Summary
Her beskriver vi en metode til High-Resolution time-lapse multiphoton Imaging af hjernen tumorceller før og efter invasiv kirurgisk indgreb (f. eks biopsi) inden for samme levende dyr. Denne metode gør det muligt at studere virkningen af disse invasive kirurgiske procedurer på tumor cellernes migrerende, invasive og proliferativ opførsel på et enkelt celleniveau.
Abstract
Biopsier er standard for behandling af kræftbehandling og er klinisk gavnlig, da de tillader solid tumor diagnose, prognose, og personlig behandling bestemmelse. Men, forstyrrelse af tumor arkitektur ved biopsi og andre invasive procedurer har været forbundet med uønskede virkninger på tumorprogression, som skal undersøgt i dybden for yderligere at forbedre den kliniske fordel af disse procedurer. Konventionelle statiske tilgange, som kun giver et øjebliksbillede af tumoren, er begrænset i deres evne til at afsløre virkningen af biopsi på tumor celle adfærd såsom migration, en proces tæt relateret til tumor malignitet. Især tumor celle migration er nøglen i stærkt aggressive hjernetumorer, hvor lokale tumor udbredelse gør Total tumor resektion næsten umulig. Udviklingen af multiphoton Imaging og kroniske Imaging vinduer giver forskerne mulighed for at studere denne dynamiske proces i levende dyr over tid. Her beskriver vi en metode til højopløsnings-langsgående billeddannelse af hjernetumor celler før og efter en biopsi i det samme levende dyr. Denne fremgangsmåde gør det muligt at studere virkningen af denne procedure på tumor celle adfærd (migration, invasion, og spredning). Desuden diskuterer vi fordele og begrænsninger af denne teknik, samt evnen af denne metode til at studere ændringer i kræft celle adfærd for andre kirurgiske indgreb, herunder tumor resektion eller implantation af kemoterapi Vafler.
Introduction
Standard for pleje for de fleste solide tumorer omfatter vævs biopsi til diagnose, prognose, og personlig behandling bestemmelse1,2. Samlet, disse procedurer giver klinisk fordel, men nylige beviser tyder på, at biopsi og andre mere invasive procedurer, såsom tumor resektion, kan også negativt påvirke tumorprogression3,4,5 , 6. selv om disse procedurer fortsat er uundværlige i patientplejen, og deres fordele overvinder deres negative virkninger, er det nødvendigt fuldt ud at forstå mekanismerne bag disse negative virkninger for at maksimere patienternes sikkerhed og positive påvirkninger af disse procedurer og gøre dem endnu mere klinisk gavnlige.
Biopsi-medierede uønskede virkninger på tumorprogression udløses af systemiske ændringer og ændringer i tumor mikromiljø som reaktion på vævs forstyrrelse4,5. Derfor er det nødvendigt at studere denne proces i levende dyr. Men de subtile konsekvenser af disse minimalt invasive procedurer kan ofte være forklædt af store variationer mellem individer. Konventionelle metoder baseret på immunhistokemisk eller transkriptional udtryks analyse kan overse disse virkninger eller kræve et stort antal dyr til at identificere dem. Desuden, disse statiske tilgange mangler evnen til at identificere ændringer i tumor celle adfærd såsom migration og invasion, dynamiske processer, der korrelerer med tumor malignitet. Disse tumor celle funktioner er af særlig betydning for stærkt aggressive hjernetumorer, såsom glioblastoma multiforme (GBM), hvor den lokale spredning af tumorceller begrænser kirurgisk resektion og nedsætter patientens overlevelse7. For fuldt ud at forstå, hvordan biopsier påvirker opførsel af GBM celler, er der behov for en langsgående tilgang, der tillader visualisering af disse celler i den fysiologiske sammenhæng af levende organismer.
Den seneste udvikling af høj opløsning intravital Imaging i kombination med kirurgisk implanteret kronisk billeddannelse vinduer giver forskerne mulighed for at studere den dynamiske opførsel af tumorceller i levende mus over flere dage8,9. Ved hjælp af denne kraftfulde tilgang kan vi studere, hvordan tumor cellernes proliferative, migrerende og infiltrativ adfærd ændrer sig over flere dage som reaktion på en biopsi i samme mus. Sammenlignet med andre teknikker, der muliggør multi-dages monitorering af tumorer i levende mus, såsom magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)10, positronemissiontomografi/computertomografi (PET/CT)11eller bioluminescerende billeddannelse12, approach unikt giver mulighed for at studere tumor celle adfærd på enkelt celleniveau og unraveling subtile ændringer, der forekommer inden for tumoren.
