, estensione finale: 72 ° C per 5 min, ripetere la denaturazione, ricottura ed estensione per 30 cicli).
- Utilizzare 16S Escherichia coli primer (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) o primer b. vulgatus 16S (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) per amplificazione.
- Utilizzare i frammenti PCR 16S e. coli e b. vulgatus per clonazione smussato-fine in un vettore di clonazione. Impostare la pagina di legatura e mescolare 10 µ l di tampone, 1 µ l di prodotto di PCR non purificate, 1 µ l di plasmide clonazione smussato-fine, 7 µ l di acqua priva di nucleasi e 1 µ l di T4 DNA ligasi: 2x. Incubare la legatura per 10 minuti a TA.
- Preparare le celle competenti DH5α di e. coli .
- Inoculare 100 mL di LB medium in un matraccio di Erlenmeyer con 1 mL di una coltura durante la notte. Far crescere la cultura fino a OD 600 nm è compreso tra 0.4-0.6. Dividere la cultura risultante in due provette da 50 mL e incubare le colture in ghiaccio per 10 min.
- Centrifugare le culture a 1.700 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante e risospendere ogni attentamente con 5 mL di soluzione RFI (30mm CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, MnCl2, regolare il pH 5,8 con acido glaciale, sterile filtrata). Riempire ogni provetta con ulteriori 45 mL di soluzione RFI.
- Centrifugare le culture a 1.700 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante e risospendere ogni attentamente con 6 mL di RFII (MOPS di 10 mM, 15 mM CaCl2, 10mm KCl, 15% glicerolo, sterilizzato nell'autoclave) soluzione. Piscina sia frazioni e incubare la sospensione di 12 mL in ghiaccio per aliquote per la sospensione delle cellule di 15 min. Prepare (200 µ l). Conservare le aliquote a-80 ° C.
- Trasferire la reazione di legatura ad un'aliquota del competente Escherichia coli cellule DH5α e lascia la reazione sul ghiaccio per 15 min. Heat shock le cellule per 45 s a 42 ° C e aggiungere 1 mL di terreno LB.
- Incubare la trasformazione per 45 min a 37 ° C. Aggiungere 100 µ l della trasformazione ad una piastra di agar LB contenente ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C.
- Eseguire PCR di 8 trasformanti risultante della Colonia dalla piastra di agar LB di passaggio 5.1.5. Scegli ogni Colonia con uno stuzzicadenti, immergerlo in un fresco piatto LB contenente ampicillina (master piatto) e poi immergere lo stesso stuzzicadenti in un contenente 5,5 µ l di acqua esente da nucleasi in una striscia PCR.
- Aggiungere 7,5 µ l di miscela di x PCR 2, 0,5 µ l di primer in avanti di 10 µM e 0,5 µ l della diluizione di reverse primer 10 µM. Utilizzare le stesse coppie di primer menzionate nella sezione 5.1.1.
- Eseguire PCR (denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min, denaturazione: 95 ° C per 1 min, ricottura: 60 ° C per 30s, estensione: 72 ° C per 1 min, estensione finale: 72 ° C per 7 min, ripetere la denaturazione, ricottura ed estensione per 35 cicli).
- Verificare la dimensione dei frammenti 16S su gel di agarosio 1%. Utilizzare il buffer di Tris-Borato-EDTA (TBE) x 0,5 per sciogliere 1 g di agarosio e portare a ebollizione in un forno a microonde. Aggiungere colorante 1: 50.000 per gel e versarlo. Aggiungere le reazioni di PCR di Colonia e un DNA ladder 100 bp al gel ed eseguire il gel per 45 min a 110 V.
- Inoculare una cultura di pernottamento LB 5 mL contenente ampicillina con un clone dalla piastra di master (sezione 5.1.6) per ogni e. coli e b. vulgatus del plasmide 16S che contiene la dimensione inserto giusto.
- Centrifugare le colture batteriche durante la notte in una provetta da 2 mL a 1.700 x g. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in acqua sterile di 600 µ l.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi e mescolare capovolgendo la provetta 6 volte. Aggiungere 350 µ l di freddo (4° C) soluzione di neutralizzazione e miscelare accuratamente capovolgendo la provetta.
