Summary
כאן אנו מתארים שיטה עבור ברזולוציה גבוהה בזמן הדמיה multiphoton של תאים סרטניים במוח לפני ואחרי התערבות כירורגית פולשנית (למשל, ביופסיה) בתוך חיה חיה אותו. שיטה זו מאפשרת ללמוד את ההשפעה של אלה הליכים כירורגי פולשנית על תאים סרטניים ' נדידה, פולשנית, והתנהגות מתרבים ברמת תא בודד.
Abstract
ביופסיות הם סטנדרטים של טיפול בסרטן ומועילים קלינית כפי שהם מאפשרים אבחנה מוצק הגידול, פרוגנוזה, וקביעת טיפול אישית. עם זאת, הפרה של ארכיטקטורת הגידול על ידי ביופסיה ופרוצדורות פולשני אחרים שויך השפעות בלתי רצויות על התקדמות הגידול, אשר צריך ללמוד בעומק כדי לשפר עוד יותר את התועלת הקלינית של הליכים אלה. גישות סטטיות קונבנציונאלי, אשר רק לספק תמונה של הגידול, מוגבלים ביכולתם לחשוף את ההשפעה של ביופסיה על התנהגות תא הגידול כגון הגירה, תהליך קשור היטב ממאירות הגידול. בפרט, הגירה תא הגידול הוא המפתח בגידולים במוח אגרסיבי מאוד, שבו הפצת הגידול המקומי עושה הריתת הגידול הכולל כמעט בלתי אפשרי. התפתחות הדמיה רב-פוטון וחלונות דימות כרוניים מאפשרים למדענים ללמוד את התהליך הדינמי הזה בחיות החיים לאורך זמן. כאן, אנו מתארים שיטה עבור הדמיה האורך ברזולוציה גבוהה של תאים סרטניים במוח לפני ואחרי ביופסיה באותו בהמה חיה. גישה זו מאפשרת ללמוד את ההשפעה של הליך זה על התנהגות תא הגידול (הגירה, פלישה, והתפשטות). יתר על כן, אנו דנים את היתרונות והמגבלות של טכניקה זו, כמו גם את היכולת של מתודולוגיה זו כדי ללמוד שינויים תא התנהגות הסרטן עבור התערבויות כירורגי אחרים, כולל הניתוח הגידול או ההשתלה של כימותרפיה ופלים.
Introduction
רמת טיפול עבור גידולים מוצקים ביותר כולל רקמת ביופסיה לאבחון, פרוגנוזה, וקביעת טיפול אישית1,2. הכולל, הליכים אלה נותנים תועלת קלינית, אבל הראיות האחרונות מצביע על כך ביופסיה ונהלים אחרים פולשנית יותר, כגון כריתת הגידול, יכול גם להשפיע לרעה על התקדמות הגידול3,4,5 , 6. בעוד הליכים אלה נשארים הכרחי טיפול בחולה והטבות שלהם להתגבר על ההשפעות השליליות שלהם, יש צורך להבין באופן מלא את המנגנונים מאחורי ההשפעות השליליות הללו על מנת למקסם את בטיחות החולים ואת ה השפעות חיוביות של הליכים אלה ולהפוך אותם אפילו יותר מועיל קלינית.
ביופסיה-מתווכת השפעות בלתי רצויות על התקדמות הגידול מופעלות על ידי שינויים מערכתית ושינוי הסביבה המיקרו של הגידול בתגובה לשיבוש רקמות4,5. לכן, יש ללמוד תהליך זה בבעלי חיים חיים. עם זאת, ההשלכות העדינות של אלה הליכים פולשנית אלה יכולים לעתים קרובות להיות מוסווה על ידי וריאציות גדולות בין אנשים. שיטות קונבנציונליות המבוססות על ניתוח הביטויים האימונוהיסטוכימיה או ההמרה עשויות להתעלם מהשפעות אלה או דורשות מספר גדול של בעלי חיים כדי לזהות אותם. יתר על כן, גישות אלה סטטי חסר את היכולת לזהות שינויים בהתנהגות תא הגידול כגון הגירה ופלישה, תהליכים דינמיים לתאם עם ממאירות הגידול. אלה תכונות תא הגידול הם בחשיבות מיוחדת עבור גידולים במוח אגרסיבי מאוד, כגון gliנובלסטומה (GBM), שם התפשטות המקומי של תאים סרטניים מגביל כריתת כירורגית ומקטין הישרדות החולה7. כדי להבין באופן מלא כיצד ביופסיות להשפיע על ההתנהגות של תאים GBM, גישה האורך המאפשר ויזואליזציה של תאים אלה בהקשר הפיזיולוגי של אורגניזמים חיים יש צורך.
הפיתוח האחרון של הדמיה ברזולוציה גבוהה intravital בשילוב עם מושתל בניתוח windows הדמיה כרונית מאפשר למדענים לחקור את ההתנהגות הדינמית של תאים סרטניים בעכברים חיים במשך ימים מרובים8,9. באמצעות גישה זו רבת עוצמה, אנו יכולים ללמוד כיצד תאים סרטניים ' מתרבים, נדידה, ושינויים התנהגותי התנהגות במשך מספר ימים בתגובה ביופסיה באותו עכבר. לעומת טכניקות אחרות המאפשרות ניטור מרובת ימים של גידולים בעכברים חיים, כגון הדמיה תהודה מגנטית (MRI)10, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/טומוגרפיה ממוחשבת (PET/CT)11, או הדמיה ביולומילאנטי12, זה גישה ייחודית מציעה את האפשרות של לימוד התנהגות תא הגידול ברמת תא בודד להתיר שינויים עדינים המתרחשים בתוך הגידול.
כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת כדי לבצע פציעה כמו ביופסיה ו-pre-ו פוסט ביופסיה האורך הדמיה במוח של עכברים נושאת הגידול. שיטה זו יכולה להיות מיושם כדי ללמוד התערבויות כירורגי אחרים, כגון כריתת הגידול חלקית או השרשה של וופלים כימותרפיה.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הרווחה של בעלי החיים של האקדמיה המלכותית לאמנויות ולמדעים של הולנד, הולנד. הפרוטוקולים הניסיוניים הנמצאים בשימוש בכתב יד זה אושרו על ידי המלון מקבל את הInstantie voor דינסולזיג'ן (מצלמות).
1. השתלת תאים סרטניים והכנת חלון הדמיה של הגולגולת
- הכנה כירורגית
- השתמש בעכברים למבוגרים (> 6 שבועות) של כל זן או מין. תרופת הרגעה לעכבר על ידי הזרקת (פלואנזה [נוירולפטיק] + פנטניל) (0.4 mL/ק"ג) + הרגעה בנזודיאזפינים (2 מ"ג/ק"ג) במינון של 1:1:2 במים סטריליים. להעריך את מצב ההרדמה של בעל החיים על ידי צביטה בבוהן.
הערה: בפרוטוקול זה, הן נשים והן C57BL/6 עכברים שימשו בשל אותו רקע גנטי של קו הגידול המשמש בניסויים אלה (GL261). העכבר יישאר מסומם לגמרי עבור 1.5 h. לחלופין, השתמש בהרדמה מלאה כגון: isofהלורטן (1.5% – 2% מתערובת הערבוב/O2 ). - הר את העכבר על מסגרת סטריאוטקטיקה ולאבטח את הראש באמצעות מהדק האף ושני ברים האוזן.
- השתמש במנורת חימום כדי לשמר את טמפרטורת הגוף. מנורת חימום יש להשתמש בזהירות, לחילופין המים לאחר מכן רפידות חימום ניתן להשתמש.
- להחיל משחה העין כדי להגן על קרניות של העכבר מפני ייבוש.
- השימוש במספריים חדים כדי לגלח את הפרווה על הגולגולת (האזור השמאלי מעיני העכבר לבסיס הגולגולת שלו) ולחטא את העור החשוף עם 70% אתנול.
- חותכים את העור בצורה עגולה עם מספריים חדים ומגרדים את הקרום מתחת לספוגית כותנה. החל טיפה של לידוקאין 1% + אפינפרין 1:100,000 עבור 5 דקות, ולהסיר את עודף עם ספוגית כותנה.
- הדבק את קצות העור לגולגולת עם דבק ציאנואקרילי.
- מניחים את מסגרת הסטריאוטקטיקה תחת מיקרוסקופ סטריאו לנתיחה עם הגדלה של 4 x.
- המחש את הגולגולת דרך מיקרוסקופ הניתוח ולקדוח חריץ עגול של 5 מ"מ קוטר מעל עצם הקודקוד הימני. בצע צעד זה בזהירות ורק שטחי, הימנעות כל לחץ על הגולגולת.
- להחיל טיפה של מאגר קליפת המוח (125 מ"מ מילימטר, 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ מאגר HEPES, 2 מ"מ MgSO4, ו 2 מ"מ cacl2 [pH 7.4]) ולהרים את הכנף העצם באמצעות מלקחיים דקים.
- במהלך השלבים הבאים, השאר את משטח המוח כשהוא מכוסה במאגר קורטקס, אלא אם צוין אחרת.
- תחת מיקרוסקופ הניתוח, להמחיש את משטח המוח ולהסיר את מאטר דורא באמצעות מעוקל, מחודדות, בסדר מאוד מלקחיים נקודה. אם הדימום מתרחש בשלב זה, השתמש בספוג הג הנספג כדי לעצור אותו.
- השתמש בעכברים למבוגרים (> 6 שבועות) של כל זן או מין. תרופת הרגעה לעכבר על ידי הזרקת (פלואנזה [נוירולפטיק] + פנטניל) (0.4 mL/ק"ג) + הרגעה בנזודיאזפינים (2 מ"ג/ק"ג) במינון של 1:1:2 במים סטריליים. להעריך את מצב ההרדמה של בעל החיים על ידי צביטה בבוהן.
- הזרקת תאים סרטניים
- השהה מחדש את הכמות הרצויה של תאים סרטניים פלורסנט ב ~ 3 μL של PBS (למשל, עבור הניסויים המוצגים בפרוטוקול זה, 1 x 105 GL261 תאים הוזרקו).