Her beskriver vi en detaljeret metode til at udføre biopsi-lignende skader og præ-og postbiopsi langsgående intravital Imaging i hjernen af tumor bærende mus. Denne metode kan potentielt anvendes til at studere andre kirurgiske indgreb, såsom partiel tumor resektion eller implantation af kemoterapi wafers.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra dyrevelfærds komiteen under det kongelige nederlandske akademi for kunst og videnskab, Nederlandene. De forsøgsprotokoller, der blev anvendt i dette manuskript, blev godkendt af centrale Commissie Dierproeven (CCD) og Instantie voor Dierenwelzijn (IvD).
1. klargøring af tumor celle implantation og kranie Imaging Window
- Kirurgisk forberedelse
- Brug voksne mus (> 6 uger gamle) af enhver stamme eller køn. Sedat en mus ved indsprøjtning (fluanisone [neuroleptic] + fentanyl [opioid]) (0,4 mL/kg) + benzodiazepin sedativ (2 mg/kg) i en dosis på 1:1:2 i sterilt vand. Vurder dyrets sedation tilstand ved tå knivspids.
Bemærk: i denne protokol blev både kvindelige og mandlige C57BL/6-mus brugt på grund af den samme genetiske baggrund af tumor celle linjen, der anvendes i disse eksperimenter (GL261). Musen vil forblive fuldt bedøvet for 1,5 h. Alternativt kan du bruge inhalations anæstesi såsom isofluran (1,5%-2% isofluran/O2 blanding). - Monter musen på en Stereotaktisk ramme og fastgør hovedet ved hjælp af en næseklemme og to øre stænger.
- Brug en varmelampe til at bevare kropstemperaturen. Varmelampe bør anvendes med forsigtighed, alternativt vand recirkulerende varmepuder kan anvendes.
- Påfør øjensalve for at beskytte musens hornhinder fra tørring.
- Brug skarp saks til at barbere pels på kraniet (dorsale område fra musens øjne til bunden af kraniet) og desinficere den udsatte hud med 70% ethanol.
- Skær huden på en cirkulær måde med skarp saks og skrabe periosteum nedenunder med en vatpind. Påfør en dråbe lidocain 1% + epinephrin 1:100000 i 5 min, og Fjern overskydende med en vatpind.
- Lim kanterne af huden til kraniet med cyanoacrylat lim.
- Placer den stereotaktiske ramme under et dissektions stereomikroskop med 4X forstørrelse.
- Visualiser kraniet gennem dissektion mikroskop og bor en cirkulær rille på 5 mm i diameter over den højre parietal knogle. Udfør dette trin omhyggeligt og kun overfladisk, undgå ethvert pres på kraniet.
- Påfør en dråbe cortex buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES buffer, 2 mM MgSO4, og 2 mm CaCl2 [pH 7,4]) og løft knogle klap ved hjælp af tynde pincet.
- For de følgende trin skal du holde hjerne overfladen dækket med cortex buffer, medmindre andet er angivet.
- Under dissektion mikroskopet, Visualiser hjernens overflade og fjern dura mater ved hjælp af buede, tilspidsede, meget fine punkt tweezers. Hvis blødning opstår på dette stadium, bruge en absorberbare gelatinesvamp til at stoppe det.
- Brug voksne mus (> 6 uger gamle) af enhver stamme eller køn. Sedat en mus ved indsprøjtning (fluanisone [neuroleptic] + fentanyl [opioid]) (0,4 mL/kg) + benzodiazepin sedativ (2 mg/kg) i en dosis på 1:1:2 i sterilt vand. Vurder dyrets sedation tilstand ved tå knivspids.
- Tumor celle injektion
- Resuspendere den ønskede mængde fluorescerende tumorceller i ~ 3 μL PBS (f. eks. for de eksperimenter, der er vist i denne protokol, 1 x 105 GL261 celler blev injiceret).
Bemærk: mens enhver fluorescerende markør kan anvendes, en nuklear markør er stærkt tilrådes, at spore individuelle tumorceller under analyse. Derudover kan en histone-forbundet fluorescerende markør, såsom H2B, bruges til at visualisere kromosom kondensation og dermed til at overvåge celledelingen. Brugen af en foto-switchable markør, såsom Dendra2, tillader foto-mærkning og sporing af tumorceller over flere dage4,13. - Læg tumorcellerne i en 10 μL gastæt sprøjte med en punkttype 2 nål og fastgør den på den stereo taxiske manipulator arm.
