Summary
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour un modèle d’administration par voie orale à l’aide de larves de Galleria mellonella et comment caractériser induit des réponses immunitaires innées. Utilisant ce protocole, les chercheurs sans expérience pratique seront en mesure d’utiliser le g. mellonella méthode de gavage.
Abstract
L’étude du potentiel immunogène de bactéries commensales sur le système immunitaire est un des éléments essentiels lors de l’étude des interactions hôtes-microorganismes intestinaux. Il est bien établi que les commensaux différents présentent un potentiel différent pour stimuler le système immunitaire intestinal. Ces enquêtes impliquant des animaux vertébrés, en particulier les rongeurs. Étant donné les préoccupations croissantes en matière d’éthique sont liés à des expériences portant sur des vertébrés, il y a une forte demande pour les modèles de remplacements d’invertébrés.
Ici, nous fournissons un modèle d’administration par voie orale de Galleria mellonella utilisant des bactéries non pathogènes commensaux et l’évaluation possible du potentiel immunogène des commensaux sur le système immunitaire de g. mellonella . Nous démontrons que g. mellonella est un modèle de remplacement d’invertébrés alternative utile qui permet l’analyse des commensaux avec potentiel immunogène différent comme Bacteroides vulgatus et Escherichia coli. Fait intéressant, les bactéries ont montré aucun effet de tuer les larves, qui est similaire aux mammifères. Les réponses immunitaires de g. mellonella étaient comparables aux vertébrés les réponses immunitaires innées et impliquent la reconnaissance de la bactérie et la production de molécules antimicrobiennes. Nous proposons que g. mellonella a réussi à rétablir l’équilibre précédent microbiote, bien connue des individus sains de mammifères. Bien que fournissant comparables les réponses immunitaires innées chez g. mellonella et de vertébrés, g. mellonella n’héberge pas un système immunitaire adaptatif. Puisque les composantes étudiées du système immunitaire inné sont évolutifs conservée, le modèle permet une présélection et première analyse des propriétés immunogènes bactériennes.
Introduction
Le microbiome intestinal est une composante essentielle pour le maintien de l’homéostasie et implique les deux réponses immunitaires innée et adaptative1,2. La communauté microbiote commensal est caractérisée par différents principaux constituants commensaux : symbiotes qui confèrent des effets bénéfiques par les fonctions immunomodulatrices important et pathobionts qui peuvent avoir des effets préjudiciables dans génétiquement prédisposé héberge et de promouvoir et de déclencher l’inflammation intestinale3,4. De nombreuses études sur les symbiotes et les pathobionts et leur influence sur le système immunitaire ont été publiés principalement étudier des réponses immunes adaptatives.
Puisque ces études impliquent beaucoup d’animaux pour les enquêtes et la protection et remplacement des animaux utilisés pour l’expérimentation est d’accroître l’intérêt du public, nous cherchons à trouver un modèle de remplacement afin de permettre un dépistage de bactéries différentes immunogènes propriétés. Insectes, en particulier la Galleria mellonella, sont un modèle de remplacement largement utilisé dans la recherche de l’infection. G. mellonella combine différents avantages tels que le faible coût et haut débit ; Il permet l’administration orale de bactéries, qui est la voie d’exposition naturelle, et qu’il permet l’infection systémique5,6. G. mellonella plus permet d’incubation à 37 ° C, qui est la température physiologique du corps des mammifères et l’optimum pour la virulence bactérienne facteur expression5. Le principal avantage de g. mellonella est le système immunitaire inné conservé qui permet la discrimination du soi du non-soi et code pour une variété de récepteurs de reconnaissance de modèle comme apolipophorine ou les opsonines hemolin6, 7. dès la reconnaissance de microbe, g. mellonella peut déclencher différents immunité humorale en aval. Il peut induire des réponses de stress oxydatif et sécrètent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui implique l’activité de NOS (synthase nitrique oxydase) et NOX (NADPH oxydase)6,8. En outre, g. mellonella active une réponse puissant peptide antimicrobien (AMP), qui se traduit par la sécrétion d’un mélange d’amplis différents tels que gloverin, moricin, cécropine ou le gallerimycin de type defensin6, 8,9,10. En règle générale, amplis ont une spécificité très large spectre d’hôtes contre les champignons et les bactéries gram-positives et Gram-négatives et doivent fournir une réponse puissante étant donné que les insectes ne manquent aucune réponse adaptative10. Gloverin est un amplificateur actif contre les bactéries et les champignons et inhibe la formation de la membrane externe6,11. Moricins pièce leur fonction antimicrobienne contre les bactéries gram-positives et Gram-négatives de pénétrer la membrane et formant un pore9,11. Objectif fournit une activité contre les bactéries et les champignons et permeabilize la membrane de la même manière comme moricins9,10. Gallerimycin est un peptide de type defensin avec propriétés anti-fongiques9. Fait intéressant, il a été constaté que la combinaison de cécropine et gallerimycin avait une activité synergique contre e. coli10.
