Summary
ここでは、同じ生体動物内での侵襲的外科的介入(例えば生検)の前後の脳腫瘍細胞の高解像度タイムラプスマルチフォトンイメージングの方法について説明する。この方法は、これらの侵襲的外科的処置が腫瘍細胞の移動、侵襲的、増殖性の行動に対する影響を単一の細胞レベルで研究することを可能にする。
Abstract
生検はがん治療の標準的な治療であり、固形腫瘍の診断、予後、個別化された治療決定を可能にするので、臨床的に有益です。しかしながら、生検および他の侵襲的処置による腫瘍アーキテクチャの摂動は、腫瘍進行に対する望ましくない影響と関連しており、これらの処置の臨床的利益をさらに改善するために深く研究する必要がある。腫瘍のスナップショットのみを提供する従来の静的アプローチは、腫瘍悪性腫瘍に密接に関連するプロセスである腫瘍細胞行動に対する生検の影響を明らかにする能力に限られている。特に、腫瘍細胞の移動は、局所的な腫瘍の播播広が全腫瘍切除を事実上不可能にする非常に積極的な脳腫瘍の鍵である。マルチフォトンイメージングと慢性イメージングウィンドウの開発により、科学者は時間をかけて生きた動物のこの動的なプロセスを研究することができます。ここでは、同じ生体動物における生検前後の脳腫瘍細胞の高解像度縦方向イメージングの方法について説明する。このアプローチは、腫瘍細胞行動(移動、侵入、増殖)に対するこの手順の影響を研究することを可能にする。さらに、この技術の長所と限界、ならびに腫瘍切除や化学療法の移植を含む他の外科的介入に対する癌細胞行動の変化を研究するこの方法論の能力について議論する。ウェーハ。
Introduction
ほとんどの固形腫瘍の治療の標準は、診断のための組織生検、予後、およびパーソナライズされた治療決定1、2を含む。全体的に、これらの手順は臨床的利益を与えるが、最近の証拠は、生検および腫瘍切除のような他のより侵襲的な手順が、腫瘍の進行に悪影響を及ぼすことも示している3、4、5,6.これらの手順は、患者のケアに不可欠であり、その利点は、その負の効果を克服する一方で、患者の安全性と最大にするために、これらの負の影響の背後にあるメカニズムを十分に理解する必要があります。これらの手順の肯定的な影響とそれらがさらに臨床的に有益にする。
腫瘍進行に対する生検媒介性望ましくない効果は、組織破壊に応答する腫瘍微小環境の全身変化および変化によって引き起こされる4,5.したがって、生きた動物でこのプロセスを研究する必要があります。しかし、これらの最小限に侵略的な手順の微妙な結果は、多くの場合、個人間の大きなバリエーションによって偽装することができます。免疫組織化学または転写発現分析に基づく従来の方法は、これらの効果を見落としたり、それらを同定するために多数の動物を必要とする場合があります。さらに、これらの静的アプローチは、遊移および侵入、腫瘍悪性腫瘍と相関する動的プロセスなどの腫瘍細胞行動の変化を同定する能力を欠いている。これらの腫瘍細胞の特徴は、神経膠芽腫多色(GBM)のような非常に積極的な脳腫瘍にとって特に重要であり、腫瘍細胞の局所的な広がりは外科的切除を制限し、患者の生存率7を減少させる。生検がGBM細胞の挙動にどのように影響するかを完全に理解するには、生物の生理的文脈でこれらの細胞を視覚化できる縦方向のアプローチが必要です。
外科的に埋め込まれた慢性イメージングウィンドウと組み合わせた高分解能イントラビタルイメージングの最近の開発は、科学者が複数の日8、9にわたって生きているマウスの腫瘍細胞の動的挙動を研究することを可能にする。この強力なアプローチを用いて、同じマウスの生検に応じて、腫瘍細胞の増殖、移動、浸潤行動が数日間でどのように変化するかを研究することができます。磁気共鳴イメージング(MRI)10、陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)11、または生物発光イメージング12など、生きたマウスの腫瘍の複数日モニタリングを可能にする他の技術と比較して、これは、アプローチは、単一細胞レベルで腫瘍細胞の挙動を研究し、腫瘍内で起こる微妙な変化を解明する可能性を提供します。
