Summary
Здесь мы предоставляем подробный протокол для орального применения модели с использованием Galleria mellonella личинок и как охарактеризовать индуцированной innate иммунных реакций. Используя этот протокол, исследователи без практический опыт будет иметь возможность использовать G. mellonella кормление метод.
Abstract
Исследование иммуногенных потенциал синантропных бактерий на хост иммунной системы является одним из главных компонентов при изучении кишечных хост микробных взаимодействий. Хорошо известно, что различные Комменсалами exhibit различные потенциал для стимулирования кишечной иммунной системы хоста. Такие расследования связаны позвоночных животных, особенно грызунов. Поскольку все этические проблемы связаны с экспериментами с участием позвоночных, существует высокий спрос на беспозвоночных замены моделей.
Здесь мы предоставляем Galleria mellonella орального применения модели с помощью синантропных непатогенные бактерии и возможной оценки иммуногенность потенциал Комменсалами на G. mellonella иммунной системы. Мы демонстрируем, что G. mellonella является полезным альтернативная замена беспозвоночных модель, которая позволяет анализ Комменсалами с различными иммуногенность потенциал как бактериальный vulgatus и Escherichia coli. Интересно, что бактерии выставлены не убийство влияет на личинки, который похож на млекопитающих. Иммунные реакции G. mellonella были сопоставимы с позвоночных innate иммунных реакций и предусматривать признание бактерий и производства антимикробных молекул. Мы предлагаем, что G. mellonella удалось восстановить предыдущий баланс микробиоты, которая хорошо известна из здоровых людей у млекопитающих. Хотя предоставление сопоставимых innate иммунных реакций в G. mellonella и позвоночных, G. mellonella не гавань адаптивной иммунной системы. Так как исследованы компоненты иммунной системы эволюционной сохраняется, модель позволяет биографии и первый анализ бактериальных иммуногенных свойств.
Introduction
Кишечная микрофлора является важным компонентом для поддержания гомеостаза и включает как врожденного и адаптивного иммунного ответа1,2. Синантропных микробиоты сообщество характеризуется различными основными составляющими синантропных: симбионтами, которые наделяют благотворное влияние важных иммуномодулирующих функций, и pathobionts, что может иметь пагубные последствия генетически предрасположены размещает и поощрения и вызвать кишечные воспаления3,4. Многие исследования симбионтами и pathobionts и их влияние на хост иммунной системы были опубликованы главным образом изучение адаптивного иммунного ответа.
Поскольку эти исследования включают много животных для расследования и защиты и замены животных, используемых для экспериментов повышения общественного интереса, мы стремимся найти замену модель позволяет для скрининга различных бактериальных иммуногенность Свойства. Насекомые, особенно Galleria mellonella, являются широко используется замена модели в исследованиях инфекции. G. mellonella сочетает в себе различные преимущества, такие как низкая стоимость и высокая пропускная способность; Это позволяет перорального введения бактерий, которая является естественной подверженности валютному риску маршрут, и он позволяет системной инфекции5,6. G. mellonella далее позволяет инкубации при 37 ° C, который является температура физиологических тела млекопитающих и оптимальной для бактериальных вирулентности фактор выражение5. Основным преимуществом G. mellonella является сохраняемой врожденной иммунной системы, которая позволяет дискриминацию себя от несамоуправляющихся и кодирует различных рецепторов шаблон признание как apolipophorin или опсонин hemolin6, 7. после признания микроба, G. mellonella может вызвать различные течению гуморального иммунного ответа. Это может вызвать реакции окислительного стресса и выделяют реактивнооксигенных видов (ров), который включает в себя деятельность нос (азотная оксидазы синтетазы) и NOX (NADPH оксидаза)6,8. Кроме того, G. mellonella активирует ответ мощным антимикробные пептид (AMP), что приводит к секреции смесь различных усилителей, например gloverin, moricin, цекропин или дефенсина как gallerimycin6, 8,9,10. Как правило усилители имеют довольно широкий принимающей специфику против грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибков и должны предоставить мощный ответ, поскольку насекомых хватает каких-либо адаптивный ответ10. Gloverin является AMP, активен против бактерий и грибков и тормозит формирование внешней мембраны6,11. Moricins выставку их антимикробной функция против грамположительных и грамотрицательных бактерий, проникая мембраны и формировании порового9,11. Cecropins обеспечивают деятельность против бактерий и грибков и разрушения мембраны аналогично как moricins9,10. Gallerimycin – это пептид дефенсина как с противогрибковыми свойствами9. Интересно, что было установлено, что сочетание цекропин и gallerimycin имеют синергетический активность против E. coli10.
