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Immunology and Infection

एक गैलेरिया शलभ मौखिक प्रशासन मॉडल के अध्ययन के लिए commensal प्रेरित जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/59270
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department for Medical Microbiology, Hygiene, Interfacultary Institute for Microbiology, Infection Medicine, University of Tübingen

Summary

यहाँ, हम एक मौखिक प्रशासन गैलेरिया शलभ लार्वा का उपयोग कर मॉडल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और प्रेरित सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कैसे चित्रित करने के लिए. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, व्यावहारिक अनुभव के बिना शोधकर्ताओं जी शलभ बल खिला विधि का उपयोग करने में सक्षम हो जाएगा ।

Abstract

मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली पर सहभोजी बैक्टीरिया की immunogenic क्षमता की जांच एक आवश्यक घटक जब आंत्र मेजबान microbe बातचीत का अध्ययन है । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि विभिंन commensals एक अलग करने के लिए मेजबान आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रोत्साहित क्षमता प्रदर्शन । ऐसी जांचों में कशेरुका जानवर, विशेष रूप से रोडेंट शामिल हैं । चूंकि बढ़ती हुई नैतिक चिंताओं को कशेरुका से जुड़े प्रयोगों से जोड़ा जाता है, इसलिए इसमें अकशेरीवाले प्रतिस्थापन मॉडलों की उच्च मांग है ।

यहां, हम एक गैलेरिया शलभ मौखिक प्रशासन सहभोजी गैर रोगजनक बैक्टीरिया का उपयोग मॉडल और जी शलभ प्रतिरक्षा प्रणाली पर सहभोजी की प्रतिरक्षा क्षमता के संभावित आकलन प्रदान करते हैं । हम यह प्रदर्शित करते है कि जी शलभ एक उपयोगी वैकल्पिक अकशेरीकारक प्रतिस्थापन मॉडल है कि इस तरह के जीवाणु के रूप में विभिन्न immunogenic क्षमता के विश्लेषण की अनुमति देता है । दिलचस्प है, बैक्टीरिया लार्वा, जो स्तनधारियों के समान है पर कोई हत्या प्रभाव का प्रदर्शन किया । जी शलभ के प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं कशेरुका जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ तुलनीय थे और बैक्टीरिया और रोगाणुरोधी अणुओं के उत्पादन की मान्यता शामिल. हम का प्रस्ताव है कि जी शलभ पिछले microbiota संतुलन है, जो अच्छी तरह से स्वस्थ स्तनधारी व्यक्तियों से जाना जाता है बहाल करने में सक्षम था । हालांकि दोनों जी शलभ और कशेरुका में तुलनीय सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं प्रदान, जी शलभ एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली बंदरगाह नहीं है । के बाद से जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के घटकों की जांच विकासवादी संरक्षण कर रहे हैं, मॉडल एक prescreening और बैक्टीरियल immunogenic गुणों के पहले विश्लेषण की अनुमति देता है ।

Introduction

आंतों माइक्रोबायोम homeostasis के रखरखाव के लिए एक आवश्यक घटक है, और दोनों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं1,2शामिल है । सहभोजी माइक्रोबायोटा समुदाय के विभिंन मुख्य सहभोजी घटकों की विशेषता है: सिंबियोंट्स कि महत्वपूर्ण इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कार्यों द्वारा लाभकारी प्रभाव प्रदान, और pathobionts कि आनुवंशिक रूप से संवेदनशील में हानिकारक प्रभाव हो सकता है मेजबान और बढ़ावा देने और आंत्र सूजन को ट्रिगर3,4। सिंबियोंटों और पैथोबियोंटों पर कई अध्ययनों और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली पर उनके प्रभाव मुख्य रूप से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन प्रकाशित किया गया है ।

चूंकि इन अध्ययनों की जांच के लिए कई जानवरों को शामिल करने और संरक्षण और प्रयोग के लिए इस्तेमाल पशुओं के प्रतिस्थापन सार्वजनिक हित में वृद्धि की है, हम एक प्रतिस्थापन मॉडल खोजने के लिए विभिंन बैक्टीरियल immunogenic की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति की तलाश गुण. कीड़े, विशेष रूप से गैलेरिया शलभ, संक्रमण अनुसंधान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रतिस्थापन मॉडल हैं । जी शलभ कम लागत और उच्च थ्रॅपुट जैसे विभिन्न फायदों को जोड़ती है; यह बैक्टीरिया है, जो प्राकृतिक जोखिम मार्ग है के मौखिक प्रशासन की अनुमति देता है, और यह प्रणालीगत संक्रमण के लिए अनुमति देता है5,6। जी शलभ आगे ३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन है, जो स्तनधारियों के शारीरिक शरीर के तापमान और बैक्टीरियल डाह कारक अभिव्यक्ति5के लिए इष्टतम है सक्षम बनाता है । जी शलभ का मुख्य लाभ है संरक्षित सहज प्रतिरक्षा प्रणाली है कि गैर से स्वयं के भेदभाव को सक्षम बनाता है स्व और encodes पैटर्न मांयता रिसेप्टर्स की एक किस्म apolipophorin या opsonin हेमोलिन 6 की तरह, 7. सूक्ष्म जीव मांयता पर, जी शलभ विभिंन डाउनस्ट्रीम humoral प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकते हैं । यह oxidative तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) जो नग (नाइट्रिक oxidative synthase) और nox (nadph oxidative)6,8की गतिविधि शामिल छिपाना । इसके अलावा, जी शलभ एक शक्तिशाली रोगाणुरोधी पेप्टाइड (AMP) प्रतिक्रिया है, जो इस तरह के gloverin, moricin, सीक्रोपिन या defensin जैसे अलग AMPs का एक मिश्रण के स्राव में परिणाम सक्रिय करता है6gallerimycin की तरह, 8,9,10. आम तौर पर, AMPs ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और कवक के खिलाफ काफी व्यापक मेजबान विशिष्टता है और कीड़े किसी भी अनुकूली प्रतिक्रिया की कमी कर रहे हैं के बाद से एक शक्तिशाली प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए है10. Gloverin बैक्टीरिया और कवक के खिलाफ एक AMP सक्रिय है और बाहरी झिल्ली गठन को रोकता है6,11। Moricins ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के खिलाफ झिल्ली मर्मज्ञ और एक ताकना9,11बनाने के द्वारा उनके रोगाणुरोधी समारोह प्रदर्शन । सेफ्रोपिन बैक्टीरिया और कवक के खिलाफ गतिविधि प्रदान करते हैं और इसी तरह मोरिसिंस9,10जैसी झिल्ली को पारगम्य करते हैं । Gallerimycin विरोधी कवक गुण9के साथ एक defensin की तरह पेप्टाइड है । दिलचस्प बात यह है कि यह पाया गया कि सेफ्रोपिन और गैलेरीमाइसिन के संयोजन ई.कोलाई10के खिलाफ एक synergistic गतिविधि थी ।