ここでは、腫瘍性マウスの脳における生検様損傷および生体生体前および生後縦腔内イメージングを行う詳細な方法について説明する。この方法は、部分的な腫瘍切除または化学療法ウエハの移植などの他の外科的介入を研究するために潜在的に適用することができる。
Protocol
すべての実験は、オランダ王立芸術科学アカデミー動物福祉委員会のガイドラインに従って行われました。この原稿で使用される実験プロトコルは、中央コミュニシー・ディアプロヴェン(CCD)とインスタント・ヴォール・ディエレンヴェルツィン(IvD)によって承認されました。
1. 腫瘍細胞移植と頭蓋イメージングウィンドウ製剤
- 外科的準備
- 任意の株や性別の成体マウス(>6週齢)を使用してください。(フルアニゾン[神経レプチック]+フェンタニル[オピオイド])(0.4 mL/kg)+ベンゾジアゼピン鎮静剤(2mg/kg)を無菌水中で1:1:2の用量で注射してマウスを鎮静する。つま先のピンチによって動物の座り込み状態を評価します。
注:このプロトコルでは、これらの実験で使用される腫瘍細胞株の同じ遺伝的背景(GL261)のために、女性および雄のC57BL/6マウスの両方が使用された。マウスは1.5時間完全に鎮静されたままになります, 代わりに, イソファランなどの吸入麻酔を使用します (1.5%- 2% イソファラン/O2混合物). - マウスを立体フレームに取り付け、鼻クランプと2本のイヤーバーを使用してヘッドを固定します。
- 体温を保つために暖房ランプを使用してください。暖房ランプは注意して使用する必要があります、代わりに水再循環加熱パッドを使用することができます。
- マウスの角膜を乾燥から保護するために目の中に目のミントを適用します。
- 鋭いはさみを使って頭蓋骨の毛皮を剃り(マウスの目から頭蓋骨の基部まで背面領域)、露出した皮膚を70%のエタノールで消毒する。
- 鋭いはさみで皮膚を円形に切り、綿棒で下の骨膜をこすり落とします。リドカイン1%+エピネフリン1:100,000を5分間塗布し、綿棒で過剰を除去する。
- 皮膚の縁をシアノクリレート接着剤で頭蓋骨に接着します。
- 4倍の倍率で解剖ステレオ顕微鏡の下に立体フレームを配置します。
- 解剖顕微鏡を通して頭蓋骨を視覚化し、右頭頂部骨の上に直径5mmの円形溝をドリルします。頭蓋骨への圧力を避け、表面的にのみこのステップを慎重に実行します。
- 皮質バッファー(125 mM NaCl、5 mM KCl、10 mMグルコース、10 mM HEPESバッファー、2mM MgSO 4、および2 mM CaCl2 [pH 7.4])のドロップを適用し、薄い鉗子を使用して骨フラップを持ち上げます。
- 次の手順については、特に指定がない限り、脳表面を皮質バッファーで覆った状態に保ちます。
- 解剖顕微鏡の下で、脳表面を視覚化し、湾曲した、テーパー、非常に細かい点ピンセットを使用してデュラ母体を除去する。この段階で出血が発生した場合は、吸収性ゼラチンスポンジを使用して停止します。
- 任意の株や性別の成体マウス(>6週齢)を使用してください。(フルアニゾン[神経レプチック]+フェンタニル[オピオイド])(0.4 mL/kg)+ベンゾジアゼピン鎮静剤(2mg/kg)を無菌水中で1:1:2の用量で注射してマウスを鎮静する。つま先のピンチによって動物の座り込み状態を評価します。
- 腫瘍細胞注射
- PBSの〜3 μLで所望の量の蛍光腫瘍細胞を再中断する(例えば、このプロトコルに示す実験のために、1 x 105 GL261細胞を注入した)。
注:任意の蛍光マーカーを使用することができますが、核マーカーは、分析中に個々の腫瘍細胞を追跡することを強くお勧めします。さらに、H2Bなどのヒストン結合蛍光マーカーを用いて染色体凝縮を可視化し、細胞分裂を監視することができます。Dendra2のような写真切り替え可能なマーカーを使用すると、数日間にわたって腫瘍細胞の写真マーキングと追跡が可能になります4,13. - 10 μLのガスタイトシリンジに10μLのガスタイトシリンジにポイントスタイル2針を入れ、立体マニピュレータアームに固定します。