En raison de leur caractère de facile-à-utiliser g. mellonella larves sont un modèle d’infection souvent utilisé pour évaluer la pathogénicité bactérienne. En particulier, études dans lesquels des données provenant de g. mellonella sont en corrélation avec les données obtenues du support de la souris, la force de ce modèle d’hôte alternatif. Il a été constaté que les sérotypes les plus pathogènes dans un modèle d’infection de souris de Listeria monocytogenes conduisent aussi à des taux plus élevés de mortalité dans g. mellonella après l’infection systémique. En outre, moins virulentes sérotypes avéré pour être aussi moins virulente dans le modèle de g. mellonella 12. Des observations similaires ont été faites avec les champignons pathogènes humains Candida albicans. Virulence souches différentes de c. albicans a été évaluée par infection systémique et suivi de la survie des larves. Les souches avirulentes de souris ont été également non virulente ou exposées réduit de virulence chez g. mellonella, alors que les souches virulentes de souris mènent également à forte mortalité larvaire13. Le modèle de g. mellonella pourrait également servir à identifier type 3 sécrétion système facteurs de pathogénicité de Pseudomonas aeruginosa14.
Étant donné que la plupart des enquêtes impliquant g. mellonella ont porté sur les facteurs de virulence à l’aide de l’approche de l’infection systémique nous intéressait surtout en fournissant une méthode appropriée pour l’analyse des commensaux intestinale dans un gavage oral modèle dans lequel nous pouvons appliquer un dosage distinct des bactéries par les larves et non seulement observer le taux de mortalité larvaire mais analyser les différentes caractéristiques des réponses immunitaires innées pour maintenir l’homéostasie intestinale.
Notre méthode permet d’accroître l’utilisation de g. mellonella comme un modèle de remplacement puisque nous combinons l’application de bactéries et de l’analyse de l’expression des RNA. Il n’est pas seulement utile renforcer le sens d’études de la pathogénie bactérienne quand y compris l’analyse des réponses immunitaires après administration par voie orale et non seulement l’observation des taux de mortalité après une infection systémique. Nos méthodes permet d’analyse des propriétés immunogènes de bactéries non pathogènes commensaux puisqu’il est fournit des conditions plus complexes que la culture de cellules en offrant une barrière intestinale dans un organisme vivant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. g. mellonella élevage et préparation des larves pour les expériences
Remarque : Le cycle de l’oeuf au dernier stade larvaire larve prend environ 5-6 semaines.
- Transférer les oeufs pondus par des papillons adultes aux boîtes de 2 L contenant le substrat de la teigne (grains de maïs de 22 %, 22 % farine de blé, 17,5 % cire d’abeille, 11 %, lait écrémé en poudre, miel de 11 %, 11 % de glycérol, 5,5 % séché levure). Effectuer toute reproduction à 30 ° C dans l’obscurité.
- Le transfert de 25 g de substrat contenant les larves en substrat frais après environ 1-2 semaines où petites et minuscules larves étaient visibles. Synchroniser les larves après 2 semaines selon leur taille et garder des groupes de 30 à 40 larves dans des conteneurs de 2 L sur substrat de teigne pendant 2 semaines.
- Sélectionnez les larves pour expériences en poids. Utiliser des larves mobiles seulement pâles et rapides d’une masse de 180 à 200 mg.
2. culture et préparation des Bacteroides vulgatus et Escherichia coli pour administration par voie orale
- Cultiver la bactérie anaérobie obligatoire Bacteroides vulgatus mpk à 37 ° C en anaérobiose à l’aide de pots et sachets pour la création d’un environnement anaérobie (voir Table des matières)15,16. Cultiver des b. vulgatus pendant 2 jours et cultiver une sous-culture nuitée dans bouillon de cerveau coeur cervelle (BHI).
- Cultiver la bactérie anaérobie facultative Escherichia coli mpk dans des conditions aérobies dans le bouillon Luria-Bertani (LB) à 37 ° C. Cultiver des e. coli , du jour au lendemain dans un bouillon LB et croître la sous-culture pendant 2 h à 37 ° C le jour de l’expérience.