הערה: בעוד סמן פלורסנט ניתן להשתמש, סמן גרעיני מומלץ מאוד, כדי לעקוב אחר תאים סרטניים בודדים במהלך הניתוח. בנוסף, סמן פלורסנט המקושר לאבן, כגון H2B, ניתן להשתמש כדי להמחיש את עיבוי הכרומוזום, ולכן, כדי לפקח על חלוקת התא. השימוש סמן תמונה להחלפה, כגון Dendra2, מאפשר סימון צילום ומעקב של תאים סרטניים במשך מספר ימים4,13. - לטעון את התאים הסרטניים 10 μL גז הדוק מזרק עם סגנון נקודה 2 מחט ולתקן אותו על הזרוע סטריאוטקאית מניפולטור.
- . הסר את מאגר קליפת המוח מניחים את קצה המזרק באמצע פתיחת הגולגולת ומכניסים אותו לעומק של 0.5 מ"מ מהמשטח של הגולגולת. באופן אופציונלי, ליצור שטח קטן במוח כדי להתאים את ההשעיה התא הגידול. בשביל זה, להכניס את המזרק עד לעומק של 1 מ"מ ולאחר מכן לאחזר אותו עד 0.5 מ"מ לפני הזריקה.
- להחיל ירידה של מאגר קליפת המוח.
- לאט להזריק את ההשעיה התא באמצעות משאבת משאבה microsyringe זרק (250 – 400 nL/מזערי). הסר את המזרק והשתמש בספוג הג שנספג כדי לעצור כל דימום, במידת הצורך.
- השהה מחדש את הכמות הרצויה של תאים סרטניים פלורסנט ב ~ 3 μL של PBS (למשל, עבור הניסויים המוצגים בפרוטוקול זה, 1 x 105 GL261 תאים הוזרקו).
- הכנה לדימות הגולגולת חלון
- הסירו את מאגר קליפת המוח והניחו טיפה של שמן הסיליקון באתר פתיחת הגולגולת כדי למנוע בועות אוויר מתחת לחלון.
- אטמו את המוח החשוף. עם שמיכות של 6 מ"מ החלת דבק ציאנואקרילי. בין הכיסויים לגולגולת לחץ בעדינות על הכיסויים נגד הגולגולת בעזרת מלקחיים עדינים כדי להבטיח מרחק מינימלי בין המוח לבין שמיכות.
- החלת מלט אקריליק שיניים על פני הגולגולת, כיסוי הקצה של שמיכות. מניחים טבעת נירוסטה דקה (1.5 מ"מ בקוטר החיצוני, 1 מ"מ בקוטר הפנימי) סביב פתיחת הגולגולת ומאפשרים מלט שיניים יבש. באופן אופציונלי, יש להוסיף דבק על הגבול כדי לאבטח את הטבעת בחלק העליון של הראש.
הערה: מערכת זו קיבעון הראש הוא אופטימלי לדימות על מיקרוסקופ הפוך: מגנטים קטנים מוטבע בתיבת הדמיה להקל על המוח הדמיה חלון (CIW) קיבעון. בניסויים המוצגים בפרוטוקול זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך. עבור מיקרוסקופים זקופה, קיבעון יכול להיות מושגת באמצעות בר או טבעת עם חריצים שניתן לצרף למיקרוסקופ בעזרת ברגים או צלחת המתאימה את הטבעת. - עבור ניהול הכאב, להזריק מנה אחת של 100 μg/ק"ג buתת-עורי יתום ולאפשר לבעל החיים להתאושש על כרית חימום.
- מניחים את העכבר בכלוב בודד עם נייר מגורר להעשרה. עקוב היטב אחר העכבר מדי יום במשך הימים הראשונים ו-2x בשבוע, לאחר מכן, עבור התנהגות רגילה, תגובתיות ומראה.
2. הדמיה של האינוטרטל
הערה: מרווח הזמן בין הזרקת תא הגידול לבין הפעלת הדמיה הראשון ההדמיה תלויה בסוג של קו הגידול התאים בשימוש. עבור הניסויים המוצגים בפרוטוקול זה, 1x 105 GL261 תאים הוזרק והתמונה 10 ימים לאחר מכן.
- הכנת הדמיה
- הרגעה לעכבר באמצעות הרדמה שאיפת isof, דרך מסכת פנים (1.5% – 2% לתערובת/O2 ).
- הכנס את תת-עורי העכבר עם 100 μL של מאגר מלוחים כדי למנוע התייבשות.
הערה: עבור הדמיה ארוכת טווח, העכבר יכול להיות מהתייבשות דרך משאבת אינפוזיה תת עורית. - מקם את העכבר עם הפנים כלפי מעלה בתיבת דימות. השתמש צלחת מתכת עם חור בקוטר 1 מ"מ ומגנטים קטנים מוטבע סביב הצוהר כדי לספק קיבעון של CIW לתיבת הדמיה. הציגו את המלון דרך מסכת פנים והוא מאוורר בצידו השני של הקופסה (0.8% – 1.5% מתערובת המים/O2 ). לחלופין, השתמש בקלטת כדי לתקן את גוף העכבר.
הערה: בשלב זה ניתן להזריק דקטרן בתווית של תוספי לצורך הדמיית כלי דם או צבעים אחרים. - באופן אופציונלי, השתמש אוקסימטר דופק ובדיקה חימום כדי לפקח על הסימנים החיוניים של העכבר.