- Fjern cortex bufferen. Placer spidsen af sprøjten i midten af kraniotomi og Indsæt den i en dybde på 0,5 mm fra overfladen af kraniet. Eventuelt oprette en lille plads i hjernen til at rumme tumor cellesuspension. Til dette skal du sætte sprøjten op til en dybde på 1 mm og derefter hente den op til 0,5 mm før injektionen.
- Påfør en dråbe cortex buffer.
- Injicer langsomt cellesuspensionen ved hjælp af en mikrosprøjtens pumpe injektor (250 – 400 nL/min). Fjern sprøjten og brug en absorberbare gelatinesvamp til at standse enhver blødning, hvis det er nødvendigt.
- Resuspendere den ønskede mængde fluorescerende tumorceller i ~ 3 μL PBS (f. eks. for de eksperimenter, der er vist i denne protokol, 1 x 105 GL261 celler blev injiceret).
- Klargøring af kraniel billedbehandlings vindue
- Fjern cortex buffer og placere en dråbe silikoneolie på kraniotomi site for at undgå luftbobler under vinduet.
- Forsegl den udsatte hjerne med en 6 mm dækseddel. Påfør cyanoacrylat lim mellem dæksedlen og kraniet. Tryk forsigtigt dæksedlen mod kraniet ved hjælp af fine pincet for at sikre minimal afstand mellem hjernen og dæksedlen.
- Påfør dental akryl cement på kraniets overflade, der dækker kanten af dæksedlen. Anbring en tynd ring i rustfrit stål (1,5 mm i udvendig diameter, 1 mm i indvendig diameter) omkring kraniotomi, og lad tand cementen tørre. Eventuelt tilføje nogle lim på kanten for at sikre ringen på toppen af hovedet.
Bemærk: dette hoved fikseringssystem er optimalt til billeddannelse på et inverteret mikroskop: små magneter, der er indlejret i billedboksen, letter fikseringen af kranie billedbehandlings vinduet (CIW). I forsøgene i denne protokol blev der anvendt et inverteret mikroskop. For opretstående mikroskoper kan fiksering opnås ved hjælp af en bar eller en ringen med riller, der kan fastgøres til mikroskopet ved hjælp af skruer eller en plade, der passer til ringen. - Til smertebehandling indsprøjtes en enkelt dosis på 100 μg/kg buprenorphin subkutant og giver dyret mulighed for at komme sig på en varmepude.
- Placer musen i et enkelt bur med strimlet papir til berigelse. Nøje overvåge musen dagligt i de første par dage og 2x per uge, derefter, for normal adfærd, reaktivitet, og udseende.
2. intravital billeddannelse
Bemærk: tidsintervallet mellem tumor celle injektion og den første intravital Imaging session er afhængig af den type tumor cellelinje, der anvendes. For de eksperimenter, der er vist i denne protokol, 1x 105 GL261 celler blev injiceret og afbildet 10 dage senere.
- Forberedelse af billedbehandling
- Sedate musen ved hjælp af isofluran indånding anæstesi gennem en ansigtsmaske (1,5%-2% isofluran/O2 blanding).
- Injicer musen subkutant med 100 μL salt buffer for at forhindre dehydrering.
Bemærk: ved langtids scanning kan musen hydreres gennem en subkutan infusionspumpe. - Placer musen med forsiden opad i en billedboks. Brug en metalplade med et hul på 1 mm diameter og små magneter indlejret omkring blænden for at give fiksering af CIW til billedboksen. Isofluran indføres gennem en ansigtsmaske og ventilerer ved en stikkontakt på den anden side af æsken (0,8% – 1,5% isofluran/O2 -blanding). Alternativt kan du bruge tape til at fastsætte kroppen af musen.
Bemærk: Fluorescently mærket dextran for blodkar visualisering eller andre farvestoffer kan injiceres intravenøst på dette punkt. - Du kan også bruge et iltmætning og en opvarmnings sonde til at overvåge musens Vitaler.
Bemærk: i dette eksperiment var det ikke nødvendigt at bruge et iltmætning og en opvarmnings sonde, da musen var stabil i hele billedtids perioden (2 – 3 timer). Men for længere billedbehandlings tider kan der være behov for mere grundig overvågning. - Indstil vand målsætningen 25x (f. eks. HCX IRAPO NA 0,95 WD 2,5 mm) til den laveste z-position, og tilsæt en stor dråbe vand.
