Summary
Här vi tillhandahålla ett detaljerat protokoll för en oral administrering modell använder Galleria mellonella larver och hur att karakterisera inducerad medfödda immunsvar. Användning av detta protokoll, kommer forskare utan praktisk erfarenhet att kunna använda den G. mellonella tvångsmatning metod.
Abstract
Undersökningen av kommensaler bakterier på värd immunsystemet immunogena potential är en viktig komponent när man studerar intestinal värd-mikrobinteraktioner. Det är väletablerat att olika förknippas uppvisar olika potential att stimulera värd intestinal immunförsvaret. Sådana undersökningar inbegriper ryggradsdjur, speciellt gnagare. Eftersom ökande etiska frågor är kopplade till experiment med ryggradsdjur, finns det en hög efterfrågan på ryggradslösa ersättare modeller.
Här ger vi en Galleria mellonella oral administrering modell använder kommensaler icke-patogena bakterier och bedömningen som möjligt av förknippas immunogena potential på G. mellonella immunsystemet. Vi visar att G. mellonella är ett användbart alternativ ryggradslösa återinsättande modell som gör analysen av förknippas med olika immunogena potential såsom Bacteroides vulgatus och Escherichia coli. Intressant, uppvisade bakterierna ingen dödande effekt på larverna, som är liknande till däggdjur. Immunsvaret av G. mellonella var jämförbara med ryggradsdjur medfödda immunsvar och omfattar produktion av antimikrobiella molekyler och erkännande av bakterier. Vi föreslår att G. mellonella kunde återställa tidigare bakterieflora balans, vilket är väl känt från friska däggdjur individer. Trots att tillhandahålla jämförbara medfödda immunsvaret hos både G. mellonella och ryggradsdjur, G. mellonella inte hyser en adaptiva immunsystemet. Eftersom de undersökta komponenterna i det medfödda immunsystemet är evolutionär bevarad, tillåter modellen en prescreening och första analys av bakteriell immunogena egenskaper.
Introduction
Den intestinala mikrobiomet är en viktig komponent för underhåll av homeostas, och innebär både medfödd och adaptiv immunsvar1,2. Kommensaler bakterieflora gemenskapen kännetecknas av olika kommensaler huvudbeståndsdelar: symbionter som ger positiva effekter av viktiga immunmodulerande funktioner och pathobionts som kan ha skadliga effekter i genetiskt predisponerade värd och främja och utlösa tarminflammation3,4. Många studier på symbionter och pathobionts och deras påverkan på immunsystemet värd har publicerats främst studera adaptiva immunsvaret.
Eftersom dessa studier involvera många djur för utredningarna och skydd och byte av djur som används för experiment är att öka allmänhetens intresse, försöker vi hitta en ersättare modell som möjliggör en screening av olika bakteriell immunogena egenskaper. Insekter, särskilt Galleria mellonella, är en allmänt använd ersättare modell i infektionsforskning. G. mellonella kombinerar olika fördelar såsom låga kostnader och hög genomströmning; Det gör att oral administrering av bakterier, som är den naturliga exponeringsvägen, och gör det möjligt för systemisk infektion5,6. G. mellonella ytterligare möjliggör inkubation vid 37 ° C, vilket är fysiologiska kroppstemperaturen hos däggdjur och optimaln för bakteriell virulens faktor uttryck5. Den största fördelen med G. mellonella är bevarade medfödda immunsystemet som möjliggör diskrimineringen av jaget från icke-jaget och kodar en mängd mönster erkännande receptorer som apolipophorin eller den opsonin hemolin6, 7. vid mikrob erkännande, G. mellonella kan utlösa olika nedströms humorala immunsvar. Det kan framkalla oxidativ stress svaren och utsöndrar reaktiva syreradikaler (ROS) som innebär att aktiviteten av ändringsförslagen (nitrat oxidas synthase) och NOX (NADPH-oxidas)6,8. Dessutom G. mellonella aktiverar ett potent antimikrobiell peptid (AMP) svar, vilket resulterar i utsöndringen av en blandning av olika ampere såsom gloverin, moricin, cecropin eller defensin-liknande gallerimycin6, 8,9,10. Allmänhet, ampere har ganska bred Värdspecificitet mot grampositiva och Gramnegativa bakterier och svampar och att tillhandahålla ett potent svar eftersom insekter saknas någon adaptiva svar10. Gloverin är en förstärkare som är verksamt mot bakterier och svampar och hämmar yttre membran bildas6,11. Moricins uppvisar deras antimikrobiell funktion mot grampositiva och Gramnegativa bakterier med genomträngande membranet och bildar en por9,11. Cecropins ger aktivitet mot bakterier och svampar och permeabilize membranet på samma sätt som moricins9,10. Gallerimycin är en defensin-lik peptid med anti-svamp egenskaper9. Intressant nog fann att kombinationen av cecropin och gallerimycin hade en synergistisk aktivitet mot E. coli10.