- 皮質バッファーを取り外します。注射器の先端を頭蓋の真ん中に置き、頭蓋骨の表面から0.5mmの深さで挿入します。必要に応じて、腫瘍細胞懸濁液を収容するために脳内に小さなスペースを作成します。このために、注射器を深さ1mmまで挿入し、注射前に最大0.5mmまで取り出します。
- 皮質バッファーのドロップを適用します。
- マイクロシリンジポンプインジェクター(250~400 nL/min)を使用してセル懸濁液をゆっくりと注入します。注射器を取り外し、必要に応じて出血を止めるために吸収性ゼラチンスポンジを使用してください。
- PBSの〜3 μLで所望の量の蛍光腫瘍細胞を再中断する(例えば、このプロトコルに示す実験のために、1 x 105 GL261細胞を注入した)。
- 頭蓋イメージングウィンドウの準備
- 皮質バッファーを取り外し、窓の下の気泡を避けるために、開頭術部位にシリコーンオイルの滴を置きます。
- 露出した脳を6mmのカバースリップで密封します。カバースリップと頭蓋骨の間にシアノクリレート接着剤を適用します。細かいピンセットの助けを借りて、頭蓋骨に対するカバースリップを静かに押して、脳とカバースリップの間の距離を最小限に抑えます。
- カバースリップの端を覆う、頭蓋骨の表面に歯科用アクリルセメントを適用します。頭蓋の周りに薄いステンレスリング(外径1.5mm、内径1mm)を置き、歯科用セメントを乾燥させます。必要に応じて、頭の上にリングを固定するために、境界線にいくつかの接着剤を追加します。
注:この頭部固定システムは反転した顕微鏡のイメージ投射のために最適である:イメージ投射箱に埋め込まれた小さい磁石は頭蓋イメージ投射窓(CIW)の固定を促進する。このプロトコルに示す実験では、反転顕微鏡を用いた。直立した顕微鏡のために、固定はねじまたはリングに合う版の助けを借りて顕微鏡に付けることができる溝が付いている棒かリングによって達成することができる。 - 疼痛管理のために、100 μg/kgのブプレノルフィンを皮下に注入し、動物が加熱パッドで回復できるようにします。
- 濃縮のために細断された紙で個々のケージにマウスを置きます。マウスを毎日毎日注意深く監視し、その後、通常の動作、反応性、および外観を、その後、週に2回監視します。
2. イントラバイタルイメージング
注:腫瘍細胞注射と第1のインビタルイメージングセッションとの間の時間間隔は、使用される腫瘍細胞株のタイプに依存する。このプロトコルに示す実験では、1x 105 GL261細胞を注入し、10日後に画像化した。
- イメージング調製
- イソファラン吸入麻酔をフェイスマスク(1.5%~2%イソファルラン/O2混合物)を用いてマウスを鎮静する。
- 脱水を防ぐために、100 μLの生理生理生理生理物バッファーでマウスを皮下に注入します。
注:長期イメージングのために、マウスは皮下注入ポンプを通して水和することができる。 - マウスを上向きにイメージボックスに配置します。直径1mmの穴と開口部の周りに埋め込まれた小さな磁石を備えた金属板を使用して、CIWをイメージングボックスに固定します。フェイスマスクを通してイソルランを導入し、ボックスの反対側の出口(0.8%~1.5%イソルラン/O2混合物)で換気します。必要に応じて、テープを使用してマウス本体を固定します。
注:血管可視化または他の染料のために蛍光標識されたデキストランは、この時点で静脈内に注入されてもよい。 - 必要に応じて、パルスオキシメータと加熱プローブを使用して、マウスのバイタルを監視します。
注:この実験では、マウスがイメージング期間(2~3時間)を通じて安定していたため、パルスオキシメータと加熱プローブを使用する必要はなかった。ただし、イメージング時間を長くするためには、より徹底的な監視が必要になる場合があります。 - 25x(例えば、HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm)の水の目的を最も低いz位置に設定し、大きな水滴を加えます。