Bemærk: brugen af en vand nedsænkning mikro dispenser er meget rådes til langvarige eksperimenter, da det giver forskerne mulighed for at tilføje vand under eksperimentet. Alternativt kan der anvendes et tørt mål. - Overfør billedboksen til mikroskop udstyret med et mørkt klimakammer holdt ved 37 °C. Bring målet til CIW dækglas, indtil vandfaldet rører det.
- Ved hjælp af epifluorescens tilstand, observere tumoren gennem okular og bringe cellerne i fokus.
- Tidsforskudt billed erhvervelse
- Vælg flere positioner af interesse for billedet, og Optag deres koordinater i softwaren. Sørg for, at de valgte positioner er repræsentative positioner fra forskellige steder af tumoren (hver tumor kan være forskellige, men for at sikre konsistens, skal du vælge den samme mængde af positioner, der er centrale for tumor kerne og til kanterne på tværs af alle mus).
Bemærk: en flise scanning af en del af tumoren eller af hele den synlige tumor kan udføres; men hvis tumoren er stor, vil denne metode øge tidsforskydning mellem billeder. Hertil kommer, at hvis tumorcellerne bevæger sig hurtigt, kan det være udfordrende at spore de samme celler over tid. - Skift til multiphoton-tilstand, og Indstil laseren til den korrekte bølgelængde. Bemærk, at for at undgå foto skader ønskes højere bølgelængder.
Bemærk: ved Dendra2-Imaging blev der anvendt en bølgelængde på 960 nm. Med det mål, der anvendes i disse eksperimenter, en zoom på 1,3 var tilstrækkelig til at få en god opløsning af tumor kerner og scanne et repræsentativt område af tumoren. - Gå til live-tilstand og definere en z-stak for hver position for at erhverve den maksimale volumen af tumorceller uden at kompromittere tumor celle opløsningen. Definer trin størrelsen mellem billederne som 3 μm.
- Brug tovejs tilstand til at øge scanningshastigheden. Billedopløsningen skal være mindst 512 x 512 pixels.
- Erhverve billeder af tumorvolumen på forskellige positioner hver 20 min for 2 h. Tilsæt vand til målet før hvert billede erhvervelse.
Bemærk: tidsforskudt billeder kan automatisk erhverves ved at indstille den rigtige tid-lapse i softwaren. Men musen kan bevæge sig, og positionen eller z-stakken kan skifte over tid, hvilket forårsager tab af data. Derfor anbefales det at udføre time-lapse manuelt og at kontrollere og justere for XYZ skift i mellem anskaffelser. - På dette trin, valgfrit, foto-switch Dendra2 fluorescerende markør.
Bemærk: i modsætning til time-lapse Imaging (som gør det muligt at studere individuelle tumorceller egenskaber og hvordan de ændrer sig over tid), dette vil gøre det muligt at studere området af tumor celleinfiltration i hjernen over flere dage4. En detaljeret forklaring af dette trin er beskrevet af Gligorijevic et al.13. - Når det sidste billede er erhvervet, skal du fjerne musen fra scenen og lade den komme sig på en varmepude. For at forhindre dehydrering kan 100 μL saltvand gives subkutant. Placer musen i sit bur indtil biopsi-lignende skade udføres.
- Vælg flere positioner af interesse for billedet, og Optag deres koordinater i softwaren. Sørg for, at de valgte positioner er repræsentative positioner fra forskellige steder af tumoren (hver tumor kan være forskellige, men for at sikre konsistens, skal du vælge den samme mængde af positioner, der er centrale for tumor kerne og til kanterne på tværs af alle mus).
3. biopsi-lignende skade og CIW udskiftning
- Opret en biopsi-lignende skade på tumor stedet 1 dag efter den første Imaging session.
Bemærk: Alternativt, en anden procedure, ligesom partiel tumor fjernelse, kan udføres.- Sedate musen ved hjælp af isofluran indånding anæstesi som tidligere beskrevet i trin 2.1.1.
Bemærk: mens injicerbar anæstesi kan anvendes, denne procedure er kortere end CIW implantation, og indånding anæstesi gør det muligt at præcist kontrol og for at reducere den tid, hvor musen forbliver bedøvet. - Placer musen på en stereotaxisk ramme og fastgør hovedet med to øre stænger og en næseklemme. Kontroller dybden af anæstesi ved manglende pedal reflekser. Brug en anæstesi maske til stereotaxisk kirurgi for at holde musen bedøvet under proceduren.