Из-за их легкой в использовании символов G. mellonella личинки являются инфекции часто используется модель для оценки бактериальных патогенности. В частности исследования, в которых данные, полученные из G. mellonella коррелируют с данными, полученными от мышей поддержки сила этой модели альтернативного размещения. Было установлено, что наиболее патогенных серотипов Listeria моноцитогенес в мышиной модели инфекции приведет также к более высокой смертности в G. mellonella после системной инфекции. Кроме того менее вирулентные серотипов оказался также менее вирулентные в G. mellonella модель12. Аналогичные замечания были сделаны с человека патогенных грибов Candida albicans. Вирулентность из различных C. albicans штаммов была проведена системной инфекции и последующий мониторинг личиночной выживания. Мышь avirulent штаммы были также avirulent или выставлены снижение вирулентности в G. mellonella, в то время как мыши вирулентных штаммов приведет также к высокой смертности личиночной13. G. mellonella модель может далее использоваться для идентификации типа 3 секрецию системы факторов патогенности Pseudomonas aeruginosa14.
Поскольку большинство расследований с участием G. mellonella были сосредоточены на факторы вирулентности, используя подход системной инфекции мы были особенно заинтересованы в предоставлении метода для анализа кишечных Комменсалами в устной кормление модель, в которой мы можем применить собственный дозировка бактерий на личинки и не только наблюдать личиночной смертности но анализировать различные клейма innate иммунных реакций для поддержания гомеостаза кишечника.
Наш метод помогает увеличить использование G. mellonella как замена модели, так как мы сочетаем применение бактерий и анализ выражения RNA. Это не только полезно для укрепления смысл исследования бактериальной патогенеза, когда включая анализ иммунных реакций после перорального и не только наблюдение за смертности после системной инфекции. Наши методы позволяет для анализа иммуногенные свойства бактериальных непатогенные Комменсалами, поскольку это обеспечивает более сложные условия, чем культуры клеток, предлагая кишечный барьер в живом организме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. G. mellonella воспитания и подготовки личинок для экспериментов
Примечание: Цикл от яйца до последнего Инстар личинка занимает приблизительно 5-6 недель.
- Передача яиц взрослых бабочек 2 L коробки, содержащие восковой моли субстрата (22% кукурузная, 22% пшеницы еды, 17,5% пчелиного воска, 11% обезжиренное сухое молоко, мед 11%, 11% глицерина, 5,5% сушеных дрожжей). Выполните весь разводить на 30 ° C в темноте.
- Передача 25 g субстрата, содержащие личинки в свежий субстрат после примерно 1-2 недели, когда небольшие и крошечные личинки были видны. Синхронизировать личинок после 2 недель в зависимости от их размера и держать групп личинок 30-40 в 2 Л контейнеров на восковой моли субстрат для дополнительных 2 недели.
- Выберите личинок для экспериментов по весу. Используйте только бледный и быстро движущихся личинки с массой 180-200 мг.
2. выращивание и подготовка бактериальный vulgatus и синегнойной палочки для орального применения
- Расти облигатные анаэробные бактерии бактериальный vulgatus МПК при 37 ° C анаэробно с помощью банок и пакетики для создания анаэробных условий (см. Таблицу материалы)15,16. Культивировать B. vulgatus за 2 дня и расти на ночь субкультуры в мозг сердца инфузии (BHI) бульон.
- Расти факультативно анаэробные бактерии Escherichia coli МПК в аэробных условиях в бульоне Лурия Бертани (LB) при 37 ° C. Культивировать E. coli на ночь в LB отвара и расти субкультуры втечение 2 ч при 37 ° C в день эксперимента.