הערה: בניסוי זה לא היה צורך להשתמש באוקסימטר דופק ובמקדח חימום מאז שהעכבר היה יציב לאורך תקופת זמן ההדמיה (2 – 3 שעות). עם זאת, לתקופות הדמיה ארוכות יותר, ייתכן שיהיה צורך בניטור יסודי יותר. - הגדר את 25x (למשל, מימן IRAPO NA 0.95 WD 2.5 מ"מ) מטרת המים למיקום zהנמוך ביותר ולהוסיף טיפה גדולה של מים.
הערה: השימוש במיקרו מנפק לטבילה במים מומלץ מאוד לניסויים ארוכי טווח, שכן הוא מאפשר למדענים להוסיף מים במהלך הניסוי. לחילופין, ניתן להשתמש במטרה יבשה. - העבר את תיבת ההדמיה אל המיקרוסקופ המצויד בחדר האקלים הכהה השמור ב 37 ° c. להביא את המטרה שמיכות CIW עד טיפת המים נוגעת בו.
- באמצעות המצב epiפלואורסצנטית, להתבונן בגידול דרך עינית ולהביא את התאים לפוקוס.
- רכישת תמונה בזמן הקפיצה
- בחרו מספר תנוחות של עניין לתמונה והקליטו את נקודות הציון שלהם בתוכנה. ודא כי המיקומים שנבחרו הם עמדות נציג מאתרים שונים של הגידול (כל גידול יכול להיות שונה, אבל כדי להבטיח עקביות, בחר את אותה כמות מיקומים שהם מרכזיים לליבת הגידול והקצוות על פני כל העכברים).
הערה: ניתן לבצע סריקת אריח של חלק מהגידול או של כל הגידול הנראה לעין; עם זאת, אם הגידול גדול, שיטה זו תגדיל את הזמן לשגות בין התמונות. בנוסף, אם התאים הסרטניים לנוע מהר, זה יכול להיות מאתגר כדי לעקוב אחר התאים אותו לאורך זמן. - מעבר למצב מרובה פוטון וכוונון הלייזר לאורך הגל הנכון. שימו לב, כדי למנוע נזק לפוטו, יש צורך באורכי גל גבוהים יותר.
הערה: עבור Dendra2 הדמיה, נעשה שימוש באורך הגל של 960 ננומטר. עם המטרה המשמשת ניסויים אלה, זום של 1.3 היה מספיק כדי לקבל ברזולוציה טובה של גרעיני הגידול לסרוק אזור מייצג של הגידול. - עבור למצב חי ולהגדיר z-מחסנית עבור כל מיקום כדי לרכוש את הנפח המקסימלי של תאים סרטניים מבלי להתפשר על רזולוציית התא הגידול. הגדר את גודל השלב בין התמונות כ-3 μm.
- השתמש במצב הדו-כיווני כדי להגדיל את מהירות הסריקה. רזולוציית התמונה צריכה להיות לפחות 512 x 512 פיקסלים.
- לרכוש תמונות של נפח הגידול במיקומים שונים כל 20 דקות עבור 2 h. להוסיף מים למטרה לפני כל רכישת תמונה.
הערה: ניתן לרכוש תמונות זמן באופן אוטומטי על-ידי הגדרת הזמן המתאים לפקיעה בתוכנה. עם זאת, העכבר יכול לנוע, ואת המיקום או מחסנית zיכול לנוע עם הזמן, גרימת אובדן נתונים. לכן, מומלץ לבצע את הפקיעה בזמן באופן ידני כדי לבדוק ולהתאים עבור xyz משמרות בין רכישות. - בשלב זה, באופן אופציונלי, להחליף תמונה Dendra2 סמן פלורסנט.
הערה: בניגוד לפקיעה זמן הדמיה (אשר מאפשר לימוד תאים סרטניים בודדים מאפיינים וכיצד הם משתנים לאורך זמן), זה יאפשר ללמוד את האזור של חדירת תאים הגידול במוח במשך מספר ימים4. הסבר מפורט לשלב זה מתואר על ידי גליליייביץ ' ואח '13. - לאחר רכישת התמונה האחרונה, להסיר את העכבר מהבמה ולאפשר לו להתאושש על משטח חימום. כדי למנוע התייבשות, 100 μL של תמיסת מלח ניתן להעניק תת-עורי. מניחים את העכבר בכלוב שלו עד הפציעה ביופסיה כמו מבוצעת.
- בחרו מספר תנוחות של עניין לתמונה והקליטו את נקודות הציון שלהם בתוכנה. ודא כי המיקומים שנבחרו הם עמדות נציג מאתרים שונים של הגידול (כל גידול יכול להיות שונה, אבל כדי להבטיח עקביות, בחר את אותה כמות מיקומים שהם מרכזיים לליבת הגידול והקצוות על פני כל העכברים).
3. ביופסיה כמו פציעה והחלפת CIW
- ליצור פציעה כמו ביופסיה באתר הגידול 1 יום לאחר הפעלת ההדמיה הראשונה.
הערה: לחלופין, הליך אחר, כמו הסרת גידול חלקי, ניתן לבצע.- להרגיע את העכבר באמצעות הרדמה האינהלציה של isof, כפי שתוארה קודם לכן בשלב 2.1.1.