- Sug en vatpind i acetone og Spred den rundt om kanten af dæksedlen for at blødgøre den lim, der holder coversedlen mod hjernen.
- Skub tynde spids Tang under dæksedlen for at løfte den. Hvis dæksedlen bryder på dette tidspunkt, skal du bruge pincet til at fjerne glas stykker.
- Anvende cortex buffer til at holde hjernen fugtig.
- Dyp en 25 G nål i tumoren til en dybde på 1 mm. Fjern nålen og stop blødningen, hvis det er nødvendigt, ved at anvende en gelatine steril svamp.
Bemærk: dette trin kan udføres under et fluorescerende stereomicroskop til mere præcist at identificere tumor området (hvis tumoren er for lille). Derudover kan en 1 μL opløsning af fluorescerende polystyren 1 μm perler injiceres under punktering for at identificere det biopsierede område. - Forsegl hjerne overfladen med silikoneolie og lim en 6 mm dækseddel på toppen.
- Sedate musen ved hjælp af isofluran indånding anæstesi som tidligere beskrevet i trin 2.1.1.
4. gentagen billeddannelse
- En dag efter påfører den biopsi-lignende skade (og på sammenhængende dage, hvis det er nødvendigt), Gentag intravital Imaging som beskrevet i trin 2 ovenfor for at vurdere, hvordan tumor celle adfærd ændrer sig over tid. Vælg flere positioner af tumoren, der ville være repræsentativ for hele tumor området.
Bemærk: Hvis fluorescerende perler blev brugt til at identificere det biopsierede område, lokalisere dem til billedet tumor celle adfærd i de biopsierede regioner i forhold til ikke-biopsierede regioner.
5. billedanalyse
- Hvis tidsforskudt billeder blev erhvervet manuelt, kombinere dem i en mappe.
- Åbn filen time-lapse LIF i den kommercielle software, der er forbundet med mikroskopet (f. eks. LasX eller LAS AF). Vælg fanen proces ≫ proces værktøjer > Flet. Vælg det første billede af tids sekvensen, og klik først. Vælg det andet billede af tids sekvensen, og klik på sekund. Vælg t for tid i flette dimensioner. Klik på Anvend. En ny fil med to tidspunkter vil blive genereret. Gentag denne proces for alle tidspunkter ved hjælp af den nyoprettede fil som det første billede i sekvensen.
- Korriger de erhvervede z-stakke for ethvert XYZ -Skift.
Bemærk: for de eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol, er et specialdesignet Visual Basic-softwareprogram blevet brugt til rettelse. Alternativt kan andre tilgængelige software bruges, såsom ImageJ eller Imaris.- Eksporter TIFF-filer fra softwaren ved at højreklikke på den flettede time-lapse-fil. Vælg Gem rå data. De eksporterede filer vil blive eksporteret til en mappe med navnet i henhold til kanal, tid og z-position.
- Åbn TIFF-filerne i det specialdesignede Visual Basic-softwareprogram.
- Definer antallet af tidspunkter, z-stakke og kanaler.
- Tildel en farve til hver kanal efter rækkefølgen af udseendet.
- Ret skiftet i z ved at klikke på knapperne op (U) eller ned (D) i formular panelet Vis for hvert tidspunkt.
- I panelet Intravital image Building skal du vælge den kanal, der skal bruges til at korrigere for XY -Skift. Vælg den grønne kanal for at korrigere, baseret på signalet fra tumorcellerne. Klik på automatisk for XY -korrektion.
- Eksporter de rettede billeder som en maksimal projektion på tre på hinanden følgende z-stakke. I panel markeringenskal du introducere numrene på de første (BEGIN) og sidste () z-udsnit, der skal eksporteres. Vælg Maks. Vælg separate mapper til Z. Klik på do. For hver af dem, tre z-stakke, tidsforskudt billeder vil blive eksporteret til en separat mappe.
- Valgfrit, korrekt for vævet elastisk deformation.
Bemærk: for væv elastisk deformation eksperimenter, en match motion kompensation softwareprogram blev brugt til at korrigere for stiv og elastisk vævs deformation14. - Spor enkelte celler i den komplette z-stak i time-lapse-filmen.