注:水浸漬マイクロディスペンサーの使用は、科学者が実験中に水を追加することを可能にするので、長期実験のために強くお勧めします。あるいは、乾燥した目的を使用することができる。 - 37 °Cに保たれた暗い気候室を備えた顕微鏡にイメージ投射箱を移す。水滴が触れるまで、CIWカバースリップに目的を持って来ます。
- エピ蛍光モードを使用して、眼球を通して腫瘍を観察し、細胞に焦点を合わせます。
- タイムラプス画像取得
- 画像に関心のあるいくつかの位置を選択し、ソフトウェアに座標を記録します。選択した位置が腫瘍の異なる部位からの代表的な位置であることを確認します(各腫瘍は異なる場合がありますが、一貫性を確保するために、腫瘍コアとすべてのマウスのエッジに対して同じ量の位置を選択します)。
注:腫瘍の一部または目に見える腫瘍全体のタイルスキャンを実行することができます。しかし、腫瘍が大きい場合、この方法は画像間の時間経過を増加させる。さらに、腫瘍細胞が速く移動する場合、時間の経過とともに同じ細胞を追跡することは困難な場合があります。 - マルチフォトンモードに切り替え、レーザーを正しい波長に合わせて調整します。なお、光による損傷を避けるため、より高い波長が望まれる。
注:Dendra2イメージングでは、960 nmの波長が使用されました。これらの実験で使用される目的では、1.3のズームは腫瘍核の良好な解像度を得て、腫瘍の代表的な領域をスキャンするのに十分であった。 - ライブモードに移動し、腫瘍細胞の分解能を損なうことなく腫瘍細胞の最大体積を獲得するために、各位置のz -stackを定義します。画像間のステップ サイズを 3 μm として定義します。
- 双方向モードを使用して、スキャン速度を上げます。画像の解像度は、512 x 512 ピクセルを少なくとも使用する必要があります。
- 2時間毎に20分ごとに異なる位置で腫瘍体積の画像を取得し、各画像取得の前に目的に水を追加します。
注:タイムラプス画像は、ソフトウェアで適切なタイムラプスを設定することで自動的に取得できます。ただし、マウスは移動でき、位置またはzスタックは時間の経過と同時にシフトし、データ損失を引き起こす可能性があります。したがって、時間経過を手動で実行し、取得間のxyzシフトをチェックして調整することをお勧めします。 - このステップでは、必要に応じて、Dendra2蛍光マーカーをフォトスイッチする。
注:タイムラプスイメージングとは対照的に(個々の腫瘍細胞の特性とそれらが時間の経過とともにどのように変化するかを研究することができます)、これは数日間にわたって脳内の腫瘍細胞浸潤の領域を研究することができます4。このステップの詳細な説明は、グリゴリエビッチら13によって説明されています. - 最後の画像を取得した後、ステージからマウスを削除し、加熱パッド上で回復できるようにします。脱水を防ぐために、100 μLの生理生理生理を皮下に与えることができる。生検のような傷害が行われるまで、マウスをケージに入れる。
- 画像に関心のあるいくつかの位置を選択し、ソフトウェアに座標を記録します。選択した位置が腫瘍の異なる部位からの代表的な位置であることを確認します(各腫瘍は異なる場合がありますが、一貫性を確保するために、腫瘍コアとすべてのマウスのエッジに対して同じ量の位置を選択します)。
3. 生検様損傷およびCIW置換
- 最初のイメージングセッションの1日後に腫瘍部位で生検様損傷を作成する。
注:あるいは、部分的な腫瘍除去のような別の手順を行うことができる。- ステップ2.1.1で前述したように、イソファラン吸入麻酔を使用してマウスを鎮静する。
注:注射麻酔を使用することができますが、この手順はCIW移植よりも短く、吸入麻酔はマウスが鎮静されたままの時間を正確に制御し、短縮することを可能にします。 - マウスをステレオタックスフレームに置き、2本のイヤーバーとノーズクランプで頭を固定します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認してください。立体手術には麻酔マスクを使用して、手術中にマウスを鎮静させます。
- 綿棒をアセトンに浸し、カバースリップの端に広げて、カバースリップを脳に対する接着剤を柔らかくします。