- Урожай культур центрифугированием в 1700 x g 5 мин Ресуспензируйте бактериальных гранул в DPBS (Дульбекко Phosphate-Buffered соли). Определения оптической плотности бактериальных культур на од 600 Нм (ОД) и рассчитать концентрации бактерий. Бактериальные концентрации были скорректированы 109/мл.
3. кормление личинок G. mellonella с бактериальных суспензий
- Кормить каждый личинка с 10 мкл скорректированного бактериальных суспензии, содержащей 107 бактерий на дозу. Используйте инсулин шприц с иглой туп законченному для перорального применения бактериальной подвески.
- Исправить шприц в microsyringe насос (рис. 1) для обеспечения точности прикладной подвеска тома каждого личинка (см. Таблицу материалы). Вставьте шприц осторожно между их мандибулы. Не заставляйте шприц между мандибулы. Ждать для личинок открыть его ротовые органы и затем вставьте шприц.
- Инкубируйте force-fed личинок в темноте при 37 ° C между управлением использования DPBS личинок 1-24 ч. как макет фона элементов управления для исключения потенциальной реакции стресса, индуцированного из-за обработки личинки во время кормление.
4. обработка перорального личинок и РНК изоляции
- Работа под капотом и носить защитные очки. Очистите капотом и спрей реагент для предотвращения загрязнения РНКазы.
- Snap замораживания живых личинок после инкубации в жидком азоте и гомогенизации их. Используйте ступку и пестик для гомогенизации. Добавьте жидкого азота для минометов и сетки каждого личинок, пока пудры гомогенатах производятся.
- Залить огневки на одноразовый весом катера и ждать для жидкого азота для испарения.
- Смесь жидкого азота бесплатно замороженные сухие гомогенатах с 1 мл раствора Тризол в 2-мл пробирку и инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Центрифуга смеси на 8000 x g 15 мин при комнатной температуре и передачи супернатант в свежий трубку и отбросить гранулы. Смешайте супернатант с 200 мкл 1-бром-3-Chloropropane (BCP). Вортекс и инкубировать смесь за 5 мин при комнатной температуре и за 10 минут на льду.
- Центрифуга для BCP-Добавлено реакции на 18,000 x g 15 мин при 4 ° C. Перевести прозрачный верхний слой в новом 2-мл пробирку и отбросить все остальное. Осадок РНК передаваемых верхнего слоя с 500 мкл изопропиловый спирт путем смешивания и инвертирование трубки для 5 мин.
- Центрифуга для трубки на 18,000 x g 15 мин при 4 ° C. Помойте лепешка осажденный РНК с 500 мкл 75% этанола.
- Сухие гранулы РНК 5-10 мин на RT. Позаботьтесь, чтобы не над высушить его, как это будет трудно растворить позже.
- Разбавить Ингибитор рибонуклеазы (1: 100) в свободной от нуклеиназы воду и использовать 100 мкл раствора Ресуспензируйте сухие гранулы РНК. Вихревой трубе тщательно до полного растворения гранул.
- Мера РНК качество и количество. Убедитесь, что соотношение 260/280 приблизительно 2.0 и 260/230 отношение в диапазоне 2,0-2,2 (см. Таблицу материалы).
- Использование 5 мкг изолированных РНК для DNase пищеварения. Mix 5 мкл 10 x буфер, 1 мкл рибонуклеазы ингибитора фермента, 2 мкл DNase фермента, 5 мкг РНК, и заполнить с нуклеиназы свободной воды до 50 мкл. инкубировать 30 мин на RT.
- 6 мкл Реагента инактивации и проинкубируйте 2 мин в RT и вихревой реакция иногда. Центрифуга для реакции на 10000 x g за 1 мин передачи супернатант в свежие 1,5 мл трубку.
Примечание: РНК содержит личиночной РНК, а также бактериальных РНК соответствующих штамма, используемых для перорального применения.
- 6 мкл Реагента инактивации и проинкубируйте 2 мин в RT и вихревой реакция иногда. Центрифуга для реакции на 10000 x g за 1 мин передачи супернатант в свежие 1,5 мл трубку.