Bemærk: tumor celler kan spores manuelt ved hjælp af, for eksempel, en ImageJ plugin (MTrackJ). Mens nøjagtig, dette er begrænset til XY flyet og er meget tidskrævende. Alternativt kan tumorceller spores automatisk gennem hele z-volumen, ved hjælp af tumor celle segmentering (f. eks imaris software). Men i meget tætte tumorer er automatiseret sporing mindre præcis og kan give anledning til flere Sporingsfejl.- Åbn og spor hver time-lapse-serie (for tre på hinanden følgende z-stakke) separat. Træk den mappe, der indeholder timelapse-billederne, til ImageJ.
- Vælg fanen Plugins > tracking > mtrackj. Spor hver enkelt celle ved at vælge Tilføj og klikke på hver celle på hvert tidspunkt.
- Uddrag målingen af sporene ved at klikke på mål og gemme filen.
Representative Results
For at vurdere virkningen af biopsi på hjernen tumor celle adfærd, vi udførte den procedure, der er beskrevet i denne protokol. Glioma — GL261 celler — der udtrykker et atomfluorescerende protein (H2B-Dendra2), blev injiceret i hjernen på C57BL/6 mus, og en kronisk CIW blev implanteret. Time-lapse intravital Imaging blev udført på samme dyr præ-og post-biopsi-lignende skade på tumoren (figur 1a, B). Migrationen af individuelle tumorceller blev bestemt ved at spore migrations stien over tid i forskellige XY -planer i z-stakken (figur 1c) og afbildet som en procentdel af migrerende celler præ-og postbiopsi (figur 1f). Tumor celle sprednings hastigheden blev kvantificeret baseret på H2B-mærket Dendra2 kondensation ved mitose (figur 1d) og afbildet som en procentdel af dividere celler præ-og postbiopsi (figur 1E). Vi sammenlignede fordelingen af migrations hastigheden før og efter biopsi i samme tumor og fandt ud af, at antallet af migrerende celler (hastighed > 4 μm/h) steg efter interventionen, med et associeret fald i antallet af langsomme/ikke-migrerende celler ( hastighed < 4 μm/time) (figur 2a). I gennemsnit pr tumor observerede vi en 1,75 (SD = 0,16)-fold stigning i procentdelen af migrerende celler, når en biopsi-lignende skade blev udført, sammenlignet med kontrol mus, der ikke var biopsi (figur 2b). Vi overvågede tumor celle adfærd for en anden uge og fandt ud af, at selv om andelen af migrerende tumorceller til sidst faldt i både kontrol-og biopsierede mus, udviste de biopsierede mus stadig en højere migrations kapacitet end kontrol musene ( Figur 2c). Analysen af tumor celle proliferativ adfærd over tid viste en 1,52 (SD = 0.26)-fold stigning i antallet af mitotiske hændelser ved biopsi, i forhold til nonbiopsied Control mus (figur 2D).
For at teste, om de observerede virkninger af biopsi på tumor celle proliferativ og migrerende adfærd var en artefakt på grund af CIW udskiftning kirurgi (kræves for at udføre en biopsi-lignende skade), vi overvågede tumor celle adfærd i en gruppe af mus, der gennemgik CIW udskiftning uden biopsi. I denne gruppe, vi ikke observere nogen induktion af migration eller spredning af tumorceller, hvilket indikerer, at Boost i tumor celle proliferation og migration satser blev specifikt udløst af biopsi-lignende skade (figur 3a, B).
Stabil foto-konvertibilitet af fluorescerende protein Dendra2 giver mulighed for at studere tumor celleinfiltration over flere dage. Ved udsættelse for ultraviolet/blåt lys, er Dendra2 irreversibelt skiftet fra grøn til rød. Ved hjælp af denne egenskab blev en firkantet region af tumoren belyst og ~ 200 Dendra2-udtrykte tumorceller var foto-mærket før biopsi (figur 4). En dag efter biopsi, vi flyttede den foto-skiftede region og målt mængden af tumorceller, der havde infiltreret i det omgivende tumor væv. Vi fandt, at infiltration område var 1,72 (SD = 0,41) gange større i tumorer efter en biopsi-lignende skade i forhold til nonbiopsied kontrol tumorer (figur 4). Selv om denne tilgang kun giver oplysninger om tumor celle bulk infiltrativ adfærd og ikke på en enkelt celleniveau, det er mindre tidskrævende end tidsforskudt Imaging tilgang og kan være den metode til valg af forskningsspørgsmål fokuseret udelukkende på at studere infiltrativ opførsel.