הערה: בעוד הרדמה להזרקה ניתן להשתמש, הליך זה קצר יותר מאשר השרשה CIW, והרדמה אינהלציה מאפשר לשלוט בדיוק כדי להקטין את הזמן העכבר נשאר הרגעה. - הנח את העכבר על מסגרת סטריאוטקאית ואבטח את ראשו עם שני שברי אוזן ומלחציים באף. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר רפלקסים פדלים. השתמש במסכה הרדמה לניתוח סטריאוטקמית כדי לשמור על העכבר מסומם במהלך ההליך.
- לטבול בספוגית כותנה באצטון ולפזר אותו מסביב לקצה שמיכות כדי לרכך את הדבק המחזיק את הכיסויים נגד המוח.
- החליקו מלקחיים בנקודה דקה. מתחת לכיסויים כדי להרים אותו אם הכיסויים נשברים בשלב זה, השתמשו בלקחיים כדי להסיר את פיסות הזכוכית.
- החלת מאגר קליפת המוח כדי לשמור על לח מוחי.
- לטבול מחט 25 גרם בגידול לעומק של 1 מ"מ. להסיר את המחט ולעצור את הדימום, אם יש צורך, על ידי החלת ספוג סטרילית ג'לטין.
הערה: שלב זה יכול להתבצע תחת stereomicroscope פלורסנט כדי לזהות במדויק יותר את אזור הגידול (אם הגידול קטן מדי). בנוסף, הפתרון 1 μL של פוליסטירן מוקצף 1 מחרוזות מיקרומטר ניתן להזריק במהלך הניקוב כדי לזהות את אזור ביופסיה. - אטום את משטח המוח עם שמן סיליקון והדבק שמיכות 6 מ"מ על החלק העליון.
- להרגיע את העכבר באמצעות הרדמה האינהלציה של isof, כפי שתוארה קודם לכן בשלב 2.1.1.
4. הדמיה חוזרת
- יום אחד לאחר גרימת פציעה כמו ביופסיה (ובימים רצופים אם יש צורך), לחזור על הדמיה כמתואר בשלב 2 לעיל כדי להעריך כיצד התנהגות תא הגידול משתנה לאורך זמן. בחר מספר מיקומים של הגידול שיהיה נציג של אזור הגידול כולו.
הערה: אם נעשה שימוש בחרוזי פלורסנט כדי לזהות את אזור הביו-כיום, השוו אותם להתנהגות של תאים סרטניים באזורים הביובאו, בהשוואה לאזורים שאינם ביואליום.
5. ניתוח תמונה
- אם התמונות בזמן הקפיצה הושגה באופן ידני, שלב אותן בתיקיה אחת.
- פתח את קובץ הזמן הנוכחי של חי בתוכנה המסחרית המשויכת למיקרוסקופ (למשל, LasX או לאס AF). בחר בתהליך הטאב > תהליך > מיזוג. בחר את התמונה הראשונה של רצף הזמן ולחץ על הראשון. בחר את התמונה השניה של רצף הזמן ולחץ על השני. במיזוג מידות, בחר באפשרות t לזמן. לחץ על החל. קובץ חדש עם שתי נקודות זמן ייווצר. חזור על תהליך זה עבור כל נקודות הזמן, תוך שימוש בקובץ החדש שנוצר כתמונה הראשונה של הרצף.
- תקן את ה- z-ערימות שנרכשו עבור כל משמרת xyz .
הערה: עבור הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בתוכנית תוכנה של Visual Basic שתוכננה בהתאמה אישית עבור תיקון. לחילופין, ניתן להשתמש בתוכנות זמינות אחרות, כגון ImageJ או Imaris אריס.- יצא את קובצי TIFF מהתוכנה על-ידי לחיצה ימנית על קובץ הזמן הממוזג. בחר שמור נתוני RAW. הקבצים המיוצאים יוצאו לתיקיה אחת שנקראה בהתאם לערוץ, לשעה ו- z-מיקום.
- פתח את קבצי ה-TIFF בתוכנית התוכנה המתוכננת של Visual Basic שתוכננה בהתאמה אישית.
- הגדירו את מספר נקודות הזמן, המחסניות zוהערוצים.
- הקצה צבע לכל ערוץ לפי סדר הופעתם.
- בחלונית ' הצג טופס ', עבור כל נקודת זמן, תקן את ההסטה ב- z על-ידי לחיצה על הלחצנים למעלה (U) או למטה (D).
- בלוח הבניין של התמונה, בחר את הערוץ שישמש לתיקון משמרת ה- xy . בחר את הערוץ הירוק כדי לתקן, בהתבסס על האות מתאי הגידול. לחץ על אוטומטי עבור תיקון xy .
- לייצא את התמונות המתוקן כהקרנה מקסימלית של שלוש ברציפות z-ערימות. בבחירתהחלונית, הציגו את המספרים של הראשון (התחל) ואת ה- z-פרוסות האחרונות (End) שיש לייצא. בחר Max. בחר תיקיות נפרדות עבור Z. לחץ על Do. עבור כל אחד מהם, שלוש מערימות z, תמונות בזמן הקפיצה ייוצאו לתיקיה נפרדת.
- באופן אופציונלי, נכון לעיוות הרקמה האלסטית.
הערה: עבור ניסויים דפורמציה רקמות אלסטי, משחק התאמה פיצוי תוכנית תוכנה שימש כדי לתקן את דפורמציה קשיח אלסטי רקמה14. - מעקב אחר תאים בודדים בערימת ה- zהמלאה בסרט הזמן הפקיעה.