- Récolter les cultures par centrifugation à 1 700 x g pendant 5 min. remettre le bactérien granulés au SPD (de Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Déterminer la densité optique (Do) des cultures bactériennes à OD 600 nm et calculer les concentrations bactériennes. Les concentrations bactériennes sont ramenées à 109/ml.
3. gavage des larves de g. mellonella avec des suspensions bactériennes
- Gaver chaque larve avec 10 µL de la suspension bactérienne ajustée contenant 107 bactéries par dose. Utiliser une seringue à insuline avec une aiguille émoussé-terminée pour application buccale de la suspension bactérienne.
- Difficulté de la seringue dans une pompe microseringue (Figure 1) pour assurer l’exactitude du volume suspension appliquée à chaque larve (voir Table des matières). Insérer la seringue soigneusement entre leurs mandibules. Ne forcez pas la seringue entre les mandibules. Attendez que les larves de l’ouvrir pièces buccales et insérez ensuite la seringue.
- Incuber les larves gavés dans l’obscurité à 37 ° C entre les larves de 1 à 24 h. utilisation SPD-administré sous forme de contrôles de fond simulacre d’exclure de possibles réactions de stress induites en raison de la manipulation des larves pendant le gavage.
4. le traitement des larves administrés par voie orale et des ARN
- Travailler sous une hotte et porter des lunettes de sécurité. Nettoyer le capot et spray réactif pour empêcher la contamination de la RNase.
- Clin d’oeil-gel les larves vivantes, après incubation dans l’azote liquide et homogénéiser les. Utiliser un mortier et un pistil pour l’homogénéisation. Ajouter l’azote liquide pour le mortier et la grille chaque individu larvaire jusqu'à homogénats en poudre sont produites.
- Verser l’homogénat d’un jetable pesage bateau et attendez que l’azote liquide s’évapore.
- Mélanger le liquide sans azote gelé homogénats en poudre avec 1 mL de Trizol dans un tube de 2 mL et incuber le mélange à température ambiante pendant 1 h.
- Centrifuger le mélange à 8 000 x g pendant 15 min à température ambiante et transvaser le surnageant dans un nouveau tube et éliminer le plomb. Mélanger le liquide surnageant avec 200 µL du 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP). Vortex et incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante pendant 10 minutes sur la glace.
- Centrifuger les réactions BCP-ajout à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Transférer la couche supérieure transparente dans un nouveau tube de 2 mL et jeter le reste. Précipiter l’ARN de la couche supérieure transférée avec 500 µL isopropanol en mélangeant et en renversant le tube pendant 5 min.
- Centrifuger le tube à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Laver le précipité culot RNA avec 500 µL d’éthanol 75 %.
- Sécher le culot de RNA pendant 5-10 min à température ambiante. Faites attention de pas trop sécher car il sera difficile de dissoudre plus tard.
- Diluer l’inhibiteur de la ribonucléase (1/100) dans de l’eau exempte de nucléase et 100 µL de la solution permet de resuspendre le culot de RNA séché. Vortex le tube soigneusement jusqu'à dissolution complète de la pastille.
- RNA de mesurer la qualité et la quantité. S’assurer que le ratio 260/280 environ 2,0 et 260/230 ratio de l’ordre de 2.0-2.2 (voir Table des matières).
- L’utilisation de 5 µg d’ARN isolé pour la digestion de la DNase. Mix 5 µL de 10 x tampon, 1 µL d’enzyme inhibiteur de la ribonucléase, 2 µL d’enzyme de DNase, 5 µg d’ARN et se remplissent d’exempte de nucléase l’eau jusqu'à 50 µL. incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Ajouter 6 µL de réactif d’inactivation et incuber pendant 2 min à la réaction de RT et vortex occasionnellement. Centrifuger à réaction à 10 000 x g pendant 1 min. transfert surnageant dans tube frais de 1,5 mL.
Remarque : L’ARN contient l’ARN larve ainsi que l’ARN bactérien de la souche respectif utilisée pour administration par voie orale.
- Ajouter 6 µL de réactif d’inactivation et incuber pendant 2 min à la réaction de RT et vortex occasionnellement. Centrifuger à réaction à 10 000 x g pendant 1 min. transfert surnageant dans tube frais de 1,5 mL.