Figur 1: eksperimentel opsætning for langsgående intravital billeddannelse af biopsi effekt på tumor celle adfærd. A) etdiagram, der viser Ringenes og magnet holderens udformning. B) skematisk gengivelse af forsøgs arbejdsgangen. Tumor celler injiceres i hjernen af mus og en CIW er etableret. Efter tumor udvikling, en første (prebiopsi) time-lapse Imaging session udføres. Den næste dag, biopsi og CIW udskiftning er implementeret. Dagen efter billeddannelse (postbiopsi) udføres en anden tidsforskudt billedbehandlings session. For langtidseffekter, efterfølgende Imaging sessioner kan gøres. (C) billeder viser repræsentative snapshots af en time-lapse-film, hvor GL261 H2B-Dendra2 tumorceller blev sporet. Røde linjer skildrer individuelle tumor celle spor. Skalaen bar = 50 μm.d) repræsentative in vivo tidsforskudt billeder, som viser skille celler i GL261 H2B-Dendra2 tumorer. Der er angivet forskellige stadier af mitose: prophase (P), prometaphase (PM), metafase (M), kaldelse (A) og telophase (T). Skalaen bar = 50 μm. grafer Angiver procentdelen af (E) vandrende og (F) dividere celler præ-og postbiopsi. Hver prik angiver procentdelen af migrerende celler i alle positioner målt i et enkelt dyr. Dataene vises som middelværdien ± S.E.M. af seks mus (* *P < 0,01, parret t-test). Dette tal er blevet modificeret fra Alieva et al.4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative resultater, der viser virkningen af biopsi på tumor celle migration og spredning satser. (A) vandfalds områder, der viser ændringen i celle hastigheds fordelingen i forhold til basal migration i individuelle mus. Dataene vises som middelværdien ± S.E.M. af fem mus. (B) antallet af migrations celler i kontrol (blå) og biopsierede (røde) dyr normaliseret til antallet af migrerende celler præintervention (n = 6 mus, * * *P < 0,0001, student's t-test). (C) tumor celle adfærd blev sporet over flere dage. Vist er det normaliserede (i forhold til preintervention) antallet af migrerende celler i individuelle mus over tid (n > 4 mus per tilstand, * * *P < 0,0001, tovejs ANOVA). D) det normaliserede antal skille celler i kontrol (blå) og biopsierede (røde) dyr. Pr. enkelt dyr blev værdierne efter intervention normaliseret til værdierne forintervention (n = 5 mus, * *P < 0,01, student's t-test). Dette tal er blevet modificeret fra Alieva et al.4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: CIW udskiftning har ingen effekt på tumor celle adfærd. Longitudinel intravital Imaging viser, at udskiftningen af CIW uden biopsi ikke har nogen indvirkning på migrations-og sprednings raterne. A) stigningen i antallet af migrerende celler for de angivne betingelser. Hvert symbol repræsenterer middelværdien af en individuel mus og n≥ 4 mus. B) stigningen i antallet af prolifererende celler under de angivne betingelser. Hvert symbol repræsenterer middelværdien af en individuel mus (n≥ 4 mus, * *p < 0,01, * * *P < 0,001, ns = ikke signifikant, envejs ANOVA med Newman-keuls post hoc-test). Dette tal er blevet modificeret fra Alieva et al.4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: diagram, der viser den eksperimentelle opsætning og repræsentative resultater opnået med Dendra2 foto-switching. For at overvåge tumor celleinfiltration ved biopsi, Dendra2-udtrykker tumorceller er foto-skiftet i en firkantet region ved UV/blå lys belysning og imaged, 1 dag før biopsi. En dag efter biopsi, den foto-skiftede region er flyttet og genindsættes. Vist er repræsentative Dendra2 billeder af tumor celleinfiltration, korrigeret ved hjælp af kanal subtraktion. Den hvide stiplede linje repræsenterer infiltrerings området. Skala bjælken = 50 μm. Grafen viser det øgede foto koblede område, som er afbildet for biopsierede (røde) og kontrol (blå) mus. Hver prik repræsenterer middelværdien af en individuel mus (n≥ 5 mus, *P < 0,05, elevens t-test). Dette tal er blevet modificeret fra Alieva et al.4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her beskriver vi en metode til at studere ændringer i tumor celle adfærd på enkelt celleniveau som reaktion på invasive kirurgiske indgreb, såsom en biopsi, i hjernen hos et levende dyr. Kombinationen af langsgående multifoton billeddannelse med kirurgisk implantation af en kronisk CIW gør det muligt at kvantificere tumor celle migration, invasion og spredning før og efter biopsi i samme dyr4. Sammenlignet med andre tilgange, der anvendes til tumor multiday overvågning, såsom bioluminescerende Imaging12, MRI10, eller PET/CT11, denne metode entydigt visualiserer tumorer på et enkelt celleniveau og dermed giver indsigt i cellulære adfærd underliggende tumorprogression.