הערה: ניתן לעקוב אחר תאים סרטניים באופן ידני באמצעות, למשל, התוסף ImageJ (MTrackJ). בעוד מדויק, זה מוגבל למישור xy והוא מאוד ארוך זמן. לחילופין, ניתן לעקוב אחר תאים סרטניים באופן אוטומטי לאורך כל עוצמת ה- zהמלאה, תוך שימוש בפילוח תאי הגידול (לדוגמה, תוכנות Imaris אריס). עם זאת, בגידולים צפופים מאוד, מעקב אוטומטי הוא פחות מדויק יכול להצמיח שגיאות מעקב יותר.- פתח ועקוב אחר כל סדרה של השגות בזמן (עבור שלושה מחסניות ברציפות z) בנפרד. גרור את התיקיה המכילה את תמונות הזמן לתמונה ל-ImageJ.
- בחר את יישומי התוספים לטאבים ≫ מעקב אחר > mtrackj. עקוב אחר כל תא בודד על-ידי בחירת הוספה ולחיצה על כל תא בכל אחת מנקודות הזמן.
- חלץ את מידת הרצועות על-ידי לחיצה על מדידה ושמירת הקובץ.
Representative Results
כדי להעריך את ההשפעה של ביופסיה על התנהגות תא הגידול במוח, ביצעת את ההליך המתואר בפרוטוקול זה. Glioma – GL261 תאים — ביטוי חלבון פלורסנט גרעיני (H2B-Dendra2) הוזרק במוחו של C57BL/6 עכברים, ו CIW כרונית הושתל. הדמיה בזמן ההדמיה בוצעה על אותה החיה לפני ואחרי ביופסיה כמו הפגיעה בגידול (איור 1A, ב). הגירה של תאים סרטניים בודדים נקבע על ידי מעקב אחר נתיב ההגירה לאורך זמן במישורים שונים של מחסנית z(איור 1c) והתווה כאחוז של תאים נודדים טרום ביופסיה ( איור 1c). שיעור ההתפשטות של תא הגידול היה ככמת מבוסס על H2B-מתויג Dendra2 עיבוי על מיטוזיס (איור 1D) ו התווה כאחוז חלוקת התאים לפני ופוסט ביופסיה (איור 1d). השוונו את ההתפלגות של מהירות הגירה לפני ואחרי ביופסיה באותו גידול ומצא כי מספר תאים נודדים (מהירות > 4 μm/h) גדל לאחר ההתערבות, עם ירידה משויכת במספר תאים איטיים/לא נודדים ( מהירות < 4 μm/h) (איור 2a). בממוצע לכל גידול, הבחנו 1.75 (SD = 0.16)-להגדיל את העלייה באחוז של תאים נודדים כאשר ביופסיה כמו פציעה בוצעה, לעומת עכברים שליטה שלא היה ביופסיה (איור 2B). אנו פיקוח על התנהגות תא הגידול במשך שבוע נוסף ומצא כי, למרות האחוז של תאים סרטניים הנדידה בסופו של דבר ירד הן בשליטה ואת העכברים ביופסיה, העכברים ביופסיה עדיין הציגו קיבולת נדידה גבוהה יותר מאשר עכברים בקרה ( איור 2C). ניתוח של התנהגות שהתרבות של תא הגידול לאורך זמן הראה 1.52 (SD = 0.26)-מקפלים להגדיל את מספר האירועים mitotic על ביופסיה, ביחס לעכברים שליטה לא ביופסיה (איור 2D).
כדי לבדוק אם ההשפעות נצפתה של ביופסיה על תא הגידול שהתרבות התנהגות הנדידה היה חפץ עקב ניתוח החלפת CIW (נדרש לבצע פציעה כמו ביופסיה), אנו פיקוח על התנהגות תא הגידול בקבוצה של עכברים שעברו CIW תחליף ללא ביופסיה. בקבוצה זו, לא התבוננו כל אינדוקציה של הגירה או התפשטות של תאים סרטניים, המציין כי דחיפה בהפצה של תאים סרטניים ושיעורי הגירה הופעלות במיוחד על ידי פציעה כמו ביופסיה (איור 3 א, ב).