5. quantification des nombres bactériens 16 s copie après gavage
Remarque : Le nombre de copies des 16 bactérienne exprimée a été déterminé à l’aide de cDNA synthétisé à partir de l’ARN extrait dans la section 4. Quantification finale est calculée à l’aide de la courbe d’étalonnage du plasmide dans lequel le fragment PCR de 16 s de b. vulgatus ou e. coli a été cloné.
- Élaboration de normes de plasmide
- Amplifier des fragments de 16 s d’e. coli mpk ou b. vulgatus mpk ADN génomique par PCR. Mix 10 µL de 5 x tampon, 1 µL de solution de dNTP 10 mM, 2,5 µL d’apprêt avant de 10 µM et 2,5 µL de dilution de 10 µM amorce inversée, 1 µL de DMSO, 1 µL de matrice d’ADN génomique, 31,5 µL d’eau exempte de nucléase et 0,5 µL d’enzyme de relecture.
- Exécutez le PCR (dénaturation initiale : 98 ° C pendant 30 s, dénaturation : 98 ° C pendant 10 s, recuit : 60 ° C pendant 30 s, extension : 72 ° C pendant 30 s, extension finale : 72 ° C pendant 5 min, répéter la dénaturation, recuit et extension pour 30 cycles).
- Utiliser les amorces d’e. coli 16 s (p_forward : GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse : ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) ou 16 b. vulgatus amorces (p_forward : AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse : CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) pour amplification.
- Utiliser les fragments PCR 16 s e. coli et b. vulgatus émoussé-fin clonage dans un vecteur de clonage. Mettre en place la ligature et mélanger 10 µL de 2 tampons, 1 µL de produit de PCR non-purifiés, 1 µL de plasmide clonage émoussé-fin, 7 µL d’eau exempte de nucléase et 1 µL de T4 DNA Ligase. Incuber la ligature pendant 10 min à température ambiante.
- Préparer les cellules compétentes d’Escherichia coli DH5α.
- Ensemencer 100 mL de milieu LB dans un Erlenmeyer avec 1 mL d’une culture d’une nuit ou plus. Cultiver la culture jusqu'à ce que OD 600 nm entre 0,4 et 0,6. Diviser la culture résultante en deux tubes de 50 mL et incuber les cultures sur la glace pendant 10 min.
- Centrifuger les cultures à 1 700 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension de chaque granule soigneusement avec 5 mL de solution RFI (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl2, ajuster le pH 5.8 avec acide glacial, stérile filtré). Remplir chaque tube avec supplémentaire 45 mL de solution RFI.
- Centrifuger les cultures à 1 700 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension de chaque granule soigneusement avec 6 mL de RFII (MOPS de 10 mM, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15 % de glycérol, stérilisés à l’autoclave) solution. Mettre en commun les deux fractions et incuber la suspension 12 mL sur la glace pour 15 min. Préparez aliquotes de suspension cellulaire (200 µL). Stocker les aliquotes à-80 ° C.
- Transférer la réaction de ligature d’une aliquote de compétent e. coli DH5α cellules et laisser la réaction sur la glace pendant 15 min chaleur choquent les cellules pour 45 s à 42 ° C et ajouter 1 mL de milieu LB.
- Incuber transformation pendant 45 min à 37 ° C. Ajouter 100 µL de la transformation d’une gélose LB contenant l’ampicilline et incuber une nuit à 37 ° C.
- Effectuer colonie PCR de 8 transformants résultants de la gélose LB d’étape 5.1.5. Prélever chaque colonie avec un cure-dent, trempez-le sur un plat frais de livre contenant l’ampicilline (plat principal) et ensuite tremper le cure-dents même dans un contenant bien µL de 5,5 d’eau exempte de nucléase dans une bande PCR.
- Ajouter 7,5 µL du mélange de x PCR 2, 0,5 µL d’apprêt avant de 10 µM et 0,5 µL de dilution de primer inverse 10 µM. Utilisez les mêmes paires d’amorces mentionnés à la section 5.1.1.
- Exécutez le PCR (dénaturation initiale : 95 ° C pendant 5 min, dénaturation : 95 ° C pendant 1 min, recuit : 60 ° C pendant 30 s, extension : 72 ° C pendant 1 min, extension finale : 72 ° C pendant 7 min, répéter la dénaturation, recuit et extension pour 35 cycles).