På grund av sin lätt-till-använda karaktär G. mellonella är larverna en ofta använd infektion modell att bedöma bakteriell patogenicitet. I synnerhet korrelerar studier i vilka uppgifter som erhållits från G. mellonella med uppgifter som erhållits från möss stöd styrkan i denna alternativa värd modell. Det konstaterades att de mest sjukdomsframkallande serotyperna av Listeria monocytogenes i en musmodell för infektion leder också till högre dödlighet i G. mellonella efter systemisk infektion. Ytterligare, mindre virulenta serotyperna visade sig också vara mindre virulenta i G. mellonella modell12. Liknande observationer har gjorts med de mänskliga patogena svamparna Candida albicans. Virulens olika C. albicans stammar har bedömts av systemisk infektion och efterföljande övervakning av larval överlevnad. Mus Avirulenta stammar var också Avirulenta eller utställda minskad virulens i G. mellonella, medan mus virulenta stammar leda också till hög larval dödlighet13. G. mellonella modellen kan vidare användas för att identifiera typ 3 utsöndring system patogenicitet faktorer av Pseudomonas aeruginosa14.
Eftersom de flesta undersökningar med G. mellonella var fokuserade på virulensfaktorer som använder metoden systemisk infektion var vi särskilt intresserade av att tillhandahålla en metod som är lämplig för analys av intestinal förknippas i en muntlig tvångsmatning modell där vi kan tillämpa en distinkt dosering av bakterier per larver och inte bara iaktta larval dödligheten men analysera olika kontrollstämplar av medfödda immunsvar att upprätthålla tarmens homeostas.
Vår metod bidrar till att öka användningen av G. mellonella som en ersättare modell eftersom vi kombinerar tillämpningen av bakterier och analys av RNA uttryck. Det är inte bara användbart för att stärka innebörden av bakteriell patogenes studier när inklusive analys av immunsvar efter oral administrering och inte bara observation av dödlighet efter systemisk infektion. Våra metoder möjliggör analys av immunogena egenskaper av bakteriell icke-patogena förknippas eftersom det ger mer komplexa villkor än cellodling genom att erbjuda en tarmbarriären i en levande organism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. G. mellonella uppfödning och förberedelse av larverna för experiment
Obs: Cykeln från ägget till senast instar larven tar ungefär 5-6 veckor.
- Överföra de ägg som lagts av vuxna nattfjärilar till 2 L lådor som innehåller vax moth substrat (22% majsgryn, 22% vete måltid, 17,5% bivax, 11% skummjölkspulver, 11% honung, 11% glycerol, 5,5% torkad jäst). Utför hela avel på 30 ° C i mörker.
- Överför 25 g substrat som innehåller larver i färskt substrat efter ca 1-2 veckor när liten och mycket liten larver var synliga. Synkronisera larvaena efter 2 veckor beroende på deras storlek och hålla grupper av 30-40 larver i 2 L behållare på vax moth substrat för ytterligare 2 veckor.
- Välj larvaena för experiment av vikt. Använd bara blek och snabb rörliga larver med en massa 180-200 mg.
2. odling och beredning av Bacteroides vulgatus och Escherichia coli för oral administrering
- Växa de obligat anaerob bakterie Bacteroides vulgatus mpk vid 37 ° C anaerobt med burkar och påsar för att skapa en syrefri miljö (se Tabell för material)15,16. Odla B. vulgatus för 2 dagar och växa en övernattning subkultur i hjärnan hjärtat infusion (BHI) buljong.