- カバースリップの下に薄い点の鉗子をスライドさせて持ち上げます。この時点でカバースリップが壊れた場合は、鉗子を使用してガラスの破片を取り除きます。
- 脳を湿らせるように皮質バッファーを適用します。
- 腫瘍に25Gの針を1mmの深さに浸し、必要に応じてゼラチン滅菌スポンジを塗布して出血を止める。
注:このステップは、より正確に腫瘍領域を識別するために蛍光立体顕微鏡下で行うことができます(腫瘍が小さすぎる場合)。さらに、蛍光ポリスチレン1μmビーズの1 μL溶液を穿刺中に注入し、生検領域を同定することができる。 - 脳表面をシリコーンオイルで密封し、上部に6mmのカバースリップを接着します。
- ステップ2.1.1で前述したように、イソファラン吸入麻酔を使用してマウスを鎮静する。
4. 繰り返しイメージング
- 生検様損傷を与えた1日後(および必要に応じて連続した日に)、上記のステップ2で説明したように、腫瘍細胞の挙動が時間の経過とともにどのように変化するかを評価するために、インビタルイメージングを繰り返します。腫瘍領域全体を代表する腫瘍のいくつかの位置を選択します。
注:蛍光ビーズを使用して生検領域を同定した場合、非生検領域と比較して生検領域における腫瘍細胞の挙動を画像化するためにそれらを局所化する。
5. 画像解析
- タイムラプスイメージが手動で取得された場合は、それらを 1 つのフォルダに結合します。
- 顕微鏡に関連する商用ソフトウェア(LasXまたはLAS AFなど)でタイムラプスLIFファイルを開きます。[プロセスプロセス>プロセス ツール>マージ]タブを選択します。時間シーケンスの最初の画像を選択し、[最初]をクリックします。時間シーケンスの 2 番目のイメージを選択し、[秒]をクリックします。[寸法の差し込み]で、時間のtを選択します。[適用]をクリックします。2 つのタイムポイントを持つ新しいファイルが生成されます。シーケンスの最初のイメージとして新しく生成されたファイルを使用して、すべてのタイムポイントに対してこのプロセスを繰り返します。
- xyzシフトの取得済みzスタックを修正します。
注: このプロトコルで説明されている実験では、カスタム設計の Visual Basic ソフトウェア プログラムが修正に使用されました。また、ImageJ や Imaris などの他の利用可能なソフトウェアを使用することもできます。- マージされたタイムラプス ファイルを右クリックして、ソフトウェアから TIFF ファイルをエクスポートします。[RAWデータを保存]を選択します。エクスポートされたファイルは、チャネル、時刻、および z位置に従って名前が付けられた 1 つのフォルダにエクスポートされます。
- カスタム設計の Visual Basic ソフトウェア プログラムで TIFF ファイルを開きます。
- タイムポイント、z スタック、およびチャネルの数を定義します。
- 外観の順序で各チャンネルに色を割り当てます。
- [フォーム表示]パネルで、各タイムポイントで、上 (U) または下 (D) ボタンをクリックしてzのシフトを修正します。
- イントラバイタル イメージビルディングパネルで、xy シフトの修正に使用するチャネルを選択します。腫瘍細胞からのシグナルに基づいて、修正する緑色のチャネルを選択します。[自動] をクリックしてxy補正を行います。
- 修正された画像を、3 つの連続したz-stack の最大投影として書き出します。パネル選択で、エクスポートする最初の (開始)と最後の (End) z-スライスの番号を紹介します。[最大]を選択します。Z のフォルダを個別に選択します。[Do] をクリックします。 それらのそれぞれについて、3つのz-stack、タイムラプス画像は別のフォルダにエクスポートされます。
- 必要に応じて、組織弾性変形に対して補正する。
注:組織弾性変形実験では、剛性および弾性組織変形14を補正するためにマッチモーション補正ソフトウェアプログラムが使用された。 - タイムラプスムービー内の完全なz-stack 内の単一のセルを追跡します。