- Vérifier que la taille des fragments 16 s sur un gel d’agarose à 1 %. Tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) de 0,5 x permet de dissoudre 1 g d’agarose et la faire bouillir au micro-ondes. Ajouter le colorant de 1/50 000 pour le gel et la verser. Ajouter les réactions de PCR de colonie et une échelle d’ADN bp 100 au gel et exécutez le gel pendant 45 min à 110 V.
- Ensemencer une culture de nuit LB 5 mL contenant l’ampicilline avec un clone de la plaque de maître (section 5.1.6) pour chaque plasmide 16 s e. coli et b. vulgatus qui contient la taille de l’encart de droite.
- Centrifuger les cultures bactériennes durant la nuit dans un tube de 2 mL à 1 700 x g. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 600 µL d’eau stérile.
- Ajouter 100 µL de tampon de lyse et mélanger en renversant le tube 6 fois. Ajouter 350 µL de froid (4° C) solution de neutralisation et mélanger soigneusement en renversant le tube.
- Centrifugeuse à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 3 min. transvaser le surnageant (~ 900 µL) dans une colonne et la centrifugeuse à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 15 s.
- Jeter la redistribution et ajouter 200 µL de lavage enlèvement endotoxine et centrifuger à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 15 s.
- Mettre 400 µL de solution de lavage dans la colonne et centrifuger à vitesse maximale dans une centrifugeuse pendant 30 s. transfert la colonne dans un tube propre 1,5 mL, ajouter 30 µL de tampon d’élution de la colonne il incuber pendant 1 min à température ambiante.
- Centrifugeuse à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 30 s (voir Table des matières).
- Déterminer la concentration d’ADN de plasmide en mélangeant 1 µL d’ADN plasmidique à 199 µL de solution de travail (1 µL de colorant fluorescent par 199 µL de tampon pour chaque réaction). Préparer deux normes en mélangeant 10 µL de standard µL 1 ou 10 de la norme 2 avec 190 µL. Vortex l’échantillon et les calibrateurs et incuber réaction pendant 2 min. mesure de la concentration (voir Table des matières).
- Préparer des concentrations standards en 10 fois des dilutions successives dans une gamme de 10-100 000 exemplaires : calcul de la masse de la plasmide (m = n (n) x (1.096x10-21 g/bp), = taille du plasmide, m = masse). Calculer la masse d’ADN nécessaire pour contenir le nombre de copies désiré d’intérêt plasmidique (copier nombre d’intérêt x masse du plasmide = masse du plasmide ADN nécessaire).
- Préparation des échantillons pour la quantification
- Synthèse de cDNA. Mélanger 2 µL de tampon de x 7, 1 µL d’ARN DNase digéré de l’article 4 et 11 µL d’eau exempte de nucléase. Incuber pendant 2 min à 42 ° C.
- Placez la réaction immédiatement sur la glace. Mix 4 µL de 5 x tampon RT, 1 µL du mélange amorces RT (Transcriptase inverse), 1 µL d’enzyme RT et la réaction de l’étape 5.2.1. Incuber pendant 15 min à 42 ° C. Incuber pendant 3 min à 95° C pour inactiver les enzymes de la RT.
- Quantifier les ADNc concentrations de manière fluorométrique comme décrit à l’étape 5.1.9.
- Synthèse de cDNA. Mélanger 2 µL de tampon de x 7, 1 µL d’ARN DNase digéré de l’article 4 et 11 µL d’eau exempte de nucléase. Incuber pendant 2 min à 42 ° C.
- Mesure de la charge bactérienne
- Ajuster des concentrations d’ADNc à 5 ng par 12 réaction µL pour PCR quantitative. Mélanger le mélange de RT-PCR x 2, 0,25 µL d’apprêt avant de 100 µM, 0,25 µL de 100 amorces inverse µM (5.1.1) et 12 µL du cDNA ajusté. Exécutez qPCR (dénaturation initiale : 95 ° C pendant 5 min, dénaturation : 95 ° C pendant 10 s, recuit : 60 ° C pendant 30 s, répéter la dénaturation et recuit pour 35 cycles, fonte : 95 ° C, laissez refroidir à 4 ° C).
- Complot des concentrations de10 journal de courbe standard de plasmide (10-100 000 exemplaires), entre 1-5 (axe x), contre les ct-valeurs correspondantes (axe y). Effectuer une régression linéaire pour obtenir l’équation de régression. Résoudre l’équation x (concentration). La formule permet de calculer le journal10 le nombre de copies en y insérant ct-valeur de la formule. Calculer l’antilogarithme pour obtenir le nombre de copies.