- Växa de fakultativt anaeroba bakterien Escherichia coli mpk under aeroba förhållanden i Luria-Bertani (LB) buljong vid 37 ° C. Odla E. coli övernattning i LB buljong och växa subkultur för 2 h vid 37 ° C på dagen för experimentet.
- Skörda kulturerna genom centrifugering vid 1.700 x g för 5 min. Omsuspendera bakteriella pellets i DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered saltlösning). Bestäm bakteriekulturerna på OD 600 nm optiska densitet (OD) och beräkna de bakterie koncentrationerna. De bakteriella koncentrationerna justerades till 109/ml.
3. tvångsmatning av G. mellonella larver med bakteriell upphängningar
- Force-feed varje larv med 10 µL justerade bakteriesuspensionen som innehåller 107 bakterier per dos. Använd en insulinspruta med en trubbig-slutade nål för oral tillämpning av bakteriesuspensionen.
- Fäst sprutan i en mikrosprutan pump (figur 1) för att säkerställa riktigheten av tillämpad suspension volymen till varje larv (se Tabell för material). För in sprutan noggrant mellan sina Underkäkar. Tvinga inte sprutan mellan Underkäkar. Vänta tills larverna öppna den mouthparts och infoga sedan sprutan.
- Inkubera tvångsmatades larverna i mörker vid 37 ° C mellan 1-24 h. användning DPBS administrerat larver som håna bakgrund kontroller att utesluta potentiella stressreaktioner inducerad på grund av hanteringen av larverna under tvångsmatning.
4. behandling av oralt administrerat larver och RNA isolering
- Arbeta under en huv och bära skyddsglasögon. Rengöra huva och spray reagens för att förhindra RNase kontaminering.
- Snapin-frysa levande larver efter inkubation i flytande kväve och homogenisera dem. Använd en mortel och pistill för homogenisering. Tillsätt flytande kväve till murbruk och rutnät varje larval individ tills pulveriserad homogenates produceras.
- Häll blandningen till en disponibel väger båten och vänta på det flytande kvävet att avdunsta.
- Blanda vätskan kvävefri fryst pulveriserad homogenates med 1 mL Trizol i en 2 mL tub och inkubera blandningen i rumstemperatur i 1 h.
- Centrifugera blandningen vid 8000 x g i 15 min i rumstemperatur och överför supernatanten till en frisk slang och kassera pelleten. Blanda supernatanten med 200 µL 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP). Vortex och inkubera blandningen för 5 min i rumstemperatur och 10 min på is.
- Centrifugera BCP-lade reaktionerna vid 18.000 x g i 15 minuter vid 4 ° C. Överför det övre transparenta lagret till en ny 2 mL tub och släng resten. Fällningen RNA i det överförda övre lagret med 500 μl isopropanol genom blandning och vända tuben för 5 min.
- Centrifugera röret vid 18.000 x g i 15 minuter vid 4 ° C. Tvätta den utfällda RNA pelleten med 500 µL av 75% etanol.
- Torka RNA pelleten för 5-10 min på RT. Var noga med att inte över torka det som det blir svårt att lösa upp senare.
- Späd ribonukleasinhibitor (1: 100) i nuclease-gratis vatten och Använd 100 µL av lösningen för att återsuspendera pelleten torkade RNA. Vortex röret försiktigt tills pelleten är helt upplöst.
- Åtgärd RNA kvalitet och kvantitet. Säkerställa att 260/280 förhållandet är cirka 2,0 och 260/230 baserat i intervallet 2,0-2,2 (se Tabell för material).
- Använd 5 µg av isolerade RNA för DNAS matsmältningen. Blanda 5 µL 10 x buffert, 1 µL ribonunkleas hämmare enzym, 2 µL av DNAS enzym, 5 µg av RNA, och fylla upp med nuclease-fritt vatten upp till 50 µL. Inkubera i 30 min på RT.
- Tillsätt 6 µL av inaktivering reagens och inkubera i 2 min på RT och vortex reaktion ibland. Centrifugera reaktion vid 10 000 x g i 1 min. Transfer supernatanten i färska 1,5 mL rör.