कारण उनके आसान करने के लिए उपयोग चरित्र जी शलभ लार्वा जीवाणु रोगजनन का आकलन करने के लिए एक अक्सर इस्तेमाल किया संक्रमण मॉडल हैं । विशेष रूप से, अध्ययन जिसमें जी शलभ से प्राप्त डेटा चूहों से प्राप्त डेटा के साथ सहसंबंधी इस वैकल्पिक मेजबान मॉडल की ताकत का समर्थन. यह पाया गया कि एक माउस संक्रमण मॉडल में लिस्टिरिया monocytogenes के सबसे रोगजनक सीरोटाइप भी प्रणालीगत संक्रमण के बाद जी शलभ में उच्च मृत्यु दर के लिए सीसा । इसके अलावा, कम उग्र सीरोटाइप निकला भी जी शलभ मॉडल12में कम उग्र । इसी तरह के प्रेक्षण मानव रोगजनक कवक कैंडिडा एल्बिकैंसके साथ किए गए हैं । विभिन्न ग. ऐल्बिकांस संवेदनहीन का आविर्चलन प्रणालीगत संक्रमण और लार्वा उत्तरजीविता की अनुवर्ती मानीटरिंग द्वारा आकलित किया गया है । माउस उग्र उपभेदों भी अविलेंट थे या जी शलभमें कम विव्रणशीलता का प्रदर्शन किया है, जबकि माउस को विषाक्त उपभेदों भी उच्च लार्वा मृत्यु के लिए नेतृत्व13। G. शलभ मॉडल आगे प्रकार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 3 स्राव प्रणाली रोगजनन कारकों के स्यूडोमोनास aeruginosa14.

के बाद से सबसे जी शलभ शामिल जांच विरूलेंस कारकों पर केंद्रित प्रणालीगत संक्रमण दृष्टिकोण का उपयोग हम विशेष रूप से एक मौखिक बल में आंतों commensals के विश्लेषण के लिए उपयुक्त विधि प्रदान करने में रुचि रखते थे खिला मॉडल जिसमें हम लार्वा प्रति बैक्टीरिया की एक अलग खुराक लागू कर सकते हैं और न केवल लार्वा मृत्यु दर का निरीक्षण लेकिन आंत्र homeostasis बनाए रखने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विभिन्न बानगी का विश्लेषण.

हम बैक्टीरिया और आरएनए अभिव्यक्ति के विश्लेषण के आवेदन गठबंधन के बाद से एक प्रतिस्थापन मॉडल के रूप में जी शलभ के उपयोग को बढ़ाने के लिए हमारी विधि में मदद करता है. यह केवल बैक्टीरियल रोगजनन अध्ययन के अर्थ को मजबूत करने के लिए उपयोगी नहीं है जब मौखिक प्रशासन के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण और न केवल प्रणालीगत संक्रमण के बाद मृत्यु दर के अवलोकन सहित । हमारे तरीकों बैक्टीरियल गैर रोगजनक commensals के immunogenic गुणों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है के बाद से यह एक जीवित जीव में एक आंत्र बाधा की पेशकश द्वारा सेल संस्कृति से अधिक जटिल शर्तों प्रदान करता है ।

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Protocol

1. G. शलभ पालन और प्रयोगों के लिए लार्वा की तैयारी

नोट: पिछले instar लार्वा के लिए अंडे से चक्र लगभग 5-6 सप्ताह लेता है ।

  1. वयस्क पतंगों द्वारा रखे गए अंडों को 2 L बक्से में स्थानांतरित करें जिसमें मोम मोठ सब्सट्रेट (22% मकई की गर्ट्स, 22% गेंहू भोजन, १७.५% मोम, 11% स्किम्ड मिल्क पाउडर, 11% शहद, 11% ग्लिसरोल, ५.५% ड्राइड यीस्ट) शामिल हैं । अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर पूरे प्रजनन प्रदर्शन ।
  2. जब छोटे और छोटे लार्वा दिखाई दे रहे थे तब लगभग 1-2 सप्ताहों के बाद लार्वा युक्त सब्सट्रेट के 25 ग्राम को ताजा सब्सट्रेट में अंतरित करें । अपने आकार के अनुसार 2 सप्ताह के बाद लार्वा को सिंक्रनाइज़ करें और 2 L कंटेनरों में 30-40 लार्वा के समूह को अतिरिक्त 2 सप्ताह के लिए मोम मोठ सब्सट्रेट पर रखें ।
  3. वजन के अनुसार प्रयोगों के लिए लार्वा का चयन करें । 180-200 मिलीग्राम के एक बड़े पैमाने के साथ केवल पीला और तेजी से चलती लार्वा का उपयोग करें ।

2. खेती और मौखिक प्रशासन के लिए बैक्टीरोइडीज वल्गेटस और एस्चेरीच्या कोलाई की तैयारी

  1. अवायुजीवी एक अवायवीय वातावरण बनाने के लिए जार और पाउच का उपयोग करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर अनिवार्य अवायवीय जीवाणु बैक्टीरियम जीवाणुइडीज वल्गेटस की बढ़ती ( सामग्री की तालिकादेखें)15,16. 2 दिनों के लिए बी vulgatus की खेती और मस्तिष्क हार्ट अर्क (भी) broth में एक रातोंरात उपसंस्कृति बढ़ने ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर लुरिया-बेरतानी (पौंड) शोरब में एरोबिक स्थितियों के तहत विकल्पी अवायुजीवी जीवाणु एस्चेरीच्या कोलाई mpk बढ़ाएं । ई. कोलाई की खेती पौंड शोरबे में रात भर और प्रयोग के दिन ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए उपसंस्कृति विकसित ।
  3. 5 मिनट के लिए १,७०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा संस्कृतियों फसल dpbs में बैक्टीरियल छर्रों Resuspend (है Dulbecco फॉस्फेट-Buffered खारा) । ऑप्टिकल घनत्व का निर्धारण (ओडी) आयुध डिपो में जीवाणु संस्कृतियों का ६०० समुद्री मील और बैक्टीरिया की सांद्रता की गणना । बैक्टीरियल सांद्रता 109करने के लिए समायोजित किया गया/