5. Количественная оценка бактериальной 16S копировать номера после кормление
Примечание: Копия количество выраженной бактериальных 16S было определено с помощью cDNA, синтезированных из РНК добывается в разделе 4. Окончательный количественная оценка рассчитывается с помощью стандартной кривой плазмида, в котором был клонирован 16S ПЦР фрагмент B. vulgatus или E. coli .
- Подготовка стандартов плазмиды
- Усилить 16S фрагменты из E. coli МПК или B. vulgatus МПК геномной ДНК методом ПЦР. Смесь 10 мкл 5 x буфер, 1 мкл 10 мм dNTP раствора, 2,5 мкл 10 мкм вперед грунтовка и 2,5 мкл обратный грунтовка разбавления 10 мкм, 1 мкл ДМСО, 1 мкл геномной ДНК шаблона, 31.5 мкл нуклеиназы свободной воды и 0,5 мкл корректорские фермента.
- Запустите ПЦР (первоначальный денатурации: 98 ° C за 30 s, денатурации: 98 ° C 10 s, отжиг: 60 ° C за 30 лет, расширение: 72 ° C для 30 s, окончательное расширение: 72 ° C за 5 мин, повторить денатурации, отжига и расширение для 30 циклов).
- Используйте 16S E. coli грунтовки (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) или грунтовки 16S б. vulgatus (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) для усиление.
- E. coli и б. vulgatus 16S ПЦР фрагменты используются для клонирования туп конца в вектор клонирования. Настройка перевязки и смешать 10 мкл 2 x буфер, 1 мкл-очищенный продукт PCR, туп конца клонирования плазмиды, 7 мкл нуклеиназы свободной воды и 1 мкл T4 ДНК лигаза 1 мкл. Инкубировать перевязки для 10 мин на RT.
- Подготовьте компетентных клеток кишечной палочки DH5α.
- Прививать 100 мл с 1 мл раствора на ночь культуры LB среды в колбу Эрленмейера. Растут культуры, до тех пор, пока ОД 600 Нм составляет 0,4-0,6. Разделить два 50 мл трубки результате культуры и инкубировать культур на льду за 10 мин.
- Центрифуга культур на 1700 x g 10 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте каждой лепешки тщательно с 5 мл раствора RFI (30 мм CH3Кука, 100 мм KCl, 10 мм CaCl, 50 мм НКД2, настроить pH 5,8 ледниковых кислотой, стерильные фильтруется). Заполните каждую пробирку с дополнительных 45 мл раствора RFI.
- Центрифуга культур на 1700 x g 10 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте каждой лепешки тщательно с 6 мл RFII (МОПЫ 10 мм, 15 мм CaCl2, 10 KCl, 15% глицерина, газобетона) решения. Бассейн обеих фракций и инкубировать 12 мл суспензии на льду для 15 минут подготовки клетки подвеска аликвоты (200 мкл). Хранить аликвоты-80 ° c.
- Передача реакции перешнуровки в одной Алиготе сведущее Escherichia coli DH5α клеток и оставьте реакция на льду на 15 мин тепловой шок клетки для 45 s при 42 ° C и добавьте 1 mL фунта среды.
- Инкубировать преобразование для 45 минут при 37 ° C. 100 мкл преобразования к пластине агар LB, содержащий ампициллина и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
- Выполните колонии PCR 8 результате трансформантов от плиты агара LB шага 5.1.5. Выберите каждой колонии с зубочисткой, окунуть его на свежий LB пластину, содержащий ампициллина (мастер плита) и затем окуните же зубочистки в хорошо содержащие 5.5 мкл нуклеиназы свободной воды в PCR полосой.
- Добавьте 7,5 мкл 2 x PCR смеси, 0.5 мкл 10 мкм вперед грунтовка и 0,5 мкл 10 мкм обратный грунтовка разрежения. Используйте же пары праймера, упомянутые в разделе 5.1.1.
- Запуск ПЦР (первоначальный денатурации: 95 ° C за 5 мин, денатурации: 95 ° C в течение 1 мин, отжиг: 60 ° C за 30 лет, расширение: 72 ° C в течение 1 мин, окончательное расширение: 72 ° C для 7 мин, повторить денатурации, отжига и расширение для 35 циклов).