Obs: RNA innehåller larver RNA samt bakteriell RNA respektive stam används för oral administrering.
- Tillsätt 6 µL av inaktivering reagens och inkubera i 2 min på RT och vortex reaktion ibland. Centrifugera reaktion vid 10 000 x g i 1 min. Transfer supernatanten i färska 1,5 mL rör.
5. kvantifiering av bakteriell 16S kopiera siffrorna efter tvångsmatning
Obs: Kopiera numrerar av den uttryckta bakteriell 16S bestämdes med cDNA syntetiseras från RNA extraherade i avsnitt 4. Slutliga kvantifiering beräknas med hjälp av en standardkurva av Plasmiden där 16S PCR-fragmentet B. vulgatus eller E. coli klonats.
- Utarbetandet av Plasmiden standarder
- Förstärka 16S fragment från E. coli mpk eller B. vulgatus mpk genomiskt DNA med PCR. Blanda 10 µL av 5 x buffert, 1 µL 10 mM dNTP lösning, 2,5 µL 10 µM framåt primer och 2,5 µL 10 µM reverse primer utspädning, 1 µL av DMSO, 1 µL genomisk DNA-mall, 31,5 µL nuclease-gratis vatten och 0,5 µL av korrekturläsning enzym.
- Köra PCR (inledande denaturering: 98 ° C i 30 s, denaturering: 98 ° C för 10 s, glödgning: 60 ° C för 30s, förlängning: 72 ° C under 30 s, sista förlängning: 72 ° C i 5 min, upprepa denaturering, glödgning och förlängning för 30 cykler).
- Använda 16S E. coli primers (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) eller 16S B. vulgatus primers (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) för förstärkning.
- Använd E. coli och B. vulgatus 16S PCR-fragmenten för blunt-end kloning i en kloning vektor. Ställ in ligering och blanda 10 µL 2 x buffert, 1 µL av icke-renade PCR-produkten, 1 µL blunt-end kloning plasmid, 7 µL nuclease-gratis vatten och 1 µL T4 DNA-Ligase. Inkubera ligering för 10 min vid RT.
- Förbereda E. coli DH5α behöriga celler.
- Inokulera 100 mL LB medium i en Erlenmeyerkolv med 1 mL av en övernattning kultur. Växer kulturen tills OD 600 nm är mellan 0,4-0,6. Dela den resulterande kulturen i två 50 mL rör och inkubera kulturerna på is i 10 min.
- Centrifugera kulturer vid 1.700 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera varje pellet noggrant med 5 mL RFI lösning (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl2, justera pH 5.8 med glaciala syra, sterila filtreras). Fyll varje tub med ytterligare 45 mL RFI lösning.
- Centrifugera kulturer vid 1.700 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera varje pellet noggrant med 6 mL av RFII (10 mM moppar, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% glycerol, lättbetong och autoklaverad) lösning. Pool både bråk och inkubera 12 mL fjädringen på is för 15 min. Förbered cell suspension alikvoter (200 µL). Lagra alikvoter vid-80 ° C.
- Överföra ligering reaktionen på en alikvot av behöriga E. coli DH5α celler och lämna reaktionen på is för 15 min. värme chock cellerna för 45 s vid 42 ° C och tillsätt 1 mL LB medium.
- Inkubera omvandling under 45 minuter vid 37 ° C. Tillsätt 100 µL av omvandlingen till en LB agar tallrik innehållande ampicillin och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Utföra kolonin PCR av 8 resulterande transformants från LB agar plätera av steg 5.1.5. Plocka varje koloni med en tandpetare, doppa den på färska LB plåt innehållande ampicillin (tryckplåt) och sedan doppa den samma tandpetare i en väl innehållande 5,5 µL nuclease-fritt vatten i en PCR-stripe.
- Tillsätt 7,5 µL av 2 x PCR mix, 0,5 µL 10 µM framåt primer och 0,5 µL 10 µM reverse primer utspädning. Använd samma primer paren nämns i avsnitt 5.1.1.