6. détermination du gène marqueur immunitaire innée par RT-PCR quantitative
- Vérifiez amorces pour spécificité génétique par PCR et ultérieures d’agarose gel électrophorèse pour vérifier la taille du fragment correct. Effectuer des PCR comme décrit dans la section 5.1.5.
Ubiquitine 130 bp : avant TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, inverser CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (ménage)
Nox-4 159 bp : avant TGGCACGGCATCAGTTATCA, inverse ACAGCGACTGTCATGTGGAA8
Bp n° 76 : avant ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, inverse GCCATTTTACAATCGCCACAA8
Bp TPS 156 : avant GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, inverse TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8
ApoIII 265 bp : avant AGACTTGCACGCCATCAAGA, inverse TGCATGCTGTTTGTCACTGC8
hemolin 267 bp : avant CTCCCTCACGGAGGACAAAC, inverse GCCACGCACATGTATTCACC8
gallerimycin 161 bp : avant GAAGTCTACAGAATCACACGA, inverse ATCGAAGACATTGACATCCA8
bp cécropine 158 : avant CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, inverse GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8
bp gloverin 101 : avant GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, inverse CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8
moricin 124 bp : avant GCTGTACTCGCTGCACTGAT, inverse TGGCGATCATTGCCCTCTTT8) - Évaluer l’efficacité de l’apprêt pour être E = 2.
- Poule 2 µL de 5-10 différents échantillons positifs (c.-à-d. les échantillons qui expriment le gène pour lequel la paire d’amorce doit être étudié).
- Préparer une série de dilution de 1:5 de la piscine de l’échantillon : 1 standard (S1) : non dilué de piscine ; S2 : 2 µL de S1 + 8 eau exempte de nucléase µL ; S3 : 2 µL de S2 + 8 eau exempte de nucléase µL ; S4 : 2 µL de S3 + 8 µL exempte de nucléase eau.
- Appliquer 1 µL de S1-S4 et un contrôle sans modèle (eau exempte de nucléase) sur une plaque de 96 puits qPCR. Ajouter 5 µL du mélange maître RT, 0.1 µL de chaque amorce de marche avant et arrière µM 100, 3,7 µL d’eau exempte de nucléase et 0.1 µL du mélange de RT / puits.
- Exécutez la RT-PCR quantitative (transcription inverse : 50 ° C pendant 10 min, dénaturation initiale : 95 ° C pendant 5 min, dénaturation : 95 ° C pendant 10 s, recuit : 60 ° C pendant 30 s, répéter la dénaturation et recuit pour 40 cycles, fonte : 95 ° C, laissez refroidir à 4 ° C).
- Intrigue log10 des unités relatives pour S1-S4 (1, 0,2, 0.04, 0,008) (axe x) contre les TC-valeurs correspondantes (axe y). Effectuer une régression linéaire et déterminer la pente de la courbe standard. Calculer l’efficacité e : E = 10-(1/slope). 20
Remarque : Une pente de-3.32 indique les conditions réactionnelles idéal et l’efficacité d’amorce de E = 2.00. Cela signifie : la quantité de produit PCR double au cours de chaque cycle.
- Utilisez 100 ng d’ARN digérée (100 ng/µL) comme un modèle pour la RT-PCR. Réactifs de mix RT-PCR et RT-PCR exécution comme indiqué au point 6.2. Mesurer tous les échantillons de bactéries et SPD-administré avec ménage paire d’amorces et paires d’amorces de cible. Exécutez toujours les dilutions S1-S4 avec la paire d’amorces ménage et S1-S4 avec la paire d’amorces de cible sur la même plaque pour la détermination de l’efficacité.
- Calculer le ratio (R) de l’expression génique RNA selon la formule suivante à l’aide de l’efficacité de l’apprêt déterminé expérimentalement de l’entretien ménager et la paire d’amorces de cible. Normaliser les bactéries stimulé des échantillons pour se moquer des contrôles20.