- Проверьте размер фрагментов 16S на геле агарозы 1%. Используйте 0.5 x буфер Tris-Борат-ЭДТА (КЭ) растворить 1 g агарозы и варить его в микроволновую печь. Добавьте картографирования краситель гель и полить его. Добавьте реакций PCR колонии и 100 лестница ДНК bp гель и Побегите гель для 45 мин на 110 V.
- Прививать 5 мл LB ночь культуры, содержащий ампициллина с один клон от главной пластины (раздел 5.1.6) для каждого E. coli и б. vulgatus 16S плазмида, содержащий размер правой вставки.
- Центрифуга бактериальных культур на ночь в 2-мл пробирку в 1700 x g. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле в 600 мкл стерильной водой.
- Добавьте 100 мкл буфера lysis и микс, инвертирование трубка 6 раз. 350 мкл холода (4° C) нейтрализации раствора и перемешать тщательно, инвертирование трубки.
- Центрифуги на максимальной скорости в центрифуге на 3 мин супернатант (~ 900 мкл) передать спин столбец и центрифуги на максимальной скорости в центрифуге для 15 s.
- Отменить проточные и 200 мкл эндотоксина удаления мыть и центрифуги на максимальной скорости в центрифуге для 15 s.
- Добавить 400 мкл промывочного раствора в столбце и центрифуги на максимальной скорости в центрифуге для 30 s. передачи столбец для чистой 1,5 мл, добавить Инкубируйте 30 мкл буфера в столбце 1 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга с максимальной скоростью в центрифуге для 30 s (см. Таблицу материалы).
- Определение концентрации ДНК плазмиды путем смешивания 1 мкл плазмидной ДНК с 199 мкл рабочего раствора (1 мкл флуоресцентные краски за 199 мкл буфера для каждой реакции). Подготовка двух стандартов путем смешивания 10 мкл стандартных 1 или 10 мкл стандарт 2 с 190 мкл. Vortex образца и стандартных труб и инкубировать реакции на 2 мин измерения концентрации (см Таблицу материалы).
- Подготовка стандартной концентрации в 10 раз серийных разведений в диапазоне 10-100 000 копий: расчет массы одного плазмида (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = размер плазмида, m = масса). Рассчитать массу плазмидной ДНК, необходимо содержать числа желаемых копирования интерес (копировать количество интерес x масса одного плазмида = масса плазмидной ДНК требуется).
- Подготовка образцов для количественной оценки
- Синтез cDNA. Смешайте 2 мкл буфера 7 x, 1 мкл DNase переваривается РНК из раздела 4 и 11 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Проинкубируйте 2 мин при 42 ° C.
- Место немедленно реакция на льду. Смешайте 4 мкл 5 x RT буфер, 1 мкл смеси праймера RT (обратная транскриптаза), 1 мкл RT фермента и реакция шага 5.2.1. Инкубируйте 15 мин при 42 ° C. Инкубируйте 3 мин при 95° C для инактивации RT фермента.
- Количественно cDNA, концентрации, fluorometrically, как описано в шаге 5.1.9.
- Синтез cDNA. Смешайте 2 мкл буфера 7 x, 1 мкл DNase переваривается РНК из раздела 4 и 11 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Проинкубируйте 2 мин при 42 ° C.
- Измерение бактериальной нагрузки
- Отрегулируйте cDNA концентрации до 5 нг на 12 мкл реакции для количественного PCR. Смешайте 2 x ПЦР-микс, 0,25 µL 100 мкм вперед грунтовки, 0,25 µL 100 мкм обратный праймера (5.1.1) и 12 мкл скорректированных cDNA. Запуск ПЦР (первоначальный денатурации: 95 ° C за 5 мин, денатурации: 95 ° C 10 s, отжиг: 60 ° C за 30 s, повторных денатурации и отжига для 35 циклов, плавления: 95 ° C, остыть до 4 ° C).