- Köra PCR (inledande denaturering: 95 ° C i 5 min, denaturering: 95 ° C i 1 min, glödgning: 60 ° C för 30s, förlängning: 72 ° C i 1 min, sista förlängning: 72 ° C under 7 min, upprepa denaturering, glödgning och förlängning för 35 cykler).
- Kontrollera storleken på 16S fragment på en 1% agarosgel. Använd 0,5 x Tris-Borat-EDTA (TBE) buffert att lös upp 1 g av agaros och koka den i mikrovågsugn. Lägg till 1: 50000 färg gel och häll det. Lägga till kolonin PCR-reaktioner och en 100 bp DNA stege i gelen och kör gelen för 45 min vid 110 V.
- Inokulera en 5 mL LB övernattning kultur som innehåller ampicillin med en klon från master plattan (avsnitt 5.1.6) för varje E. coli och B. vulgatus 16S plasmiden som innehåller rätt infoga storlek.
- Centrifugera de övernattning bakteriekulturerna i en 2 mL tub vid 1.700 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 600 µL sterilt vatten.
- Tillsätt 100 µL lyseringsbuffert och blanda genom att vända tuben 6 gånger. Tillsätt 350 µL av kall (4° C) neutralisering lösning och blanda noggrant genom att vända tuben.
- Centrifugera vid maximal hastighet i en centrifug för 3 min. överför supernatanten (~ 900 µL) till en spin kolumn och centrifugera vid maximal hastighet i en centrifug för 15 s.
- Kassera att och tillsätt 200 µL av endotoxin borttagning tvätta och centrifugera med maximal hastighet i en centrifug för 15 s.
- Tillsätt 400 µL tvättlösning till kolumnen och centrifugera vid maximal hastighet i en centrifug för 30 s. överföring kolumnen till en ren 1,5 mL tub, tillsätt 30 µL eluering buffert till kolumnen Inkubera det 1 min i rumstemperatur.
- Centrifugera vid maximal hastighet i en centrifug för 30 s (se Tabell för material).
- Fastställa plasmid DNA koncentrationen genom att blanda 1 µL av plasmid DNA med 199 µL av arbetslösning (1 µL av fluorescerande färgämne per 199 µL buffert för varje reaktion). Förbered två standarder genom att blanda 10 µL av standard 1 eller 10 µL av standard 2 med 190 µL. Vortex provet och standardrör och inkubera reaktion för 2 min. mått koncentrationen (se Tabell för material).
- Förbereda standard koncentrationer i 10-faldig seriespädningar i en rad 10-100.000 kopior: beräkning massa enda plasmiden (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = plasmid storlek, m = massan). Beräkna massan av plasmid DNA som behövs för att innehålla önskad kopiera siffrorna av intresse (antal kopior av intresse x massa enda plasmid = massan av plasmid DNA behövs).
- Beredning av prover för kvantifiering
- Syntetisera cDNA. Blanda 2 µL av 7 x buffert, 1 µL DNAS-rötas RNA från avsnitt 4 och 11 µL nuclease-gratis vatten. Inkubera i 2 min på 42 ° C.
- Placera reaktion omedelbart på is. Blanda 4 µL 5 x RT buffert, 1 µL RT (omvänt transkriptas) primer mix, 1 µL RT enzym och reaktionen av steg 5.2.1. Inkubera i 15 min på 42 ° C. Inkubera under 3 min vid 95° C att inaktivera RT enzym.
- Kvantifiera cDNA koncentrationer fluorometrically som beskrivs i steg 5.1.9.
- Syntetisera cDNA. Blanda 2 µL av 7 x buffert, 1 µL DNAS-rötas RNA från avsnitt 4 och 11 µL nuclease-gratis vatten. Inkubera i 2 min på 42 ° C.
- Mätning av bakteriehalten
- Justera cDNA koncentrationer till 5 ng per 12 µL reaktion för kvantitativ PCR. Blanda 2 x RT-PCR-mix, 0,25 µL av 100 µM framåt primer, 0,25 µL av 100 µM reverse primer (5.1.1) och 12 µL av justerade cDNA. Kör qPCR (inledande denaturering: 95 ° C i 5 min, denaturering: 95 ° C under 10 s, glödgning: 60 ° C under 30 s, upprepa denaturering och glödgning för 35 cykler, smältande: 95 ° C, nedvarvning till 4 ° C).