3. बैक्टीरियल निलंबन के साथ जी शलभ लार्वा के बल-खिला

  1. बल-प्रत्येक लार्वा को समायोजित जीवाणु के 10 μL के साथ खिलाएं जिसमें प्रति खुराक 107 बैक्टीरिया होते हैं । बैक्टीरियल निलंबन के मौखिक आवेदन के लिए एक कुंद-समाप्त सुई के साथ एक इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग करें ।
    1. एक microsyringe पंप में सिरिंज फिक्स (चित्रा 1) प्रत्येक लार्वा को लागू निलंबन की मात्रा की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए ( सामग्री की मेजदेखें). अपने मंदित के बीच सिरिंज ध्यान से डालें । मंदिरीयों के बीच सिरिंज को बलपूर्वक न करें । लार्वा को खोलने के लिए प्रतीक्षा करें और फिर सिरिंज डालें ।
  2. बल-आहार के दौरान लार्वा की हैंडलिंग के कारण उत्पन्न संभावित तनाव प्रतिक्रियाओं को बाहर करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के बीच 1-24 के बीच में फोर्स-फेड लार्वा को मॉक बैकग्राउंड नियंत्रण के रूप में प्रयोग करें DPBS-प्रशासित लार्वा ।

4. मौखिक रूप से प्रशासित लार्वा और आरएनए अलगाव का प्रसंस्करण

  1. एक डाकू के तहत काम और सुरक्षा चश्मा पहनते हैं । RNase संदूषण को रोकने के लिए हुड और स्प्रे अभिकर्मक को साफ करें ।
    1. स्नैप-तरल नाइट्रोजन में ऊष्मायन के बाद रहने वाले लार्वा फ्रीज और उन्हें homogenize. homogenization के लिए एक मोर्टार और स्त्रीकेसर का प्रयोग करें । मोर्टार और ग्रिड प्रत्येक लार्वा व्यक्ति के लिए तरल नाइट्रोजन जोड़ें जब तक पाउडर homogenates का उत्पादन कर रहे हैं ।
    2. एक डिस्पोजेबल वजन नाव को homogenate डालो और तरल नाइट्रोजन के लिए प्रतीक्षा करने के लिए लुप्त हो जाना ।
  2. एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में Trizol के 1 मिलीलीटर के साथ तरल नाइट्रोजन मुक्त जमे हुए पाउडर homogenates मिश्रण और 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते ।
  3. सेंट्रीफ्यूज ८,००० x g पर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मिश्रण और एक ताजा ट्यूब में supernatant हस्तांतरण और गोली छोड़ दें । 1-ब्रोमो-3-क्लोरोप्रोपेन (BCP) के २०० μL के साथ supernatant मिलाएं । भंवर और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर और बर्फ पर 10 मिनट के लिए मिश्रण सेटे ।
  4. सेंट्रीफ्यूज BCP-4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १८,००० x g पर प्रतिक्रियाओं जोड़ा । एक नया 2 मिलीलीटर ट्यूब में ऊपरी पारदर्शी परत स्थानांतरण और बाकी छोड़ दें । ५०० μL isopropanol मिश्रण और 5 मिनट के लिए ट्यूब उलटा द्वारा के साथ तबादला ऊपरी परत के आरएनए हाला ।
  5. सेंट्रीफ्यूज १८,००० एक्स जी पर ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए । ७५% इथेनॉल के ५०० μL के साथ उपजी आरएनए गोली धो लें ।
  6. आरटी में 5-10 मिनट के लिए आरएनए गोली सूखी । यह बाद में भंग करने के लिए कठिन हो जाएगा के रूप में यह सूखी पर नहीं करने के लिए ध्यान रखना ।
  7. तनु रिबोन्यूक्लिएज अवरोध करनेवाला (1:100) न्यूक्लीस में मुक्त पानी और सूखे आरएनए गोली को पुनः बनाने के लिए समाधान के १०० μL का उपयोग करें । ट्यूब को ध्यान से भंवर जब तक गोली पूरी तरह से भंग है ।
  8. उपाय आरएनए गुणवत्ता और मात्रा । सुनिश्चित करें कि 260/280 अनुपात है लगभग २.० और 260/230 अनुपात की सीमा में 2.0-2.2 ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  9. DNase पाचन के लिए अलग आरएनए के 5 μg का उपयोग करें । 10x बफर के 5 μL मिक्स, ribonuclease अवरोध करनेवाला एंजाइम के 1 μL, DNase एंजाइम के 2 μL, आरएनए के 5 μg, और न्यूक्लिस मुक्त पानी के साथ भरने के लिए ५० μL. सेते 30 मिनट के लिए RT पर ।
    1. inactivation अभिकर्मक के 6 μL और आर टी और भंवर प्रतिक्रिया में 2 मिनट के लिए कभी कभार इनसेबेट जोड़ें । १०,००० एक्स जी में 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज प्रतिक्रिया ताजा १.५ मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण supernatant ।
      नोट: आरएनए में लार्वा आरएनए के साथ-साथ मौखिक प्रशासन के लिए प्रयुक्त होने वाले जीवाणु आरएनए होते हैं ।

5. बल-खिला के बाद बैक्टीरियल 16S कॉपी नंबर की मात्रा परिमाणन

नोट: व्यक्त बैक्टीरियल 16S की प्रतिलिपि संख्या धारा 4 में निकाली गई आरएनए से cDNA संश्लेषित का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । अंतिम परिमाणन का परिकलन प्लाज्मिड के मानक वक्र की सहायता से किया जाता है जिसमें बी -वूल्गेटस अथवा ई -कोलाई के 16s पीसीआर अंश का क्लोन था ।