- Печать журнала10 концентрации плазмида калибровочной кривой (10-100 000 экземпляров), т.е. 1-5 (ось x), против соответствующих ct значений (ось y). Линейной регрессии для получения уравнение регрессии. Решите уравнение для x (концентрации). Используйте формулу для расчета журнала10 чисел копирования, вставив ct значение в формулу. Вычислите обратным логарифмом для получения копии номеров.
6. Определение innate иммунных маркеров генов с помощью количественного RT-PCR
- Проверьте что электрофорез проверить размер правильный фрагмент геля Праймеры для гена специфичности ПЦР и последующего агарозы. Выполняйте PCR как описано в раздел 5.1.5.
130 убиквитин bp: вперед TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, обратный CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (домоустройство)
Nox-4 159 bp: вперед TGGCACGGCATCAGTTATCA, обратный ACAGCGACTGTCATGTGGAA8
Nos 76 bp: вперед ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, обратный GCCATTTTACAATCGCCACAA8
Gst 156 bp: вперед GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, обратный TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8
ApoIII 265 bp: вперед AGACTTGCACGCCATCAAGA, обратный TGCATGCTGTTTGTCACTGC8
hemolin 267 bp: вперед CTCCCTCACGGAGGACAAAC, обратный GCCACGCACATGTATTCACC8
gallerimycin 161 bp: вперед GAAGTCTACAGAATCACACGA, обратный ATCGAAGACATTGACATCCA8
bp цекропин 158: вперед CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, обратный GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8
gloverin 101 bp: вперед GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, обратный CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8
moricin 124 bp: вперед GCTGTACTCGCTGCACTGAT, обратный TGGCGATCATTGCCCTCTTT8) - Оценить эффективность праймера быть E = 2.
- Бильярд 2 мкл 5-10 различных положительных образцов (например, образцы, которые выражением генов, для которого пара грунт необходимо выяснить).
- Подготовить серию разбавления 1:5 Пример пула: стандарт 1 (S1): неразбавленный бассейн; S2: 2 мкл S1 + 8 свободной от нуклеиназы мкл воды; S3: 2 мкл S2 + 8 свободной от нуклеиназы мкл воды; S4: 2 мкл S3 + 8 мкл нуклеиназы свободной воды.
- Применять 1 мкл S1-S4 и элемент управления-шаблон (нуклеиназы свободной воды) 96-луночных ПЦР пластины. Добавьте 5 мкл RT мастер смеси, 0.1 мкл каждого 100 мкм прямого и обратного грунт, 3.7 мкл нуклеиназы свободной воды и 0.1 мкл RT смеси в скважины.
- Запуск количественного RT-PCR (обратный транскрипции: 50 ° C за 10 мин, первоначальный денатурации: 95 ° C за 5 мин, денатурации: 95 ° C 10 s, отжиг: 60 ° C за 30 s, повторных денатурации и отжига для 40 циклов, плавления: 95 ° C, остыть до 4 ° C).
- Участок войти10 относительных единиц для S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0,008) (ось x) против соответствующих ct значений (ось y). Линейной регрессии и определить наклон калибровочной кривой. Расчет эффективности E: E = 10-(1/slope). 20
Примечание: Склон -3.32 указывает условия идеальные реакции и грунтовка эффективности E = 2.00. Это означает: удваивает количество ПЦР продукта во время каждого цикла.
- Использование 100 нг переваривается РНК (100 нг/мкл) как шаблон для RT-PCR. Mix-ПЦР реактивы и выполнения RT-PCR как упоминалось в разделе 6.2. Измерьте все образцы бактерий и DPBS ведении уборка пары праймера и целевой грунтовка пар. Всегда запускайте разведений S1-S4 с уборка пары праймера и S1-S4 с парой грунтовка целевой же пластина для определения эффективности.
- Вычислите коэффициент (R) экспрессии генов РНК по следующей формуле с использованием экспериментально определены грунтовка эффективности хозяйствования и пары праймера целевой. Нормализовать бактерий стимулируется образцы макет элементов управления20.