- Rita log10 koncentrationer av Plasmiden standardkurvan (10-100 000 exemplar), dvs 1-5 (x-axeln), mot motsvarande ct-värdena (y-axeln). Utför linjär regression för att erhålla regressionsekvationen. Lösa ekvationen för x (koncentration). Använd formel för att beräkna den log10 kopiera siffrorna genom att infoga ct-värde i formeln. Beräkna antilogaritmen för att erhålla kopia nummer.
6. bestämning av medfödd immun markörgen med kvantitativ RT-PCR
- Kontrollera primers för gen-specificitet av PCR och efterföljande agaros gel elektrofores för att kontrollera rätt fragment storlek. Utför PCR som beskrivs i avsnitt 5.1.5.
Ubiquitin 130 bp: framåt TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, omvänd CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (städning)
Nox-4 159 bp: framåt TGGCACGGCATCAGTTATCA, omvänd ACAGCGACTGTCATGTGGAA8
Nos 76 bp: framåt ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, omvänd GCCATTTTACAATCGCCACAA8
Gst 156 bp: framåt GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, omvänd TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8
ApoIII 265 bp: framåt AGACTTGCACGCCATCAAGA, omvänd TGCATGCTGTTTGTCACTGC8
hemolin 267 bp: framåt CTCCCTCACGGAGGACAAAC, omvänd GCCACGCACATGTATTCACC8
gallerimycin 161 bp: framåt GAAGTCTACAGAATCACACGA, omvänd ATCGAAGACATTGACATCCA8
cecropin 158 bp: framåt CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, omvänd GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8
gloverin 101 bp: framåt GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, omvänd CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8
moricin 124 bp: framåt GCTGTACTCGCTGCACTGAT, omvänd TGGCGATCATTGCCCTCTTT8) - Bedöma primer effektivitet att E = 2.
- Pool 2 µL av 5-10 olika positiva prover (dvs. prover som uttrycker genen som paret primer behöver utredas).
- Bered en serie 1:5 utspädning av provet poolen: standard 1 (S1): outspädd pool; S2: 2 µL av S1 + 8 µL nuclease-fritt vatten; S3: 2 µL av S2 + 8 µL nuclease-fritt vatten; S4: 2 µL av S3 + 8 µL nuclease-gratis vatten.
- Gälla en platta med 96 brunnar qPCR 1 µL S1-S4 och en icke-mall kontroll (nuclease-fritt vatten). Tillsätt 5 µL av RT master mix, 0.1 µL av varje 100 µM framåt och bakåt primer, 3,7 µL nuclease-gratis vatten och 0.1 µL av RT mix per brunn.
- Kör kvantitativ RT-PCR (omvänd transkription: 50 ° C i 10 min, inledande denaturering: 95 ° C i 5 min, denaturering: 95 ° C under 10 s, glödgning: 60 ° C under 30 s, upprepa denaturering och glödgning för 40 cykler, smältande: 95 ° C, nedvarvning till 4 ° C).
- Plot logga10 av relativa enheter för S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0,008) (x-axeln) mot motsvarande ct-värdena (y-axeln). Utför linjär regression och bestämma lutningen på standardkurvan. Beräkna effektivitet E: E = 10-(1/slope). 20
Obs: En lutning på-3.32 indikerar idealiska reaktionsbetingelser och primer effektivitet E = 2,00. Detta innebär: mängden PCR-produkten fördubblas under varje cykel.
- Använd 100 ng av smält RNA (100 ng/µL) som en mall för RT-PCR. Blanda RT-PCR reagens och kör RT-PCR som nämns i avsnitt 6.2. Mäta alla bakterier - och DPBS-administreras prover med både städning primer par och målet primer par. Alltid köra S1-S4 spädningarna med städning primer par och S1-S4 med målet primer paret på samma platta för bestämning av effektivitet.
- Beräkna förhållandet (R) av RNA genuttryck enligt följande formel använder experimentellt bestämd primer effektivitet både hushållningen och paret mål primer. Normalisera bakterier stimuleras prover att håna kontroller20.