יציבה צילום-מרה של חלבון פלורסנט Dendra2 מאפשר ללמוד חדירת תאים הגידול במשך מספר ימים. עם חשיפה לאור אולטרה סגול/כחול, Dendra2 הוא החליף בלתי הפיך מירוק לאדום. באמצעות מאפיין זה, אזור מרובע של הגידול היה מואר ~ 200 Dendra2-ביטוי תאים סרטניים היו מסומנים תמונה לפני ביופסיה (איור 4). יום אחד לאחר הביופסיה, אנו מחדש את האזור החלפת תמונות ומדד את הנפח של תאים סרטניים שחדרו לתוך רקמת הגידול שמסביב. מצאנו כי האזור הסתננות היה 1.72 (SD = 0.41) פעמים גדול יותר בגידולים לאחר פציעה כמו ביופסיה לעומת גידולים שליטה לא ביופסית (איור 4). למרות גישה זו רק מספק מידע על התנהגות של תאים סרטניים בצובר, לא על רמת תא בודד, זה פחות זמן רב יותר מאשר הגישה הדמיה הזמן והוא יכול להיות שיטת הבחירה עבור שאלות מחקר התמקדו באופן בלעדי על . ללמוד התנהגות מונעת
איור 1: התקנה ניסויית עבור הדמיה האורך האורכי של אפקט הביופסיה על התנהגות תא הגידול. (א) דיאגרמה המציגה את עיצוב הטבעת והמחזיק המגנטי. (ב) ייצוג סכמטי של זרימת העבודה הניסיונית. תאים סרטניים מוזרק לתוך המוח של עכברים ו CIW הוא הוקם. על פיתוח הגידול, הראשון (prebiopsy יופסיה) הזמן לפקיעה הדמיה מתבצעת. למחרת היום, הביופסיה והחלפת CIW מיושמים. היום לאחר הדמיה (ביופסיה), הפעם השנייה לשגות הדמיה מבוצעת. עבור השפעות ארוכות-טווח, ניתן לבצע הפעלות הדמיה עוקבות. (ג) תמונות להראות תמונות הנציג של סרט זמן פקיעה שבו GL261 H2B-Dendra2 תאים סרטניים אותרו. קווים אדומים מתארים מסלולים בודדים של תאי הגידול. סרגל בקנה מידה = 50 μm. (ד) נציג בתמונות זמן-פקיעה vivo הצגת תאים מפרידים GL261 H2B-Dendra2 גידולים. בשלבים שונים של מיטוזה מצוינים: prophase (P), prometaphase (Pm), מטא-שלב (M), אנאפא (א), ו-telophase ו-טלוה (T). סרגל קנה המידה = 50 μm. גרפים מציינים את אחוזי הנדידה (E) הנודדים (F) ומחלקים את התאים לפני וביופסיה. כל נקודה מציינת את אחוז התאים הנודדים בכל המיקומים הנמדדים בבעל חיים יחיד. הנתונים מוצגים כממוצע ± S.E.M. של שישה עכברים (* *P < 0.01, לזווג t-test). דמות זו השתנתה מאליאבה ואח '4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות הנציג מראה את ההשפעה של ביופסיה על הגירה תאים סרטניים ושיעורי התפשטות. (א) מגרשי מפל המראים את השינוי בהפצת מהירות התאים ביחס להגירה הבזאלית בעכברים בודדים. הנתונים מוצגים כממוצע ± S.E.M. של חמישה עכברים. (ב) מספר התאים הנודדים בשליטה (כחול) ו ביופסיה (אדום) בעלי חיים מנורמל למספר של תאים נודדים התערבות (n = 6 עכברים, * * *P < 0.0001, הסטודנט של מבחן t). (ג) התנהגות תא הגידול הייתה מעקב במשך מספר ימים. מוצגים הם המספר המנורמל (יחסית להתערבות מראש) של תאים נודדים בעכברים בודדים לאורך זמן (n > 4 עכברים לכל מצב, * * *P < 0.0001, ANOVA דו-כיוון). (ד) המספר המנורמל של חלוקת תאים בשליטה (כחול) וביופסיה (אדום) בעלי חיים. לבעלי חיים נפרדים, ההתערבות בערכים היתה מנורמלת לערכים מראש (n = 5 עכברים, * *P < 0.01, מבחן tשל הסטודנט). דמות זו השתנתה מאליאבה ואח '4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: החלפת CIW אין השפעה על התנהגות תא הגידול. הדמיה האורך האורכי מראה כי ההחלפה של CIW ללא ביופסיה אין השפעה על שיעורי הגירה והתפשטות. (א) הגידול במספר תאי נדידה עבור התנאים המצוינים. כל סמל מייצג את הממוצע של עכבר בודד, ו- n≥ 4 עכברים. (ב) הגידול במספר התאים התרבים עבור התנאים המצוינים. כל סמל מייצג את הממוצע של עכבר בודד (n≥ 4 עכברים, * *P < 0.01, * * *p < 0.001, ns = לא משמעותי, בכיוון אחד ANOVA עם בדיקה לאחר ניומן-keuls אד הוק). דמות זו השתנתה מאליאבה ואח '4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דיאגרמה המציגה את ההתקנה הניסיונית ואת תוצאות הנציגים שהושגו עם Dendra2-החלפת תמונות. כדי לפקח על חדירת תאים סרטניים על ביופסיה, Dendra2-ביטוי תאים סרטניים הם צילום ממותג באזור מרובע על ידי תאורה UV/כחול אור והתמונה, 1 יום לפני ביופסיה. יום אחד לאחר הביופסיה, האזור החלפת התמונות מותאם מחדש ומחדש את התמונה. המוצג הם נציג Dendra2 תמונות של חדירת תאים סרטניים, תוקן באמצעות החיסור ערוץ. הקו הלבן המנוקד מייצג את אזור החדירה. סרגל קנה המידה = 50 μm. הגרף מראה את השטח המוגדל בצילום מוגבר לעכברים (אדום) ובקרה (כחול). כל נקודה מייצגת את הערך הממוצע של עכבר בודד (n≥ 5 עכברים, *P < 0.05, מבחן tשל הסטודנט). דמות זו השתנתה מאליאבה ואח '4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה ללמוד שינויים בהתנהגות תא הגידול ברמת תא בודד בתגובה ניתוחים פולשנית, כגון ביופסיה, במוחו של בעל חיים חי. השילוב של הדמיה מרובת פוטון האורך עם ההשתלה כירורגית של CIW כרונית מאפשר כימות של הגירה תא הגידול, פלישה, והתפשטות לפני ואחרי ביופסיה באותה חיה4. לעומת גישות אחרות המשמשות לניטור הגידול מרובת ימים, כגון הדמיה ביולומיל112, MRI10, או PET/CT11, שיטה זו ויזוב באופן ייחודי גידולים ברמת תא בודד, ובכך, מספק תובנה התנהגות תאית התקדמות הגידול הבסיסי.