  1. प्लाज्मिड मानकों की तैयारी
    1. पीसीआर द्वारा ई. कोलाई mpk या B. वल्गेटस MPK जीनोमिक डीएनए से 16S टुकड़ों को बढ़ाना । 5x बफर के 10 μL मिक्स, 10 मिमी dNTP समाधान के 1 μL, 10 μM के २.५ μL फॉरवर्ड प्राइमर और 10 μM के २.५ μL रिवर्स प्राइमर कमजोर पड़ने, DMSO के 1 μL, जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट के 1-l, nuclease के ३१.५ μL-मुक्त पानी और प्रूफ रीडिंग एंजाइम के ०.५ μL.
    2. चलाएं पीसीआर (प्रारंभिक विकृत्करण: 30 s के लिए ९८ ° c, विकृत्करण: 10 s के लिए ९८ ° c, अनीलन: 30s के लिए ६० ° c, एक्सटेंशन: ७२ ° c के लिए 30 s, अंतिम एक्सटेंशन: ७२ ° c के लिए 5 मिनट, दोहराने विकरण, और 30 चक्रों के लिए विस्तार अनीलन) ।
      1. 16s ई. कोलाई प्राइमरों (p_forward का प्रयोग करें: gttaatacctttgctcattga, p_reverse: accagggtatctaatcctgtt17, ३२० bp) या 16s B. वल्गेटस प्राइमर्स (p_forward: aacctgccgtctactctt, p_reverse: caactgacttaaacatccat18, ४०० bp) के लिए प्रवर्धन.
    3. एक क्लोनिंग वेक्टर में कुंद अंत क्लोनिंग के लिए ई. कोलाई और बी. वल्गेटस 16S पीसीआर अंशों का प्रयोग करें । बंधाव सेट अप और 2x बफर के 10 μl, गैर शुद्ध पीसीआर उत्पाद के 1 μl, कुंद अंत क्लोनिंग plasmid के 1 μl, nuclease मुक्त पानी के 7 μl और T4 डीएनए बंधाव के 1 μl मिश्रण । आरटी में 10 मिनट के लिए इनसेबेट बंधाव ।
    4. ई. कोलाई DH5α सक्षम कोशिकाओं को तैयार करें ।
      1. एक रातोंरात संस्कृति के 1 मिलीलीटर के साथ एक Erlenmeyer फ्लास्क में पौंड मध्यम के १०० मिलीलीटर Inoculate । विकास जब तक आयुध डिपो ६०० एनएम 0.4-0.6 के बीच है । २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में परिणामी संस्कृति भाजित और 10 मिनट के लिए बर्फ पर संस्कृतियों सेते ।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १,७०० x g पर संस्कृतियों सेंट्रीफ्यूज । supernatant छोड़ दो और rfi समाधान के 5 मिलीलीटर (30 मिमी CH3कुक, १०० मिमी kcl, 10 मिमी cacl, ५० मिमी mncl2, हिमनदीय एसिड के साथ पीएच ५.८ समायोजित, बाँझ फ़िल्टर) के साथ एक गोली ध्यान से resuspend । RFI समाधान के अतिरिक्त ४५ मिलीलीटर के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें ।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १,७०० x g पर संस्कृतियों सेंट्रीफ्यूज । supernatant छोड़ें और प्रत्येक गोली सावधानी से RFII के 6 मिलीलीटर (10 मिमी MOPS, 15 मिमी CaCl2, 10 मिमी kcl, 15% ग्लिसरोल, autoclaved) समाधान के साथ resuspend । पूल दोनों भागों और 15 मिनट के लिए बर्फ पर 12 मिलीलीटर निलंबन । सेल सस्पेंशन aliquots (२०० μL) तैयार करें । -८० डिग्री सेल्सियस पर aliquots स्टोर ।
    5. सक्षम ई. कोलाई DH5α कोशिकाओं के एक aliquot को बंधाव प्रतिक्रिया स्थानांतरण और 15 मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया छोड़ दें । हीट ४२ डिग्री सेल्सियस पर ४५ एस के लिए कोशिकाओं को झटका और पौंड मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
      1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए इन्सेबेट रूपांतरण । एम्पीसिलीन युक्त एक पौंड आगर थाली में परिवर्तन के १०० μL जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते ।
    6. चरण 5.1.5 के पौंड आगर प्लेट से 8 परिणामी परिवर्तनमेटों की कॉलोनी पीसीआर परफॉर्म करें । एक दंर्तखोदनी के साथ प्रत्येक कॉलोनी उठाओ, यह एम्पीसिलीन (मास्टर प्लेट) युक्त एक ताजा पौंड प्लेट पर डुबकी और फिर एक पीसीआर पट्टी में एक अच्छी तरह से युक्त ५.५ μL में एक ही दंर्तखोदनी डुबकी-मुक्त पानी ।
      1. 2x पीसीआर मिक्स की ७.५ μL, 10 μM फॉरवर्ड प्राइमर की ०.५ μL और 10 μM रिवर्स प्राइमर के कमजोर पड़ने की ०.५ μL जोड़ें । धारा 5.1.1 में उल्लिखित एक ही प्राइमरी पेयर्स का प्रयोग करें ।
      2. चलाएं पीसीआर (प्रारंभिक विकृत्करण: 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस, विकृत्करण: 1 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस, अनीलन: 30s के लिए ६० ° c, विस्तार: ७२ ° c के लिए 1 मिनट, अंतिम विस्तार: ७२ ° c के लिए 7 मिनट, दोहराने विकृत्करण, अनीलन और विस्तार के लिए ३५ चक्र) ।
    7. एक 1% ऐगेरोस जेल पर 16s टुकड़े के आकार की जांच करें । 1 ग्राम एगरोस को भंग करने और इसे माइक्रोवेव में उबालने के लिए 0.5 x Tris-बोरेट-EDTA (TBE) बफ़र का उपयोग करें । जोड़ें 1:50000 डाई जेल और इसे डालो । कॉलोनी पीसीआर प्रतिक्रियाओं और जेल के लिए एक १०० bp डीएनए सीढ़ी जोड़ें, और ११० V पर ४५ मिनट के लिए जेल चलाते हैं ।