R: коэффициент
EЦель: эффективность S1-4 измеряется с целевой грунтовка пара
Eведение домашнего хозяйства: эффективность S1-4 измеряется парой уборка грунтовка
Δctцели(контроль образец): Δct (ct DPBS-кормили образца)-(ct бактерий кормили образца) измеряется с целевой грунтовка пара
Δctуборка номера(контроль образец): Δct (ct DPBS-кормили образца)-(ct бактерий кормили образца) измеряется с уборка грунтовка пара
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
G. mellonella гемолимфа инфекции модель широко используется для анализа факторов вирулентности огромное разнообразие патогенов. Большинство измерения включают анализ смертности личинок, который представляет собой довольно простой метод. Тем не менее этот метод не позволяют в целом выводы о иммунных реакций и связать результаты G. mellonella иммунных реакций с позвоночных иммунные механизмы. G. mellonella орального применения модели с другой стороны только редко используется для инфекции ротовой полости или колонизации личинок из-за трудности для получения точного инфекции доза9. Кроме того только мало что известно о G. mellonella innate иммунных реакций к непатогенные бактерии особенно млекопитающих кишечных Комменсалами.
В отличие от патогенов Комменсалами вызов хост и триггеров иммунного ответа, но принимающей иммунная система способна осуществлять иммунного гомеостаза. G. mellonella способен очистить первоначальный force-fed бактериальной нагрузки до тех пор, пока наконец не бактерии были обнаруживаемыми больше (рис. 2)8. 16s номеров копии гена б. vulgatus и е. coli существенно снизилась в течение 24 ч.
Мы показали, что под управлением синантропных G. mellonella личинки вызывают экспрессию генов РНК различных врожденного иммунитета маркерных генов: LPS-признание молекул - apolipophorin (ApoIII) и hemolin (рис. 3A, B) были показаны выше обычно выражаются в E. coli-ведении личинки, по сравнению с б. vulgatus-ведении личинки8. Кроме того можно контролировать маркер экспрессии генов двух видов антимикробной молекул. Производство кислорода и азота (ROS/RNS) может быть оценена путем измерения нос и Nox-4 экспрессии генов, которые были продемонстрированы, сильно upregulated на E. coli кормление по сравнению с б. vulgatus (рис. 4A, B)8. Кроме того выражение гена антиоксидантной Gst может наблюдаться (рис. 4C). 8
Кроме того мы показали, что различные антимикробного пептида выражение было индуцированной сильнее после приема E. coli чем в ответ на кормление б. vulgatus . Мы наблюдали upregulation дефенсина как gallerimycin пептид, LPS-взаимодействие gloverin пептид, цекропин и moricin (рис. 5A, B, C, D)8.
Рисунок 1 : Кормление установки, с помощью насоса microsyringe. Иглы, туп законченному корректируется в microsyringe насос, который позволяет точно инъекций бактерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Сохранение бактериальной нагрузки в Galleria mellonella личинок после кормление. Скопируйте число B. vulgatus- и E. coli-конкретных 16s рДНК генов были определены от 5 нг cDNA в разное время точек с помощью RT-PCR. Точки данных приведены с указанием медиана. Изменение от ссылки 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Дифференциальные распознавание бактерий, G. mellonella. Личинки были администрируемых с двух различных кишечных Комменсалами, РНК был изолирован после 1-6 h, и выражение mRNA LPS признание молекулы apolipophorin (ApoIII) (A) и hemolin (B) был определен. Точки данных представляют геометрическими с Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0.01; ***, p < 0,001). 8 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : ROS маркер экспрессии генов после бактериальной вызов. E. coli и б. vulgatus были force-fed и ROS обороны маркер экспрессии генов был проанализирован с течением времени. Нос (A), Nox-4 (B) и (C) Gst выражение mRNA была измерена в изолированных личиночной РНК. Точки данных представляют геометрическими с Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0.01; ***, p < 0,001). Изменение от ссылки 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Выражение commensal индуцированной дефенсина как антимикробного пептида в G. mellonella личинок и человеческих эпителиальных клеток. Личинки были перорально с б. vulgatus или E. coli, иммунные реакции наблюдались с течением времени, и РНК была изолирована от личинок лиц. gallerimycin (A), цекропин (B), gloverin (C), moricin (D) выражение mRNA было определено. Точки данных представляют геометрическими с Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0.01; ***, p < 0,001). Изменение от ссылки 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. mellonella модель является моделью часто используется для оценки факторов вирулентности бактерий в системной инфекции подход21. Поскольку многие патогенные микроорганизмы и бактерии попадают принимающей страны через пероральном колонизации или инфекции, новые идеи должны быть найдены для оценки G. mellonella как модель для устного колонизации и инфекции.