注:腫瘍細胞は、例えば、ImageJプラグイン(MTrackJ)を使用して手動で追跡することができます。正確ですが、これはxy平面に限定され、非常に時間がかかります。あるいは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞セグメンテーション(例えば、イマリスソフトウェア)を使用して、全z-体積全体を通して自動的に追跡することができる。 しかし、高密度の腫瘍では、自動トラッキングの精度が低く、より多くのトラッキングエラーが発生する可能性があります。- 各タイムラプスシリーズ(3つの連続したz -stacksの場合)を個別に開いて追跡します。タイムラプスイメージを含むフォルダを ImageJ にドラッグします。
- タブプラグイン>トラッキング> MtrackJを選択します。各タイムポイントで[追加]を選択し、各セルをクリックして、個々のセルを追跡します。
- [測定]をクリックしてファイルを保存して、トラックのメジャーを抽出します。
Representative Results
生検が脳腫瘍細胞の挙動に及ぼす影響を評価するために、このプロトコルに記載の手順を実行した。グリオーマ-GL261細胞-核蛍光タンパク質(H2B-Dendra2)を発現させる細胞をC57BL/6マウスの脳に注入し、慢性CIWを移植した。腫瘍に対する生検前および生検後の損傷と同じ動物に対して、時間経過インビタルイメージングが行われた(図1A,B)。個々の腫瘍細胞の移動は、z-stack(図1C)の異なるxy平面における経時の移行経路を追跡することによって決定され、生体生殖前および生体後細胞のパーセンテージとしてプロットした(図1F)。腫瘍細胞増殖速度は、有分裂時のH2Bタグ付きDendra2凝縮に基づいて定量し(図1D)、生体前および生体後細胞の分裂の割合としてプロットした(図1E)。同じ腫瘍における生検前後の遊移速度の分布を比較したところ、介入後に渡り細胞の数(速度>4 μm/h)が増加し、遅い/非移行細胞の数が減少することがわかった(速度 < 4 μm/h) (図 2A)腫瘍当たりの平均では、生検様損傷を行った場合の渡り細胞の割合が1.75倍(SD=0.16)増加し、生検されなかった対照マウスと比較した(図2B)。我々は、別の週の腫瘍細胞の挙動を監視し、渡り腫瘍細胞の割合は最終的に対照マウスと生検マウスの両方で減少したが、生検マウスはまだ対照マウスよりも高い渡り子能力を示した((図 2C)時間の経過に伴う腫瘍細胞増殖行動の分析は、非生検対照マウスに対して、生検時の有人事象数の1.52倍の増加を示した(図2D)。
腫瘍細胞増殖および移動行動に対する生検の観察された効果がCIW置換手術(生検様損傷を行うために必要な)による人工物であったかどうかをテストするために、CIWを受けたマウス群の腫瘍細胞行動をモニタリングした。生検なしの置換。本群では、腫瘍細胞の移動または増殖の誘導は観察されず、腫瘍細胞増殖および移行速度の上昇が生検様損傷によって特異的に引き起こされたことを示した(図3A,B)。
蛍光タンパク質Dendra2の安定な光変換性は、数日間にわたって腫瘍細胞浸潤を研究することを可能にする。紫外線/青色光にさらされると、Dendra2は不可逆的に緑から赤に切り替わります。この性質を用いて、腫瘍の正方形領域を照射し、〜200 Dendra2発現腫瘍細胞を生検前にフォトマークした(図4)。生検の翌日、光切り替え領域を再局在化し、周囲の腫瘍組織に浸潤した腫瘍細胞の体積を測定した。生検様損傷後の腫瘍の浸潤領域は、非生検対照腫瘍と比較して1.72倍(SD=0.41)大きかったことがわかった(図4)。このアプローチは、単一の細胞レベルではなく、腫瘍細胞のバルク浸潤行動に関する情報のみを提供しますが、タイムラプスイメージングアプローチよりも時間がかかりにくく、排他的に焦点を当てた研究質問のための選択方法となりうる潜入行動を研究する。