R: baserat på
Emål: effektivitet av S1-4 mätt med målet primer par
Estädning: effektivitet av S1-4 mätt med städning primer par
Δctriktade(kontroll-prov): Δct (CT DPBS matad prov)-(ct av bakterier matad prov) mätt med målet primer par
Δctstädning(kontroll-prov): Δct (CT DPBS matad prov)-(ct av bakterier matad prov) mätt med städning primer par
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
G. mellonella hemolymph infektion modellen i ofta används för att analysera virulensfaktorer av ett enormt utbud av patogener. De flesta mätningar inkluderar en analys av larver dödlighet, vilket är en ganska enkel metod. Dock denna metod inte tillåta slutsatser om immunsvar i allmänhet och länka resultaten av G. mellonella immunsvar med ryggradsdjur immunologiska mekanismer. G. mellonella oral administrering modellen används å andra sidan sällan för oral infektion eller kolonisation av larverna på grund av svårigheterna för att erhålla exakta infektion dosering9. Ytterligare, endast lite är känt om G. mellonella medfödda immunsvar mot icke-patogena bakterier särskilt däggdjur intestinal förknippas.
I motsats till patogener, förknippas utmana immunsvaret värd och utlösa men värd immunförsvaret är kunna upprätthålla immun homeostas. G. mellonella är kunna rensa inledande tvångsmatades bakteriehalten tills slutligen inga bakterier var detekterbar längre (figur 2)8. 16s gen kopia antalet både B. vulgatus och E. coli minskat betydligt inom 24 h.
Vi visade att kommensala administrerat G. mellonella larver inducera RNA genuttryck av olika medfödd immunitet markörgener: LPS-erkännande molekyler - apolipophorin (ApoIII) och hemolin (figur 3A, B) visades att uttryckas generellt högre i E. coli-administreras larver jämfört med B. vulgatus-administreras larver8. Ytterligare, markör genuttryck av två typer av antimikrobiella molekyler kan övervakas. Produktionen av reaktivt syre och kväve arter (ROS/RNS) kan beräknas genom mätning av Nos och Nox-4 genuttryck som visades vara kraftigt uppreglerad vid E. coli tvångsmatning jämfört B. vulgatus (figur 4A, B)8. Dessutom kunde genuttryck av antioxidativa Gst observeras (figur 4C). 8
Dessutom visade vi att olika antimikrobiella peptid uttryck förmåddes starkare efter E. coli administration än svar på B. vulgatus tvångsmatning. Vi observerade uppreglering av defensin-liknande gallerimycin peptid, LPS-interagera gloverin peptid, cecropin och moricin (figur 5A, B, C, D)8.
Figur 1 : Tvångsmatning installationen med hjälp av en mikrosprutan pump. Blunt-slutade nål justeras till mikrosprutan pump som tillåter exakta injektion av bakterier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Persistens av bakteriehalten i Galleria mellonella larver efter tvångsmatning. Kopiera nummer av B. vulgatus- och E. coli-specifika 16s rDNA gener bestämdes från 5 ng av cDNA vid olika tidpunkter med RT-PCR. Datapunkterna visas med indikering av medianen. Modifierad från referens 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Differential mönsterigenkänning av bakterier av G. mellonella. Larverna var administreras med två olika intestinala förknippas, RNA isolerades efter 1-6 h och mRNA uttryck för LPS erkännande molekyl apolipophorin (ApoIII), (A) och hemolin (B) bestämdes. Datapunkter representera geometriska medel med standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). 8 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : ROS markör genuttryck efter Bakterieutmaningen. E. coli och B. vulgatus var tvångsmatades och ROS försvar markör genuttryck analyserades över tid. Nos (A), Nox-4 (B) och Gst (C) mRNA uttryck mättes i isolerade larval RNA. Datapunkter representera geometriska medel med standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Modifierad från referens 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Kommensala-inducerad defensin-liknande antimikrobiella peptid uttryck i G. mellonella larver och humana epitelceller. Larverna administrerades oralt med B. vulgatus eller E. coli, immunsvaret observerades över tiden och RNA isolerades från larval individer. gallerimycin (A), cecropin (B), gloverin (C), moricin (D) mRNA uttryck bestämdes. Datapunkter representera geometriska medel med standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Modifierad från referens 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. mellonella modellen är en ofta använd modell att bedöma Bakteriella virulensfaktorer i en systemisk infektion strategi21. Eftersom många patogener och bakterier ange värden via oralt Kolonisation eller infektion, måste nya insikter hittas för att utvärdera G. mellonella som modell för oral colonization och infektion.