כדי לבצע שיטה זו בהצלחה, יש לשלוט במספר פרוצדורות. השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם השרשה CIW והחלפה. המורכבות הטכנולוגית של שלבים אלה מחייבת מיומנויות דיוק וכירורגי שניתן לרכוש באמצעות הדרכה קבועה. סיבוכים במהלך ניתוח CIW, כגון דימום אשר עשוי לכסות את משטח המוח, עשוי להוכיח מאתגר עבור הדמיה הבאים. חוסר של כלים סטריליים או סביבה, כמו גם את הכישלון לחלוטין חותם המוח, עלול לגרום זיהום על פני המוח (נוזל לבן מתחת coverslip), אשר יגרום הדמיה בעייתית ומאוד לסכן את התוצאה פרשנות. סוגיה נפוצה נוספת של פרוטוקול זה היא תנועת בעלי חיים במהלך הדמיה בזמן ההדמיה. בעוד שניתן לתקן כל משמרת xyz לאחר הניסוי, מומלץ לתקן את הקואורדינטות של כל תנוחה לפני כל נקודת זמן כדי למנוע אובדן של מידע. דפורמציה הרקמה היא בעיה נוספת נמצא בעת הדמיה על מיקרוסקופ הפוך. רקמת המוח סובלת מדחיסה כאשר העכבר ממוקם במצב פרקדן. בהתאם לדרגת הדפורמציה של רקמות, מעקב אחר תאי הגידול עלול להוביל לקוונפיקציה מוטעית של הזחה בתאים. כדי למנוע זאת, ניתן להשתמש בתוכנה לדפורמציה קשיחה וגמישה ב-14.
בעוד הליך זה מציע יישום רחב ללימוד שינויים בהתנהגות הגידול, יש לשקול מגבלות מסוימות. שיטה זו מאפשרת למדענים תמונה עד לעומק של 1.6 מ"מ (עם שימוש של מתנד פרמטרי אופטי); עם זאת, משמעות הדבר היא כי הדמיה מוגבלת אזורי קליפת המוח שטחיים15. כך, כמה גידולים במוח הממוקם במבנים במוח עמוק, כולל gliomas הפנימי מתפזר ממוקם באזור גזע המוח, לא ניתן ללמוד בסביבת המוח המקורית שלהם עם פרוטוקול זה. הגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא נפח הגידול שניתן לדימות. למרות שסריקת נפח הגידול הכולל רצוי כדי להשיג מידע מקסימאלי, לעתים קרובות, גודל הגידול ואת המהירות של תאים נודדים יכול להיות מגביל גורמים. עבור כל סוג של גידול, הזמן האופטימלי עבור הדמיה צריך להיחשב. אם מסגרת הזמן בין התמונות ארוכה מדי, ייתכן שיהיה קשה לעקוב אחר תאי הגידול. השימוש בסורק מהדהד יכול להקטין במידה רבה את זמן הסריקה, ומאפשר הדמיה של גידול גדול יותר16. לבסוף, ניתוח התמונה הידנית של פרוטוקול זה עשוי לגזול זמן רב, ולכן במקום זאת, ניתן להשתמש בתוכניות עבור מעקב אוטומטי תלת-ממדי. עם זאת, על תוצאת המעקב להיות תמיד מפוקחת באופן חזותי מאחר שאלגוריתמים למעקב אחר תאים אוטומטיים מיועדים לעתים נדירות לבצע העברה של תאי העניין בדיוק.
עיבודים קלים של הפרוטוקול המתואר כאן יכולים לאפשר מגוון רחב יותר של יישומים. במקום לבצע ביופסיות, התערבויות אחרות (כירורגי) ניתן ליישם, כגון כריתת הגידול חלקית או המסירה של וופלים כימותרפיה. התוספת של תרכובות באמצעות microtube מושתל בניתוח עשוי להיות משולב עם פרוטוקול זה כדי פרמקואוטיולוגית היעד מולקולות ספציפיות של עניין. אנו מצפים כי מודל זה יהיה שימושי במחקרים במטרה לנתח את ההשפעה של התערבות מסוימת על התנהגות תא הגידול. האפשרות לבצע פעולות חוזרות ונשנות באותה חיה לא רק מספקת נתונים מדויקים יותר על שינויים המתרחשים בגידול, אלא גם מפחית במידה ניכרת את מספר החיות הנסיוניות הדרושות לכל מחקר.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים לנקו דה Graaff ומרכז ההדמיה של הורכט לתמיכה בהדמיה ולאלן Wehrens ולהאנה ג'ונסון על הגהה ועריכה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529 (2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145 (2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759 (2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148 (2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278 (2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014 (2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