- Centrifugare a massima velocità in una centrifuga per 3 min. trasferire il surnatante (~ 900 µ l) per una colonna di spin e centrifugare a massima velocità in una centrifuga per 15 s.
- Scartare l'attraversamento e aggiungere 200 µ l di endotossina rimozione lavaggio e centrifuga alla massima velocità in una centrifuga per 15 s.
- Aggiungere 400 µ l di soluzione di lavaggio alla colonna e centrifugare in una centrifuga alla massima velocità per 30 s. trasferimento della colonna in una provetta pulita 1,5 mL, 30 µ l di tampone di eluizione per la colonna viene quindi incubato per 1 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare a massima velocità in una centrifuga per 30 s (Vedi Tabella materiali).
- Determinare la concentrazione di DNA del plasmide mescolando 1 µ l di DNA plasmidico con 199 µ l di soluzione di lavoro (1 µ l di colorante fluorescente a 199 µ l di tampone per ciascuna reazione). Preparare due standard mescolando 10 µ l di standard 1 o 10 µ l di campione 2 con 190 µ l. Vortexare il campione e tubi standard e incubare la reazione per 2 min. misura della concentrazione (Vedi Tabella materiali).
- Preparare le concentrazioni standard in diluizioni seriali 10 volte in un intervallo di 10-100.000 copie: calcolo della massa del plasmide singolo (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = dimensione del plasmide, m = massa). Calcolare la massa del plasmide DNA necessario a contenere il numero di copie desiderato di interesse (copiare il numero di interesse x massa del plasmide singolo = massa del plasmide DNA necessario).
- Preparazione dei campioni per la quantificazione
- Sintesi di cDNA. Mescolare 2 µ l di tampone di 7x, 1 µ l di RNA dnasi-digerito da sezione 4 e 11 µ l di acqua esente da nucleasi. Incubare per 2 min a 42 ° C.
- Mettere reazione immediatamente sul ghiaccio. Mix 4 µ l di 5 x RT Buffer, 1 µ l di miscela di primer RT (trascrittasi inversa), 1 µ l di enzima RT e la reazione del punto 5.2.1. Incubare per 15 min a 42 ° C. Incubare per 3 min a 95° C per inattivare l'enzima RT.
- Quantificare il cDNA concentrazioni fluorometrically come descritto nel passaggio 5.1.9.
- Sintesi di cDNA. Mescolare 2 µ l di tampone di 7x, 1 µ l di RNA dnasi-digerito da sezione 4 e 11 µ l di acqua esente da nucleasi. Incubare per 2 min a 42 ° C.
- Misurazione della carica batterica
- Regolare le concentrazioni di cDNA a 5 ng per reazione a 12 µ l per PCR quantitativa. Mescolare 2 x RT-PCR mix, 0,25 µ l di primer in avanti di 100 µM, 0,25 µ l di primer reverse a 100 µM (5.1.1) e 12 µ l di cDNA regolato. Eseguire qPCR (denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min, denaturazione: 95 ° C per 10 s, ricottura: 60 ° C per 30 s, ripetere la denaturazione e ricottura per 35 cicli, fusione: 95 ° C, raffreddare a 4 ° C).
- Tracciare le concentrazioni di10 registro della curva standard plasmide (10-100.000 copie), vale a dire 1-5 (asse x), contro i corrispondenti valori di ct (asse y). Eseguire la regressione lineare per ottenere l'equazione di regressione. Risolvere l'equazione per x (concentrazione). Utilizzare la formula per calcolare il log10 dei numeri copia inserendo ct-valore nella formula. Calcolare l'antilogaritmo per ottenere i numeri di copia.
6. determinazione del gene marcatore immune innata mediante RT-PCR quantitativa
- Controllare gli iniettori per gene-specificità di PCR e successiva dell'agarosi elettroforesi per verificare la dimensione del frammento corretto. Eseguire PCR come descritto nella sezione 5.1.5.