Möjligheten till bakre G. mellonella mellan 15-37 ° C är en stor fördel eftersom mest däggdjur modeller behålla kroppstemperatur på 37 ° C5. G. mellonella larver kan köpas från olika leverantörer men etableringen av befolkningens egen avel ger många fördelar såsom frånvaro av antibiotika som störa analyserna, bättre uppskattning när starta experiment eftersom leverantörerna ger inte alltid larver i en ready-to-use stage och stressreaktioner undviks på grund av transport eller temperaturförändringar. På grund av temperatur toleransen av G. mellonella är temperaturområdet som avel kan utföras hög. Högre temperaturer leda till snabbare utveckling av larvaena och enligt avel temperaturen, vi kan uppskatta livscykeln från ägget till senast instar larv. När larverna valdes för experiment, var bara blek och snabbrörliga individer valt att undvika stress och immunreaktioner störa experimenten.
För att fastställa den tvångsmatning modellen, måste det säkerställas att muntlig ansökan lyckades. Därför var det bra att ställa in flera prövningar som en stark bromophenol dye lades till den lösning som är avsedda att tvångsmatning. Detta bidrar till att utesluta eventuella skadade larver och välj för larverna som har det blå färgämnet endast inom deras gut22.
Med denna modell, upptäckte vi att G. mellonella larver är användbara för att undersöka medfödda immunsvar kinetik av vissa markörgener. Under etableringen av oral administrering modellen och studien av immunsvar kinetik hittade vi genuttryck inte lokalt uttrycks i midgut. Första experimentella studier att extrahera midgut RNA efter oral administrering av kommensaler bakterier tillhandahöll inte avgörande resultat. Därför bestämdes immunsvaret ”globalt” i hela individer. Dessa fynd stöder hypotesen om globalt erkännande via tarmens receptorer, överföring av signalen och utlöser extraintestinal genuttryck. G. mellonella är i allmänhet kunna inducera ampere främst i fett kroppen, men ytterligare i hemocytes och tarmsystemet9. Eftersom det finns ingen exakt information om vävnadsspecifika produktion av antimikrobiella molekyler i G. mellonella larver efter infektion, var hela larval RNA extraheras från komplett individer och används för testmetoder RNA genen uttryck. En ytterligare fördel med hela larval RNA-extraktion är fullständig inneslutning av levande bakterier inuti tarmen och möjligheten att kvantifiera bakteriehalten. Dissektion av tarmen kan leda till förlust av bakterier på grund av förberedelse.
Eftersom de flesta G. mellonella forskning utförs på bakteriell virulens drag var vi särskilt intresserad av om och hur larverna utlösa immunsvar mot icke-patogena bakterier som är en del av de däggdjur bakterieflora. Nyligen, visade vi att både G. mellonella och däggdjur delar liknande komponenter av medfödda immunsvar, som är homologa och evolutionärt bevarade. Den nitrat oxid synthase (Nos) och NADPH-oxidas (Nox) gener delar en hög grad av likhet8. G. mellonella hamnar ytterligare en defensin-liknande antimikrobiella peptid-gallerimycin som har strukturella likheter med däggdjur β-defensin 28.
Med oral administrering modell var det möjligt att påvisa differentiell bakteriell erkännande av antingen antiinflammatoriska symbiotiska B. vulgatus eller pro-inflammatoriska pathobiotic E. coli. Nedströms oxidativ stress svaren och antimikrobiella peptid produktion var dessutom högre inducerade efter E. coli administrering jämfört med B. vulgatus administration8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av DFGEN (SPP1656), DFG forskning utbildning koncernen 1708, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) och den tyska Center för infektion forskning (DZIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