    8. एक 5 मिलीलीटर पौंड रातोंरात संस्कृति से युक्त एम्पीसिलीन एक क्लोन के साथ मास्टर प्लेट (धारा 5.1.6) प्रत्येक ई. कोलाई और बी. वल्गेटस 16s प्लाज्मिड कि सही डालने का आकार शामिल है के लिए ।
      1. १,७०० एक्स जीमें एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में बैक्टीरियल रातोंरात संस्कृतियों सेंट्रीफ्यूज supernatant छोड़ें और ६०० μL बाँझ पानी में गोली resuspend ।
      2. lysis बफर की १०० μL जोड़ें और ट्यूब 6 बार उलटा द्वारा मिश्रण । ठंडा (4 ° c) के ३५० μL जोड़ें बेअसर समाधान और अच्छी तरह से मिश्रण ट्यूब उलटा द्वारा ।
      3. 3 मिनट के लिए एक सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति पर सेंट्रीफ्यूज । 15 s के लिए एक सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति पर एक स्पिन कॉलम और सेंट्रीफ्यूज करने के लिए supernatant (~ ९०० μL) स्थानांतरण ।
      4. flowthrough छोड़ें और 15 s के लिए एक सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति पर एंडोटॉक्सिन हटाने धोने और सेंट्रीफ्यूज के २०० μL जोड़ें ।
      5. स्तंभ और 30 एस के लिए एक सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति पर सेंट्रीफ्यूज के लिए धोने के समाधान के ४०० μL जोड़ें. स्तंभ को क्लीन १.५ mL ट्यूब में स्थानांतरित करें, स्तंभ में 30 μL का सेते के लिए 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेटे ।
      6. 30 एस के लिए एक सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति पर सेंट्रीफ्यूज ( सामग्री की तालिकादेखें).
    9. (प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए बफर के प्रति फ्लोरोसेंट डाई का 1 μl) काम समाधान के १९९ μl के साथ प्लाज्मिड डीएनए के 1 μl मिश्रण से प्लाज्मिड डीएनए एकाग्रता का निर्धारण । मानक 1 या १९० μl के साथ मानक 2 के 10 μl के मिश्रण से दो मानकों को तैयार. भंवर नमूना और मानक ट्यूबों और 2 मिनट के लिए इनसेबेट प्रतिक्रिया. एकाग्रता मापने ( सामग्री की तालिकादेखें).
    10. 10-100000 प्रतियों की श्रेणी में 10-गुना धारावाहिक dilutions में मानक सांद्रता तैयार: एकल प्लाज्मिड के द्रव्यमान गणना (एम = (n) x (1.096 x10-21 g/बीपी), n = प्लाज्मिड आकार, एम = द्रव्यमान) । प्लाज्मिड डीएनए के द्रव्यमान की गणना के लिए वांछित ब्याज की प्रतिलिपि संख्या को नियंत्रित करने की आवश्यकता है (एकल प्लाज्मिड के ब्याज की प्रतिलिपि एक्स द्रव्यमान = प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यकता) ।
  2. प्रमाणन के लिए नमूनों की तैयारी
    1. cDNA संश्लेषी । 7x बफर के 2 μL मिश्रण, DNase के 1 μL-पचता आरएनए की धारा 4 और 11 μL से nuclease मुक्त पानी. ४२ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनसेबेट ।
      1. बर्फ पर तुरंत प्रतिक्रिया रखें । मिक्स 5x RT बफर के 4 μL, आरटी के 1 μL (रिवर्स Transcriptase) प्राइमरी मिक्स, आरटी एंजाइम के 1 μL और चरण 5.2.1 की प्रतिक्रिया. ४२ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनसेबेट । 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनसेबेट आरटी एंजाइम सूचनाको करने के लिए ।
    2. चरण 5.1.9 में वर्णित की तरह cDNA सांद्रता फ्लोरोमेट्रिकली Quantify.
  3. जीवाणु भार का मापन
    1. मात्रात्मक पीसीआर के लिए 5 एनजी प्रति 12 μL प्रतिक्रिया करने के लिए cDNA सांद्रता को समायोजित करें । मिक्स 2x आरटी-पीसीआर मिक्स, ०.२५ μL की १०० μM फॉरवर्ड प्राइमरी, ०.२५ μL की १०० μM रिवर्स प्राइमर (5.1.1) और समायोजित cDNA के 12 μL. भागो qPCR (प्रारंभिक विकृत्करण: 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस, विकृत्करण: 10 एस के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस, अनीलन: ६० डिग्री सेल्सियस के लिए 30 एस, दोहराने के लिए और ३५ चक्र के लिए अनीलन, पिघलने: ९५ डिग्री सेल्सियस, शांत नीचे 4 डिग्री सेल्सियस) ।
    2. प्लॉट लॉग10 प्लाज्मिड मानक वक्र की सांद्रता (10-100000 प्रतियां), यानी 1-5 (एक्स अक्ष), इसी सीटी के खिलाफ मूल्यों (y-अक्ष) । प्रतीपगमन समीकरण प्राप्त करने के लिए रेखीय प्रतीपगमन निष्पादित करें । x (एकाग्रता) के लिए समीकरण का समाधान । सूत्र में ct-मान संमिलित करके प्रतिलिपि संख्याओं के लॉग10 की गणना करने के लिए सूत्र का उपयोग करें । प्रतिलिपि संख्या प्राप्त करने के लिए एंटीलॉगेर्थम की गणना करें ।