図1:腫瘍細胞行動に対する生検効果の縦方向のバイタルイメージングのための実験的セットアップ。(A) リングと磁気ホルダーのデザインを示す図。(B) 実験ワークフローの概略表現。腫瘍細胞をマウスの脳に注入し、CIWを確立する。腫瘍の発症時に、最初の(生検前)タイムラプスイメージングセッションが行われる。翌日、生検およびCIW置換が実施される。イメージング(生後生検)の翌日には、2回目のタイムラプスイメージングセッションが行われる。長期的な効果のために、後続のイメージングセッションを行うことができます。(C) 画像は、GL261 H2B-Dendra2腫瘍細胞が追跡されたタイムラプスムービーの代表的なスナップショットを示す。赤い線は個々の腫瘍細胞のトラックを示す。スケールバー= 50 μm.(D) GL261 H2B-Dendra2腫瘍における分裂細胞を示す生体内タイムラプス画像の代表的。人工的な異なる段階が示されます:プロフェーズ(P)、プロメタフェイズ(Pm)、メタフェーズ(M)、アナフェーズ(A)、およびテロ相(T)。スケールバー = 50 μm. グラフは、(E)渡り子と(F)細胞を分裂する細胞の前生検とポストバイオプシーの割合を示す。各ドットは、個々の動物で測定されたすべての位置における渡り細胞のパーセンテージを示します。データは、6匹のマウスの平均±S.E.M.として示される(**P<0.01、対対t-test)。 この図は Alieva ら4.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腫瘍細胞の移動および増殖速度に対する生検の影響を示す代表的な結果。(A) 個々のマウスにおける基底移動に対する細胞速度分布の変化を示す滝プロット。データは、5匹のマウスの平均±S.E.M.として示される。(B) 対照細胞(青色)および生検(赤色)動物の数は、渡り細胞の予備介入数に正規化された(n=6マウス、***P<0.0001、学生のt-test)。 (C)腫瘍細胞の挙動を数日間にわたって追跡した。例示は、時間の経過に関する個々のマウスにおける正規化された(前介入に対する相対的な)回食細胞数(n> 4マウス/条件、***P<0.0001、双方向分散分析)。(D) 対照細胞(青色)と生検(赤色)動物の分裂細胞の正規化数。個々の動物ごとに、介入後の値は、予見前の値に正規化された(n = 5マウス、**P < 0.01、学生のt-test)。 この図は Alieva ら4.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CIW置換は腫瘍細胞の挙動に影響を及ぼさない。縦方向のバイタルイメージングは、生検なしのCIWの置換が移行および増殖速度に影響を及ぼさないことを示している。(A) 示された条件に対する渡り子細胞数の増加。すべてのシンボルは、個々のマウスの平均を表し、n ≥ 4 マウスを表します。(B) 示された条件に対する増殖細胞数の増加。すべてのシンボルは、個々のマウスの平均を表します(n ≥ 4 マウス、**P < 0.01,***P < 0.001、ns = ニューマン・ケウルスのポストホックテスト付きの一方通行の ANOVA)。この図は Alieva ら4.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Dendra2写真切り替えで得られた実験設定と代表的な結果を示す図。生検時に腫瘍細胞浸潤を監視するために、Dendra2発現腫瘍細胞は、UV/青色光照明によって正方形領域に光スイッチングされ、生検の1日前に画像化される。生検の翌日、光交換領域は再局所化され、再画像化される。腫瘍細胞浸潤の代表的なDendra2画像を示し、チャネル減算を用いて補正した。白い点線は浸透領域を表します。スケールバー = 50 μm。グラフは、生検(赤)および対照(青)マウスに対してプロットされた増加した光切り替え領域を示す。すべてのドットは、個々のマウスの平均値を表します(n ≥ 5マウス、*P < 0.05、学生のt-test)。 この図は Alieva ら4.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