R : ratio
Ecible: efficacité du S1-4 mesurée avec la paire d’amorces de cible
Eentretien ménager: efficacité du S1-4 mesurée avec ménage paire d’amorces
Δctcible(contrôle-échantillon): Δct (CT d’échantillon SPD-fed)-(ct d’échantillon alimenté par les bactéries) mesurée à l’aide de paire d’amorces de cible
Δctentretien ménager(témoin): Δct (CT d’échantillon SPD-fed)-(ct d’échantillon alimenté par les bactéries) mesurée à l’aide de ménage paire d’amorces
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le modèle d’infection g. mellonella hémolymphe chez largement utilisé pour analyser les facteurs de virulence d’une grande variété d’agents pathogènes. La plupart des mesures comprennent l’analyse de la mortalité des larves, qui est une méthode assez facile. Néanmoins, cette méthode ne pas permettre des conclusions sur la réponse immunitaire en général et les résultats des réponses immunitaires mellonella g. associer les mécanismes immunitaires vertébrés. Le modèle d’administration par voie orale de g. mellonella en revanche que rarement sert pour infection orale ou de la colonisation des larves en raison des difficultés à obtenir de dosage exact infection9. En outre, seulement on connaît mal g. mellonella des réponses immunitaires innées vers des bactéries non pathogènes surtout les commensaux intestinales chez les mammifères.
Contrairement aux agents pathogènes, germes commensaux conteste l’hôte et déclencher des réponses immunitaires, mais le système immunitaire est en mesure de maintenir l’homéostasie immunitaire. G. mellonella est capable d’effacer la charge bactérienne gavée initiale jusqu'à ce que finalement aucune bactérie n’était détectables plus (Figure 2)8. Les 16 nombre de copies du gène de vulgatus b. et e. coli a sensiblement diminué dans les 24h.
Nous avons démontré qu’administrés commensal des larves de g. mellonella induisent l’expression des gènes RNA des gènes marqueurs de l’immunité innée différents : molécules de LPS-reconnaissance - apolipophorine (ApoIII) et hemolin (Figure 3A, B) se sont avérés être généralement plus exprimée chez e. coli-administré des larves par rapport à b. vulgatus-administré larves8. En outre, l’expression des gènes marqueurs de deux types de molécules antimicrobiennes peut être surveillée. La production d’oxygène réactif et azotés (ROS/Ia) peut être estimée par la mesure de l’expression des gènes amendements et Nox-4 qui ont été démontrés pour être fortement augmentée sur e. coli gavage par rapport à B. vulgatus (Figure 4A, B)8. En outre, l’expression des gènes des antioxydants TPS on observe (Figure 4C). 8
En outre, nous avons montré qu’expression de différents peptides antimicrobiens fut poussée plus fort après l’administration d’e. coli qu’en réponse à b. vulgatus gavage. Nous avons observé une augmentation de gallerimycin defensin-like peptide, interaction LPS gloverin peptide, cécropine et moricin (Figure 5A, B, C, D)8.
Figure 1 : Le programme d’installation à l’aide d’une microseringue pompe de gavage. Une aiguille émoussé-terminée est ajustée dans la pompe microseringue qui permet une injection précise des bactéries. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Persistance de la charge bactérienne chez les larves de Galleria mellonella après gavage. Copier les numéros de b. vulgatus- et e. coli-spécifique 16 s rADN ont été déterminées à partir 5 ng de l’ADNc à différents moments par RT-PCR. Points de données sont affichés avec indication de la médiane. Modification de la référence 8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Reconnaissance de formes différentielles des bactéries par g. mellonella. Les larves ont été administrés avec deux différents commensaux intestinale, l’ARN a été isolé après 1 à 6 h et expression de l’ARNm de LPS reconnaissance molécule apolipophorine (ApoIII) (A) et hemolin (B) a été déterminée. Points de données représentent des moyennes géométriques avec écart-type de la moyenne (SEM) (p > 0,05 ; *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001). 8 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Expression du gène marqueur ROS après défi bactérien. E. coli et b. vulgatus ont été gavés et l’expression des gènes marqueurs ROS défense a été analysée au fil du temps. Nos (A), Nox-4 (B) et TPS (C) expression de l’ARNm a été mesurée en ARN larvaire. Points de données représentent des moyennes géométriques avec écart-type de la moyenne (SEM) (p > 0,05 ; *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001). Modification de la référence 8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Expression induite par le commensal defensin-like peptide antimicrobien chez les larves de g. mellonella et cellules épithéliales humaines. Les larves ont été administrés par voie orale avec b. vulgatus ou e. coli, des réponses immunitaires ont été observées au fil du temps et ARN a été isolé par des individus larvaires. gallerimycin (A), cécropine (B), gloverin (C), moricin (D) expression de l’ARNm a été déterminée. Points de données représentent des moyennes géométriques avec écart-type de la moyenne (SEM) (p > 0,05 ; *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001). Modification de la référence 8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le modèle de g. mellonella est un modèle souvent utilisé pour évaluer les facteurs de virulence bactériens dans une infection systémique approche21. Puisque de nombreuses bactéries et agents pathogènes entrent l’hôte par l’intermédiaire de la colonisation ou l’infection par voie orale, nouvelles connaissances doivent être trouvées pour évaluer des g. mellonella comme un modèle de colonisation orale et l’infection.