6. मात्रात्मक आरटी-पीसीआर का उपयोग जन्मजात प्रतिरक्षा मार्कर जीन का निर्धारण

  1. पीसीआर द्वारा जीन विशिष्टता के लिए प्राइमरों की जांच और बाद में ऐगेरोस जेल ट्रो सही टुकड़ा आकार की पुष्टि करने के लिए । अनुभाग 5.1.5 में वर्णित की तरह पीसीआर प्रदर्शन ।
    बैराइटिं १३० bp: आगे TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, रिवर्स CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (हाउसकीपिंग)
    nox-4 १५९ BP: आगे TGGCACGGCATCAGTTATCA, रिवर्स ACAGCGACTGTCATGTGGAA8
    नग ७६ BP: आगे ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, रिवर्स GCCATTTTACAATCGCCACAA8
    Gst १५६ BP: आगे GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, रिवर्स TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8
    apoiii २६५ BP: फॉरवर्ड AGACTTGCACGCCATCAAGA, रिवर्स TGCATGCTGTTTGTCACTGC8
    हेमोलिन २६७ bp: आगे CTCCCTCACGGAGGACAAAC, रिवर्स GCCACGCACATGTATTCACC8
    gallerimycin १६१ bp: आगे GAAGTCTACAGAATCACACGA, रिवर्स ATCGAAGACATTGACATCCA8
    सीकरोपिन १५८ bp: आगे CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, रिवर्स GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8
    gloverin १०१ bp: आगे GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, रिवर्स CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8
    moricin १२४ बीपी: फॉरवर्ड GCTGTACTCGCTGCACTGAT, रिवर्स TGGCGATCATTGCCCTCTTT8)
  2. प्राइमर क्षमता का आकलन करने के लिए ई = 2 ।
    1. पूल 2 5-10 के μL अलग सकारात्मक नमूनों (यानी, नमूने है कि जीन जिसके लिए प्राइमरी जोड़ी की जांच की जरूरत व्यक्त कर रहे हैं) ।
    2. नमूना पूल के एक 1:5 कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार: मानक 1 (S1): unilluted पूल; S2:2 μL के S1 + 8 μL nuclease मुक्त पानी; S3: S2 के 2 μL + 8 μL nuclease मुक्त पानी; S4: S3 के 2 μL + 8 μL nuclease-मुक्त पानी.
    3. एक ९६-अच्छी तरह qPCR प्लेट के लिए 1 μL S1-S4 और एक गैर-टेम्पलेट नियंत्रण (nuclease मुक्त पानी) लागू होते हैं । आर टी मास्टर मिक्स के 5 μL, प्रत्येक १०० μM के ०.१ μL आगे और रिवर्स प्राइमर, nuclease के ३.७ μL मुक्त पानी और अच्छी तरह से प्रति आरटी मिक्स के ०.१ μL जोड़ें ।
    4. रन मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन: 10 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस, प्रारंभिक विकृत्करण: 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस, विकृत्करण: ९५ ° c के लिए 10 s, अनीलन: ६० डिग्री सेल्सियस के लिए 30 एस, दोहराने विकरण और ४० चक्र के लिए अनीलन, पिघलने: ९५ डिग्री सेल्सियस, शांत नीचे 4 डिग्री सेल्सियस
    5. प्लॉट के लिए संबंधित इकाइयों का लॉग10 S1-S4 (1, ०.२, ०.०४, ०.००८) (x-अक्ष) संगत ct-मान (y-अक्ष) के विरुद्ध । रेखीय प्रतीपगमन करते हैं और मानक वक्र की ढलान निर्धारित करते हैं । दक्षता ई की गणना करें: E = 10-(1/ढलान)। 20
      नोट: की एक ढलान-३.३२ आदर्श प्रतिक्रिया शर्तों और E = 2.00 की प्राइमरी क्षमता इंगित करता है । इसका मतलब है: प्रत्येक चक्र के दौरान पीसीआर उत्पाद की राशि दोगुनी हो जाती है ।
  3. आरटी-पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में १०० एनजी का पचता आरएनए (१०० एनजी/μL) का उपयोग करें । मिक्स आरटी-पीसीआर अभिकर्मकों और भागो आरटी-पीसीआर की तरह धारा ६.२ में उल्लेख किया । सभी बैक्टीरिया-और DPBS-दोनों हाउसकीपिंग प्राइमर जोड़ी और लक्ष्य प्राइमर जोड़े के साथ नमूने प्रशासित उपाय । हमेशा हाउसकीपिंग प्राइमर और S1-S4 के साथ लक्ष्य प्राइमर जोड़ी के साथ S1-S4 dilutions चलाने के लिए दक्षता दृढ़ संकल्प के लिए एक ही थाली पर ।
  4. निंनलिखित सूत्र के अनुसार आरएनए जीन अभिव्यक्ति के अनुपात (आर) की गणना दोनों हाउसकीपिंग और लक्ष्य प्राइमर जोड़ी की प्रायोगिक रूप से निर्धारित प्राइमरी दक्षता का उपयोग कर । मानक जीवाणुओं को प्रेरित नमूनों को नकली नियंत्रण20।
    Equation 1
    R: अनुपात
    ईलक्ष्य: S1-4 की क्षमता लक्ष्य प्राइमर जोड़ी के साथ मापा
    ईहाउसकीपिंग: S1-4 की क्षमता हाउसकीपिंग प्राइमर जोड़ी के साथ मापा
    Δctलक्ष्य(नियंत्रण-नमूना): δct (dpbs की सीटी-फेड नमूना)-(बैक्टीरिया की सीटी-खिलाया नमूना) लक्ष्य प्राइमर जोड़ी के साथ मापा
    Δctहाउसकीपिंग(नियंत्रण-नमूना): δct (dpbs की सीटी-फेड नमूना)-(बैक्टीरिया की सीटी-फेड नमूना) हाउसकीपिंग प्राइमर जोड़ी के साथ मापा

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Representative Results

व्यापक रूप से रोगजनकों की एक विशाल विविधता के विरोंस कारकों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया में जी शलभ hemolymph संक्रमण मॉडल । अधिकांश मापन में लार्वा मृत्युदर का विश्लेषण शामिल है, जो काफी आसान तरीका है । फिर भी, इस विधि सामांय में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के बारे में निष्कर्ष की अनुमति नहीं है और कशेरुका प्रतिरक्षा तंत्र के साथ जी शलभ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के परिणाम लिंक । दूसरी ओर जी शलभ मौखिक प्रशासन मॉडल केवल शायद ही कभी मौखिक संक्रमण या कठिनाइयों के कारण लार्वा के उपनिवेशन के लिए प्रयोग किया जाता है सटीक संक्रमण खुराक प्राप्त करने के लिए9. इसके अलावा, केवल थोड़ा जी के बारे में जाना जाता है शलभ गैर के प्रति जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं-रोगजनक बैक्टीरिया विशेष रूप से स्तनधारी आंत्र commensals.

रोगजनकों के विपरीत, commensals मेजबान को चुनौती और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर लेकिन मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रतिरक्षा homeostasis बनाए रखने में सक्षम है । जी शलभ प्रारंभिक बल से तंग आ बैक्टीरियल लोड करने में सक्षम है अंत में अब तक कोई बैक्टीरिया detectable थे (चित्रा 2)8। बी. वल्गेटस और ई. कोलाई दोनों के 16s जीन नकल संख्या में 24 एच के भीतर काफी कमी आई ।

हम उस commensal प्रशासित जी शलभ लार्वा अलग सहज प्रतिरक्षा मार्कर जीन की rna जीन अभिव्यक्ति प्रेरित: lps-मांयता अणुओं-apolipophorin (apoiii) और hemolin (चित्रा 3ए, बी) को आम तौर पर उच्च ई.कोलाई में व्यक्त किए गए लार्वा को बी-वुलगटसप्रशासित लार्वा8की तुलना में दिखाया गया । इसके अतिरिक्त, दो प्रकार के रोगाणुरोधी अणुओं की मार्कर जीन अभिव्यक्ति की निगरानी की जा सकती है । प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियों (आरओज/RNS) के उत्पादन का अनुमान नग और nox-4 जीन एक्सप्रेशन के मापन से लगाया जा सकता है, जिसे बी-कोलाई बल-फीडिंग पर दृढ़ता से प्रदर्शित किया गया था । वल्गेटस (चित्रा 4ए, बी)8. इसके अलावा, एंटियोक्सिडेटिव Gst की जीन अभिव्यक्ति (चित्रा 4सी) देखा जा सकता है । 8

इसके अलावा हमने दिखाया है कि विभिंन रोगाणुरोधी पेप्टाइड अभिव्यक्ति बी के जवाब में की तुलना में ई. कोलाई प्रशासन के बाद मजबूत प्रेरित किया गया था । हम defensin की यूपरेग्लेशन मनाया-जैसे gallerimycin पेप्टाइड, LPS-बातचीत gloverin पेप्टाइड, सीकरोपिन और moricin (चित्रा 5A, B, C, D)8.