Возможность сзади G. mellonella между 15-37 ° C является большим преимуществом, поскольку наиболее млекопитающих модели поддерживают тело температура 37 ° C5. G. mellonella личинки могут быть приобретены у разных поставщиков, но создание собственного размножения населения дает множество преимуществ, таких как отсутствие антибиотиков, которые вмешиваются с анализов, лучше оценки, когда начать эксперименты Поскольку поставщики не всегда обеспечивают личинок в стадии готовые к использованию и избежать стресса ответы вследствие перевозки или изменения температуры. Из-за температуры толерантности G. mellonella температурный диапазон, на котором может быть выполнена разведения является высоким. Повышение температуры приведет к быстрее развития личинок и зависимости от разведения температуры, мы можем оценить жизненного цикла от яйца до последнего Инстар личинка. Когда личинки были отобраны для экспериментов, только бледно и быстро движущихся людей были выбраны как избежать стресса и иммунной реакции вмешиваться с экспериментов.
Чтобы установить принудительное модель, она должна быть уверены, что устное заявление было успешным. Таким образом было бы полезно создать несколько судебных процессов, для которых сильный бромфеноловый красителем был добавлен в решение предназначенных для кормление. Это позволяет исключить любое потерпевшее личинок и выбрать для личинок, которые имеют синий краситель только в их кишечнике22.
С помощью этой модели, мы обнаружили, что G. mellonella личинки являются полезными для изучения кинетики врожденный иммунный ответ некоторых маркерных генов. Во время создания модели перорального и исследование кинетики иммунного ответа мы нашли выражение гена не выражаться локально в средняя. Первый экспериментальных испытаний для извлечения средняя РНК после перорального введения синантропных бактерий не дают убедительных результатов. Таким образом иммунные реакции были определены «глобально» в целом лиц. Эти выводы подтверждают гипотеза глобальное признание через кишечную рецепторов, передача сигнала и вызывая экспрессии генов extraintestinal. Как правило G. mellonella возможность побудить AMPs главным образом в организме жир, но в hemocytes и кишечной системы9. Поскольку Есть нет точной информации о производстве тканей конкретных антимикробной молекул в G. mellonella личинок после инфекции, весь личиночной РНК было извлечено от полного лица и используется для assaying гена РНК выражение. Еще одним преимуществом всего личиночной РНК добыча является полная вложенность живых бактерий в кишечнике и возможность количественно бактериальной нагрузки. Рассечение кишечнике может привести к потере бактерий благодаря подготовке.
Поскольку большинство G. mellonella исследований осуществляется на бактериальных вирулентности черты мы были особенно заинтересованы, если и как личинки вызвать иммунных реакций к непатогенные бактерии, которые являются частью млекопитающих микробиоты. Недавно мы показали, что G. mellonella и млекопитающих разделяют подобные компоненты врожденный иммунный ответ, гомологичных и эволюционной сохраняется. Синтаза оксида азота (Nos) и NADPH оксидаза (Nox) генов имеют высокую степень сходства8. G. mellonella гаваней далее антимикробного пептида дефенсина как gallerimycin, которое разделяет структурное сходство с млекопитающих β-дефенсина 28.
С помощью орального применения модели можно было продемонстрировать дифференциальной бактериальных признание противовоспалительные симбиотические B. vulgatus или про воспалительных pathobiotic E. coli. Кроме того после E. coli администрации, по сравнению с б. vulgatus администрации8выше склоняли ответы течению Оксидативный стресс и антимикробного пептида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась DFG (SPP1656), группе подготовки исследования DFG 1708, Bundesministerium und für Bildung Тюрингия (BMBF) и немецкий центр для исследований инфекции (DZIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