La possibilité d’arrière g. mellonella entre 15 et 37 ° C est un grand avantage, puisque les modèles mammifères plus maintiennent leur température corporelle de 37 ° C5. G. mellonella larves peuvent être achetés auprès de fournisseurs différents, mais la mise en place d’une population de propre élevage fournit de nombreux avantages tels que l’absence d’antibiotiques qui interfèrent avec les dosages, meilleure estimation quand commencer les expériences étant donné que les fournisseurs ne fournissent pas toujours les larves dans un stade prêt à l’emploi et les réactions au stress sont évitées en raison des transports ou des changements de température. En raison de la tolérance à la température de g. mellonella l’intervalle de température au cours de laquelle la reproduction peut être effectuée est élevé. Des températures plus élevées conduisent à un développement plus rapide des larves et fonction de la température d’élevage, nous pouvons estimer le cycle de vie de l’oeuf au dernier stade de larve. Lorsque les larves ont été sélectionnés pour des expériences, des individus seulement pâles et rapides ont été choisis afin d’éviter tout stress et réactions immunitaires d’interférer avec les expériences.
Afin d’établir le modèle de gavage, il faut s’assurer que l’application par voie orale a réussi. Par conséquent, il était utile de mettre en place plusieurs essais pour lesquels un colorant de bromophénol forte a été ajouté à la solution destinée à gavage. Cela permet d’exclure une quelconque larve blessés et sélectionnez pour les larves qui ont le colorant bleu uniquement dans leur tube digestif22.
En utilisant ce modèle, nous avons constaté que les larves de g. mellonella sont utiles pour étudier la cinétique de la réponse immunitaire innée de certains gènes marqueurs. Au cours de la mise en place du modèle d’administration par voie orale et l’étude de la cinétique de la réponse immunitaire, nous avons trouvé l’expression des gènes ne pas exprimée localement dans l’intestin moyen. Premiers essais expérimentaux pour extraire de l’intestin moyen RNA après administration orale de bactéries commensales n’a pas fourni de résultats concluants. Par conséquent, les réponses immunitaires ont été déterminées « globalement » chez les individus ensemble. Ces résultats confortent l’hypothèse d’une reconnaissance mondiale via des récepteurs intestinaux, la transmission du signal et le déclenchement de l’expression génique extra-intestinal. En règle générale, g. mellonella est capable d’induire des amplis principalement dans le tissu adipeux, mais davantage dans les hémocytes et le système gastro-intestinal9. Puisqu’il n’y a pas d’informations précises sur la production de tissu-spécifique des molécules antimicrobiennes dans g. mellonella larves après l’infection, l’ensemble larvaire ARN a été extrait des individus complets et utilisé pour doser le gène de l’ARN expression. Un autre avantage des larve toute extraction de l’ARN est le confinement complet des bactéries vivant à l’intérieur de l’intestin et la possibilité de quantifier la charge bactérienne. La dissection du tube digestif pourrait conduire à la perte des bactéries en raison de la préparation.
Étant donné que la plupart des recherches de g. mellonella sont effectuée sur les traits de la virulence bactérienne nous étions particulièrement intéressé si et comment les larves déclenchent des réponses immunitaires vers des bactéries non pathogènes, qui font partie de la microflore chez les mammifères. Récemment, nous avons montré que les g. mellonella et les mammifères partagent des composants similaires de la réponse immunitaire innée, qui sont homologues et conservé évolutive. L’oxid nitrique synthase (Nos) et la NADPH oxydase (Nox) gènes partagent un degré élevé de similitude8. G. mellonella ports en outre un gallerimycin defensin-like peptide antimicrobien qui partage des similitudes structurelles avec les mammifères β-defensin 28.
En utilisant le modèle de l’administration par voie orale il était possible de démontrer la prime reconnaissance bactérienne symbiotique anti-inflammatoires b. vulgatus ou pro-inflammatoires pathobiotic e. coli. En outre les réactions au stress oxydatif en aval et la production de peptides antimicrobiens ont été plus induites après l’administration d’e. coli par rapport à b. vulgatus administration8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la DFG (SPP1656), le groupe de formation de recherche DFG 1708, le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) et le centre allemand pour la recherche Infection (DZIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