For at kunne udføre denne metode, bør flere procedurer beherskes. De mest kritiske trin i denne protokol er CIW implantation og udskiftning. Den tekniske kompleksitet af disse trin kræver præcision og kirurgiske færdigheder, der kan erhverves med stabil træning. Komplikationer under CIW kirurgi, såsom blødning, som kan dække hjernens overflade, kan vise sig udfordrende for efterfølgende billeddannelse. En mangel på sterile værktøjer eller miljø, samt manglende helt forsegle hjernen overflade, kan forårsage en infektion på hjernen overflade (hvid væske under dæksedlen), som vil gøre Imaging problematisk og stærkt kompromittere den resulterende Fortolkning. Et andet fælles spørgsmål i denne protokol er flytning af dyr under tidsforskudt billeddannelse. Mens et XYZ -Skift kan korrigeres efter eksperimentet, anbefales det at korrigere koordinaten for hver position før hvert tidspunkt for at forhindre tab af information. Vævs deformation er et yderligere problem, der blev fundet ved billeddannelse på et inverteret mikroskop. Hjernevæv lider af kompression, når musen er placeret i liggende position. Afhængigt af graden af vævs deformation kan tumor celle sporing føre til en fejlagtig kvantificering af celle forskydning. For at forhindre dette, kan en software til stiv og elastisk deformation anvendes14.
Mens denne procedure tilbyder en bred ansøgning om at studere ændringer i tumor adfærd, visse begrænsninger bør overvejes. Denne metode giver forskerne mulighed for at billede op til en dybde på 1,6 mm (med brug af en optisk parametrisk oscillator); men det betyder, at billeddannelse er begrænset til overfladiske hjernebarken områder15. Således, nogle hjernetumorer placeret i dybe hjernestrukturer, herunder diffus iboende Pontine gliomer placeret i hjernestammen region, kan ikke undersøgt i deres oprindelige hjerne miljø med denne protokol. En anden begrænsning af denne protokol er mængden af tumoren, der kan imaged. Selv om total tumorvolumen scanning ønskes for at opnå maksimal information, ofte, tumorstørrelse og hastigheden af migrerende celler kan være begrænsende faktorer. For hver tumortype skal der tages hensyn til en optimal tidsforskydning for billeddannelse. Hvis tidsrammen mellem billederne er for lang, kan det være svært at spore tumorcellerne. Brugen af en resonans scanner kan meget reducere scanningstiden, tillader billeddannelse af en større tumor16. Endelig kan den manuelle billedanalyse af denne protokol være meget tidskrævende, så i stedet kan programmer til automatiseret 3D-sporing bruges. Men, resultatet af sporing bør altid være visuelt overvåget, da algoritmer til automatiseret celle sporing er sjældent designet til at rekapitulere præcis migrering af de celler af interesse.
Mindre tilpasninger af den protokol, der er beskrevet her, kan muliggøre en endnu bredere vifte af applikationer. I stedet for at udføre biopsier, andre (kirurgiske) interventioner kan gennemføres, såsom delvis tumor resektion eller levering af kemoterapi wafers. Tilsætning af forbindelser gennem et kirurgisk implanteret mikrorør kan kombineres med denne protokol til farmakologisk at målrette specifikke molekyler af interesse. Vi forventer, at denne model vil være nyttige i undersøgelser, der har til formål at analysere virkningen af en bestemt intervention på tumor celle adfærd. Muligheden for at udføre gentagne foranstaltninger i det samme dyr giver ikke blot mere nøjagtige data om ændringer, der forekommer i tumoren, men reducerer også i høj grad antallet af forsøgsdyr, der er behov for pr. undersøgelse.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker ANKO de Graaff og Hubrecht Imaging Center for deres billedbehandlings støtte og Ellen Wehrens og Hannah Johnson for korrekturlæsning og redigering af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529 (2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145 (2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759 (2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148 (2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278 (2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014 (2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