Figure 1
चित्रा 1 : बल-खिला सेटअप एक microsyringe पंप का उपयोग कर । एक कुंद-समाप्त सुई माइक्रोसिरिंज पंप जो बैक्टीरिया के सटीक इंजेक्शन की अनुमति देता है में समायोजित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : गैलेरिया शलभ लार्वा में बैक्टीरियल लोड की दृढ़ता के बाद बल खिला । बी. वल्गेटस-और ई.कोलाई-विशिष्ट 16s rdna जीन के नंबरों की प्रतिलिपि आरटी-पीसीआर का उपयोग करके विभिन्न समय बिंदुओं पर cdna के 5 ng से निर्धारित की गई थी । डेटा बिंदुओं को माध्य के संकेत के साथ दर्शाया जाता है । 8 संदर्भ से संशोधित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : विभेदक जी शलभद्वारा बैक्टीरिया के पैटर्न मांयता । लार्वा दो अलग आंतों के साथ प्रशासनिक थे, आरएनए को 1-6 ज के बाद अलग किया गया था, और LPS मान्यता अणु अकोलीपोफोरिन (एपोiii) (ए) और हेमोलिन (बी) का एमआरएनए एक्सप्रेशन निर्धारित किया गया था । डेटा अंक माध्य (SEM) (p > ०.०५; *, p < ०.०५; * *, p < ०.०१; * * *, p < ०.००१) की मानक त्रुटि के साथ ज्यामितीय साधनों का प्रतिनिधित्व करते हैं । 8 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : बैक्टीरियल चैलेंज के बाद ROS मार्कर जीन अभिव्यक्ति । ई. कोलाई और बी. वल्गेटस बल खिलाया और ROS रक्षा मार्कर जीन अभिव्यक्ति समय के साथ विश्लेषण किया गया । नग (A), nox-4 (B) और Gst (C) एमएनए एक्सप्रेशन आइसोलेटेड लारवल आरएनए में मापा गया । डेटा अंक माध्य (SEM) (p > ०.०५; *, p < ०.०५; * *, p < ०.०१; * * *, p < ०.००१) की मानक त्रुटि के साथ ज्यामितीय साधनों का प्रतिनिधित्व करते हैं । 8 संदर्भ से संशोधित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : commensal प्रेरित defensin जी शलभ लार्वा और मानव उपकला कोशिकाओं में रोगाणुरोधी पेप्टाइड अभिव्यक्ति की तरह । लार्वा का मौखिक रूप से बी -वुल्गेटस या ई.कोलाई से प्रबंध किया गया था और समय के साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को देखा गया और आरएनए को लार्वा व्यक्तियों से अलग कर दिया गया । गैलेरीमाइसिन (A), सेफ्रोपिन (B), gloverin (C), moricin (D) एमआरएनए एक्सप्रेशन निर्धारित किया गया था । डेटा अंक माध्य (SEM) (p > ०.०५; *, p < ०.०५; * *, p < ०.०१; * * *, p < ०.००१) की मानक त्रुटि के साथ ज्यामितीय साधनों का प्रतिनिधित्व करते हैं । 8 संदर्भ से संशोधित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

जी शलभ मॉडल एक प्रणालीगत संक्रमण21दृष्टिकोण में बैक्टीरियल डाह कारकों का आकलन करने के लिए एक बार इस्तेमाल किया मॉडल है । के बाद से कई रोगजनकों और बैक्टीरिया मौखिक औपनिवेशीकरण या संक्रमण मार्ग के माध्यम से मेजबान में प्रवेश, नए अंतर्दृष्टि के लिए मौखिक उपनिवेशन और संक्रमण के लिए एक मॉडल के रूप में जी शलभ मूल्यांकन पाया जा करने की आवश्यकता है ।

15-37 के बीच G. शलभ रियर के लिए संभावना है एक महान लाभ के बाद से सबसे स्तनधारी मॉडल ३७ डिग्री सेल्सियस के शरीर के तापमान को बनाए रखने5। G. शलभ लार्वा विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं से खरीदा जा सकता है लेकिन एक ही प्रजनन जनसंख्या की स्थापना ऐसे एंटीबायोटिक दवाओं के अभाव के रूप में कई फायदे प्रदान करता है कि assays के साथ हस्तक्षेप, बेहतर अनुमान जब प्रयोग शुरू करने के लिए चूंकि आपूर्तिकर्ता हमेशा एक रेडी-टू-यूज स्टेज में लार्वा उपलब्ध नहीं कराते हैं और तनाव प्रतिक्रियाओं के कारण परिवहन या तापमान परिवर्तन से बचा जाता है । जी शलभ के तापमान सहिष्णुता के कारण तापमान रेंज जिस पर प्रजनन किया जा सकता है उच्च है । अधिक तापमान के कारण लार्वा का तेजी से विकास होता है और प्रजनन तापमान के अनुसार, हम अंडे से पिछले इन्सर लार्वा के जीवनचक्र का अनुमान लगा सकते हैं । जब लार्वा प्रयोगों के लिए चुने गए थे, तो केवल पीला और तेज़ गति से चलने वाले व्यक्तियों को प्रयोगों में हस्तक्षेप करने के लिए किसी भी तनाव और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए चुना गया था ।

फोर्स फीडिंग मॉडल को स्थापित करने के लिए यह सुनिश्चित करने की जरूरत है कि मौखिक आवेदन सफल रहे । इसलिए, यह कई परीक्षणों जिसके लिए एक मजबूत ब्रोमोफीनॉल डाई बल खिलाने के लिए इरादा समाधान करने के लिए जोड़ा गया था स्थापित करने के लिए मददगार था । यह किसी भी घायल लार्वा को बाहर करने में मदद करता है और लार्वा है कि केवल उनके पेट के भीतर नीले रंग है के लिए चयन22।