ここでは、生体検などの侵襲的外科的処置に応じて、生体動物の脳における単一細胞レベルでの腫瘍細胞行動の変化を研究する方法について述べた。慢性CIWの外科的移植との縦方向多光子イメージングの組み合わせは、同じ動物4における生検前後の腫瘍細胞移動、侵入、増殖の定量を可能にする。生物発光イメージング12、MRI 10、PET/CT11などの腫瘍多日モニタリングに使用される他のアプローチと比較して、この方法は腫瘍を単一の細胞レベルで一意に可視化し、したがって、細胞行動に関する洞察を提供します。基礎となる腫瘍の進行。
このメソッドを正常に実行するには、いくつかの手順を習得する必要があります。このプロトコルの最も重要なステップは、CIWの移植と交換です。これらのステップの技術的な複雑さは着実な訓練によって得られる精密および外科技術を要求する。脳表面を覆う出血などのCIW手術中の合併症は、その後のイメージングに対して困難であることが証明される可能性がある。滅菌ツールや環境の欠如、ならびに脳表面を完全に密封する失敗は、脳表面(カバースリップの下の白い液体)に感染を引き起こす可能性があり、画像を問題にし、結果として生じる結果を強く損なう解釈。このプロトコルのもう一つの一般的な問題は、タイムラプスイメージング中の動物の動きです。実験後はxyzシフトを修正できますが、情報の損失を防ぐために、各タイムポイントの前に各位置の座標を修正することをお勧めします。組織の変形は、反転顕微鏡でイメージングする際に見られる追加の問題です。マウスをサフィンの位置に置くと、脳組織は圧迫に苦しむ。組織変形の程度に応じて、腫瘍細胞追跡は、細胞変位の誤った定量化につながる可能性がある。これを防ぐために、剛性および弾性変形のためのソフトウェアを14を使用することができる。
この手順は、腫瘍の行動の変化を研究するための広範なアプリケーションを提供していますが、特定の制限を考慮する必要があります。この方法は、科学者が(光学パラメトリック発振器を使用して)1.6ミリメートルの深さまで画像化することができます。しかし、これはイメージングが表面的な脳皮質領域15に限定されたことを意味する。したがって、脳幹領域に位置する拡散性本質的なポンチン神経膠腫を含む、深い脳構造に位置する一部の脳腫瘍は、このプロトコルを用いて本来の脳環境で研究することができない。このプロトコルのもう一つの制限は、画像化することができる腫瘍の体積である。全腫瘍体積スキャンは最大情報を得ることが望ましいが、多くの場合、腫瘍サイズおよび移動細胞の速度は因子を制限し得る。腫瘍タイプごとに、イメージングに最適なタイムラプスを考慮する必要があります。画像間の時間枠が長すぎると、腫瘍細胞を追跡することが困難な場合があります。共振スキャナの使用は、より大きな腫瘍16のイメージングを可能にする、スキャン時間を大幅に短縮することができます。最後に、このプロトコルの手動画像解析は非常に時間がかかるため、代わりに、自動化された3Dトラッキングのためのプログラムを使用することができます。しかし、自動セル追跡のアルゴリズムは、目的のセルの移行を正確に要約するように設計されることはほとんどないため、追跡の結果は常に視覚的に監視する必要があります。
ここで説明するプロトコルのわずかな適応は、より広い範囲のアプリケーションを可能にすることができます。生検を行う代わりに、部分的な腫瘍切除や化学療法ウエハの送達などの他の(外科的)介入を実施してもよい。外科的に埋め込まれたマイクロチューブを介した化合物の添加は、目的とする特定の分子を薬理学的に標的とするこのプロトコルと組み合わせてもよい。このモデルは、腫瘍細胞行動に対する特定の介入の影響を分析する研究に役立つことを期待する。同じ動物で繰り返し測定を行う可能性は、腫瘍で起こる変化に関するより正確なデータを提供するだけでなく、研究ごとに必要な実験動物の数を大幅に減らします。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、アンコ・デ・グラフとハブレヒト・イメージング・センターのイメージング・サポートと、原稿の校正と編集に対するエレン・ウェーレンスとハンナ・ジョンソンに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
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