Di Ubiquitin 130 bp: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC in avanti, retromarcia CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (giornaliere)
Bp Nox-4 159: TGGCACGGCATCAGTTATCA, reverse ACAGCGACTGTCATGTGGAA8 in avanti
Nos 76 bp: ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, reverse GCCATTTTACAATCGCCACAA8 in avanti
Gst 156 bp: GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, reverse TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8 in avanti
ApoIII 265 bp: AGACTTGCACGCCATCAAGA, reverse TGCATGCTGTTTGTCACTGC8 in avanti
hemolin 267 bp: CTCCCTCACGGAGGACAAAC, reverse GCCACGCACATGTATTCACC8 in avanti
bp gallerimycin 161: GAAGTCTACAGAATCACACGA, reverse ATCGAAGACATTGACATCCA8 in avanti
bp cecropin 158: CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, reverse GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8 in avanti
bp gloverin 101: GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, reverse CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8 in avanti
bp moricin 124: GCTGTACTCGCTGCACTGAT, reverse TGGCGATCATTGCCCTCTTT8in avanti) - Valutare l'efficienza di primer per essere E = 2.
- Piscina 2 µ l di 5-10 differenti campioni positivi (cioè, campioni che esprimono il gene per il quale la coppia di primer deve essere studiato).
- Preparare una serie di diluizioni 1:5 della piscina del campione: campione 1 (S1): non diluito piscina; S2: 2 µ l di S1 + 8 µ l nuclease-free water; S3: 2 µ l di S2 + 8 µ l nuclease-free water; S4: 2 µ l di S3 + 8 µ l nuclease-free water.
- Applicare 1 µ l di S1-S4 e un controllo non modello (acqua priva di nucleasi) ad una piastra a 96 pozzetti qPCR. Aggiungere 5 µ l di mix master RT, 0,1 µ l di ogni primer forward e reverse di µM 100, 3,7 µ l di acqua priva di nucleasi e 0,1 µ l di miscela di RT per bene.
- Eseguire RT-PCR quantitativa (trascrizione inversa: 50 ° C per 10 min, denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min, denaturazione: 95 ° C per 10 s, ricottura: 60 ° C per 30 s, ripetere la denaturazione e ricottura per 40 cicli di fusione: 95 ° C, raffreddare a 4 ° C).
- Trama log10 di unità relative per S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0,008) (asse x) contro i corrispondenti valori di ct (asse y). Eseguire la regressione lineare e determinare la pendenza della curva standard. Calcolare l'efficienza e: E = 10-(1/slope). 20
Nota: Una pendenza di -3.32 indica condizioni di reazione ideale e l'efficienza di primer di E = 2.00. Ciò significa: la quantità di prodotto di PCR si raddoppia durante ogni ciclo.
- Uso 100 ng di RNA digerito (100 ng / µ l) come modello per la RT-PCR. Reagenti mix RT-PCR e RT-PCR esecuzione come accennato nella sezione 6.2. Misurare tutti i campioni di batteri e DPBS amministrati con coppia di primer di pulizie sia coppie di primer di destinazione. Sempre eseguire le diluizioni S1-S4 con la coppia di primer di pulizie e S1-S4 con la coppia di primer di destinazione nello stesso piatto per la determinazione di efficienza.
- Calcolare il rapporto (R) dell'espressione genica RNA secondo la formula seguente utilizzando l'efficienza di primer determinato per via sperimentale sia la pulizia che la coppia di primer di destinazione. Normalizzare i batteri stimolato campioni a deridere controlli20.
R: rapporto
Edestinazione: efficienza di S1-4 misurata con coppia di primer di destinazione
Eservizio di pulizie: efficienza di S1-4 misurata con coppia di primer di pulizie
Δctdestinazione(campione di controllo): Δct (CT del campione DPBS-fed)-(ct di batteri-Federazione campione) misurato con coppia di primer di destinazione
Δctdelle pulizie(campione di controllo): Δct (CT del campione DPBS-fed)-(ct di batteri-Federazione campione) misurato con coppia di primer di pulizie
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Representative Results
Il modello di infezione g. mellonella emolinfa in ampiamente usato per analizzare i fattori di virulenza di una grande varietà di agenti patogeni. Maggior parte delle misure comprendono l'analisi della mortalità di larve, che è un metodo abbastanza facile. Tuttavia, questo metodo non consentono conclusioni sulle risposte immunitarie in generale e collegare i risultati delle risposte immunitarie mellonella g. con meccanismi immuni vertebrati. Il modello di somministrazione orale di mellonella g. d'altra parte è solo raramente utilizzato per infezione orale o colonizzazione delle larve a causa delle difficoltà ottenere infezione esatto dosaggio9. Inoltre, solo piccolo è conosciuto circa mellonella g. risposta immune innata verso batteri non patogeni soprattutto mammiferi commensali intestinali.