इस मॉडल का उपयोग कर, हमने पाया कि जी शलभ लार्वा कुछ मार्कर जीन की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कैनेटीक्स की जांच करने के लिए उपयोगी होते हैं. मौखिक प्रशासन मॉडल की स्थापना और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कैनेटीक्स के अध्ययन के दौरान हम जीन अभिव्यक्ति पाया स्थानीय रूप से midgut में व्यक्त नहीं किया है । पहली प्रायोगिक परीक्षणों के बाद midgut आरएनए निकालने के लिए सहभोजी बैक्टीरिया के मौखिक प्रशासन के निर्णायक परिणाम प्रदान नहीं किया । इसलिए, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं "दुनिया भर में" पूरे व्यक्तियों में निर्धारित किया गया । इन निष्कर्षों आंत्र रिसेप्टर्स के माध्यम से वैश्विक मान्यता की परिकल्पना का समर्थन, सिग्नल के संचरण और आंत्रबाह्य जीन अभिव्यक्ति ट्रिगर. आम तौर पर, जी शलभ मुख्य रूप से वसा शरीर में AMPs प्रेरित करने में सक्षम है, लेकिन आगे hemocytes में और आंतों प्रणाली9. चूंकि, संक्रमण के बाद जी मेललोनेला लार्वा में रोगाणुरोधी अणुओं के ऊतक-विशिष्ट उत्पादन के बारे में कोई सटीक जानकारी उपलब्ध नहीं है, पूरे लार्वा आरएनए को पूर्ण व्यक्तियों से निकाला गया था और इसका उपयोग आरएनए जीन के असेइंग के लिए किया गया था । अभिव्यक्ति. पूरे लार्वा आरएनए निष्कर्षण का एक और लाभ आंत के अंदर रहने वाले बैक्टीरिया की पूरी रोकथाम और बैक्टीरियल लोड मात्रा को निर्धारित करने के लिए संभावना है । आंत की विच्छेदन तैयारी के कारण बैक्टीरिया के नुकसान को जंम दे सकता है ।

के बाद से सबसे जी शलभ अनुसंधान बैक्टीरियल विरूलेंस लक्षण हम विशेष रूप से रुचि रखते थे और कैसे लार्वा गैर रोगजनक बैक्टीरिया है जो स्तनधारी microbiota का हिस्सा है के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर पर किया जाता है । हाल ही में, हमें पता चला कि दोनों जी शलभ और स्तनधारियों सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के समान घटकों का हिस्सा है, जो समजातीय और विकासवादी संरक्षित कर रहे हैं । नाइट्रिक ऑक्सिड सिंथेस (नग) और नेंडफ ऑक्सीडेस (nox) जीन में एक उच्च डिग्री की समानता का हिस्सा8. जी शलभ आगे एक defensin की तरह रोगाणुरोधी पेप्टाइड gallerimycin जो स्तनपायी β-defensin 28के साथ संरचनात्मक समानताएं शेयरों ।

मौखिक प्रशासन मॉडल का उपयोग यह या तो विरोधी भड़काऊ सहजीवी बी vulgatus या समर्थक भड़काऊ रोगजीवी ई.कोलाई के विभेदक जीवाणु मांयता का प्रदर्शन संभव था । इसके अलावा डाउनस्ट्रीम ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाओं और रोगाणुरोधी पेप्टाइड उत्पादन के बाद ई. कोलाई प्रशासन की तुलना में उच्च प्रेरित थे B. vulgatus प्रशासन8।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा वित्त पोषित किया गया dfg (SPP1656), dfg अनुसंधान प्रशिक्षण समूह १७०८, बुंदेममंत्री फर bildung und forschung (bmbf), और जर्मन केंद्र संक्रमण अनुसंधान के लिए (dzif).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Eppendorf 0030120086
100 bp DNA ladder  Thermo Fisher Scientific 15628019
1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) Sigma-Aldrich B9673
2 mL tubes Eppendorf 0030120094
2x Mangomix Bioline BIO-25033 Colony PCR
50 mL tubes Greiner Bio-One 210 261
Agarose Biozym 840004
Beeswax Mixed-Store.de  -
Brain heart infusion broth Thermo Fisher Scientific CM1135
CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific K1232 Cloning vector for 16S fragments
Corn grits Ostermühle Naturkost GmbH 306 Organic cultivation
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Becton Dickinson BD
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Becton Dickinson 244610
DNA-free DNA Removal Kit  Thermo Fisher Scientific 244510  Dnase digestion
Dried yeast Rapunzel  - Organic cultivation
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14040
Ethanol VWR 20821.330
Glycerol Sigma-Aldrich W252506
Honey Ostermühle Naturkost GmbH 487
Isopropanol  VWR 20842.330
Lightcycler 480 Instrument II Roche Molecular Systems 5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Molecular Systems 4729692001
Manual Microsyringe Pump with Digital Display World Precision Instruments DMP
Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm Becton Dickinson 324826 Oral administration
Mortar, unglazed VWR 410-9327 
Nanodrop Thermo Fisher Scientific 13-400-518
Nuclease-free water  Thermo Fisher Scientific 10977035
Oxoid AnaeroGen sachets  Thermo Fisher Scientific AN0025A Quality and quantity of RNA
PCR stripes Biozym 710970
Pestle, unglazed grinding surface VWR 410-9324 
Phusion proof-reading enzyme  Thermo Fisher Scientific F553S
Primers Biomers  -
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit  Qiagen 204056 qPCR for bacterial copy number measurment
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit  Qiagen 204156 qRT-PCR for gene expression measurements
QuantiTect Reverse Transcription Kit  Qiagen 205311 cDNA synthesis
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Scientific Q32856
Qubit dsHS DNA kit  Thermo Fisher Scientific Q32851 Quantification of plasmid and cDNA samples
Qubit fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33226 Quantification of plasmid and cDNA samples
RNase-ExitusPlus AppliChem A7153
Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Skimmed milk powder Sucofin  -
SYBR safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
TRI reagent  Sigma-Aldrich T9424
Weighing boat VWR 10803-148
Wheat meal Ostermühle Naturkost GmbH 6462 Organic cultivation

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References

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