In contrasto con gli agenti patogeni, commensali sfidano le risposte immunitarie ospite e grilletto ma il sistema immunitario dell'ospite è in grado di mantenere l'omeostasi immunitaria. Mellonella g. è in grado di azzerare la carica batterica ad alimentazione forzata iniziale fino a quando finalmente non batteri erano rilevabili piu ' (Figura 2)8. Il 16s numero di copie del gene di b. vulgatus e di Escherichia coli ha fatto diminuire sostanzialmente entro 24 h.
Abbiamo dimostrato che somministrato commensal mellonella g. larve inducono espressione genica RNA dei geni marcatori diversi immunità innata: molecole LPS-riconoscimento - apolipophorin (ApoIII) e hemolin (Figura 3A, B) sono stati indicati per essere generalmente superiore espressa in e. coli-amministrato larve rispetto a b. vulgatus-amministrato larve8. Ulteriormente, l'espressione del gene marcatore dei due tipi di molecole antimicrobiche possa essere monitorato. La produzione di ossigeno reattivo e specie dell'azoto (ROS/RNS) può essere stimata mediante la misurazione dell'espressione di gene di Nos e Nox-4 che sono stati dimostrati per essere fortemente aumentata all'alimentazione forzata di e. coli rispetto al B. vulgatus (Figura 4A, B)8. Inoltre, l'espressione genica di antiossidanti Gst potrebbe essere osservato (Figura 4C). 8
Inoltre abbiamo dimostrato che l'espressione di diversi peptidi antimicrobici è stata indotta più forte dopo la somministrazione di Escherichia coli che in risposta a b. vulgatus alimentazione forzata. Abbiamo osservato il upregulation di peptide defensina-come gallerimycin, LPS-interazione peptide gloverin, cecropin e moricin (Figura 5A, B, C, D)8.
Figura 1 : Alimentazione forzata l'installazione utilizzando una pompa microsiringa. Un ago smussato-conclusa sia regolato in pompa microsiringa che permette l'iniezione precisa dei batteri. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Persistenza della carica batterica nelle larve di Galleria mellonella dopo alimentazione forzata. Copiare i numeri di b. vulgatus- e . coli-specifico 16s rDNA geni sono stati determinati da 5 ng di cDNA a tempi differenti usando RT-PCR. I punti dati vengono visualizzati con l'indicazione della mediana. Modificato da riferimento 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Riconoscimento di pattern differenziale dei batteri da g. mellonella. Le larve sono state amministrate con due diversi commensali intestinali, RNA è stato isolato dopo 1-6 h, e l'espressione del mRNA di LPS riconoscimento della molecola apolipophorin (ApoIII) (A) e hemolin (B) è stata determinata. Punti di dati rappresentano medie geometriche con errore standard della media (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0,001). 8 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Espressione del gene marcatore ROS dopo sfida batterica. E. coli e b. vulgatus erano sottoposti ad alimentazione forzata ed espressione genica di ROS difesa marcatore è stato analizzato nel corso del tempo. Nos (A), Nox-4 (B) e Gst (C) l'espressione del mRNA è stata misurata in RNA isolato larvale. Punti di dati rappresentano medie geometriche con errore standard della media (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0,001). Modificato da riferimento 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Espressione indotta da commensal defensina-like peptide antimicrobico in cellule epiteliali umane e g. mellonella larve. Le larve sono state amministrate oralmente con b. vulgatus o e. coli, le risposte immunitarie sono state osservate nel corso del tempo e RNA è stato isolato da individui larvali. gallerimycin (A), cecropin (B), gloverin (C), moricin (D) l'espressione del mRNA è stata determinata. Punti di dati rappresentano medie geometriche con errore standard della media (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0,001). Modificato da riferimento 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il modello g. mellonella è un modello frequentemente usato per valutare i fattori di virulenza batterici in un approccio di infezione sistemica21. Poiché molti patogeni e batteri immettere l'host via orale colonizzazione o infezione, nuove intuizioni devono essere trovati per valutare mellonella g. come un modello per colonizzazione orale e l'infezione.
La possibilità di posteriore g. mellonella tra 15-37 ° C è un grande vantaggio poiché modelli più mammiferi mantengono la temperatura corporea di 37 ° C5. G. mellonella larve possono essere acquistate da diversi fornitori, ma l'istituzione di una popolazione di allevamento proprio fornisce molti vantaggi come l'assenza di antibiotici che interferiscono con i dosaggi, migliore stima quando iniziare esperimenti dal momento che i fornitori non forniscono sempre larve in una fase di ready-to-use e risposte allo stress sono evitate a causa di trasporto o variazioni di temperatura. Dovuto la tolleranza di temperatura di mellonella g. campo di temperatura in cui possa essere eseguita allevamento è alto. Temperature più elevate portano a più rapido sviluppo delle larve e secondo la temperatura di allevamento, possiamo stimare il ciclo di vita da uovo a Ultima instar larva. Quando le larve sono state selezionate per gli esperimenti, sono stati scelti gli individui solo pallidi e veloci per evitare lo stress e le reazioni immuni di interferire con gli esperimenti.
Al fine di stabilire il modello di alimentazione forzato, ha bisogno di essere certi che l'applicazione orale è stata completata. Pertanto, è stato utile impostare diverse prove per cui una tintura di bromofenolo forte è stato aggiunto alla soluzione destinata all'alimentazione forzata. Ciò consente di escludere eventuali larve ferite e selezionare per le larve che hanno il colorante blu solo all'interno del loro intestino22.
Utilizzando questo modello, abbiamo scoperto che le larve mellonella g. sono utili per analizzare la cinetica della risposta immunitaria innata di determinati geni marcatori. Durante la creazione del modello di somministrazione orale e lo studio della cinetica di risposta immunitaria abbiamo trovato espressione genica per non essere localmente espressa nel midgut. Prime prove sperimentali per estrarre RNA del midgut dopo somministrazione orale di batteri commensali non hanno fornito risultati conclusivi. Di conseguenza, le risposte immunitarie sono state determinate "globalmente" in individui interi. Questi risultati sostengono l'ipotesi di riconoscimento a livello mondiale attraverso i recettori intestinali, trasmissione del segnale e innescando l'espressione genica extraintestinali. In generale, g. mellonella è in grado di indurre AMPs principalmente nel corpo grasso, ma ulteriore emociti e il sistema intestinale9. Poiché non vi è alcuna informazione precisa disponibile su tessuto-specifica produzione di molecole antimicrobiche in g. mellonella larve dopo l'infezione, il RNA tutta larvale era estratta da individui completi e usato per diluire il gene del RNA espressione. Un ulteriore vantaggio del complesso larvale estrazione del RNA è il contenimento completo dei batteri viventi all'interno dell'intestino e la possibilità di quantificare il carico batterico. La dissezione dell'intestino potrebbe portare alla perdita di batteri a causa della preparazione.
Poiché la maggior parte della ricerca g. mellonella viene eseguita sulla virulenza batterica eravamo particolarmente interessati se e come le larve innescano risposte immunitarie verso batteri non patogeni che sono parte del microbiota dei mammiferi. Recentemente, abbiamo dimostrato che sia mellonella g. e mammiferi condividono simili componenti della risposta immunitaria innata, che sono omologhe e conservata evolutiva. L'ossido nitrico sintasi (Nos) e geni di NADPH ossidasi (Nox) condividono un elevato grado di somiglianza8. G. mellonella porti maggiori un peptide antimicrobico defensina-come gallerimycin che condivide similarità strutturali con mammiferi β-defensine 28.
Utilizzando il modello di somministrazione orale è stato possibile dimostrare riconoscimento differenziale batterico di antinfiammatori simbiotico b. vulgatus o pathobiotic pro-infiammatorie e. coli. Inoltre le risposte allo stress ossidativo a valle e produzione del peptide antimicrobico più in alto sono stati indotti dopo amministrazione di e. coli rispetto a b. vulgatus amministrazione8.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla DFG (SPP1656), il gruppo di formazione di ricerca DFG 1708, il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) e il centro tedesco per ricerca di infezione (DZIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
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