Summary
在这里,我们描述了一种在同一活的动物内进行侵入性手术(例如活检)之前和之后对脑肿瘤细胞进行高分辨率延时多光子成像的方法。这种方法允许研究这些侵入性外科手术对肿瘤细胞在单个细胞水平的迁移、侵入性和增殖行为的影响。
Abstract
活检是癌症治疗的标准护理,在临床上是有益的,因为它们允许固体肿瘤诊断、预后和个性化治疗确定。然而,活检和其他侵入性程序对肿瘤结构的扰动与对肿瘤进展的不良影响有关,需要深入研究,以进一步提高这些程序的临床效益。传统的静态方法,只提供肿瘤的快照,在揭示活检对肿瘤细胞行为的影响,如迁移,这个过程与肿瘤恶性密切相关的能力是有限的。特别是,肿瘤细胞迁移是高攻击性脑肿瘤的关键,局部肿瘤传播使得肿瘤完全切除几乎是不可能的。多光子成像和慢性成像窗口的发展使科学家能够研究生物随时间的变化而动态的过程。在这里,我们描述了一种在同一活动物进行活检前后对脑肿瘤细胞进行高分辨率纵向成像的方法。这种方法使得研究这个程序对肿瘤细胞行为(迁移、入侵和增殖)的影响成为可能。此外,我们讨论了这项技术的优点和局限性,以及这种方法研究其他外科手术(包括肿瘤切除或化疗植入)的癌细胞行为变化的能力晶 圆。
Introduction
大多数实体肿瘤的护理标准包括用于诊断、预后和个性化治疗测定的组织活检 1、2 。总体而言,这些程序给临床带来益处,但最近证据表明,活检和其他更具侵入性的程序,如肿瘤切除,也可以对肿瘤进展3,4,5产生负面影响,6.虽然这些程序仍然是不可或缺的住院护理,其益处克服了其负面影响,但必须充分了解这些负面影响背后的机制,以便最大限度地保障患者的安全和这些程序的积极影响,使它们在临床上更有益。
活检介导对肿瘤进展的不良影响是由肿瘤微环境的系统性改变和变化引起的,以响应组织破坏4,5。因此,有必要在活体动物中研究这一过程。然而,这些微创程序的微妙后果往往可以掩盖个体之间的巨大差异。基于免疫组织化学或转录表达分析的传统方法可能会忽视这些影响,或者需要大量的动物来识别它们。此外,这些静态方法缺乏识别肿瘤细胞行为变化的能力,如迁移和入侵,与肿瘤恶性肿瘤相关的动态过程。这些肿瘤细胞特征对于高攻击性脑肿瘤特别重要,如胶质细胞瘤多毛细胞(GBM),肿瘤细胞的局部扩散限制了手术切除,降低了患者存活率7。为了充分理解活检如何影响GBM细胞的行为,需要一种纵向方法,允许这些细胞在生物体的生理环境中可视化。
最近,高分辨率生命内成像与手术植入的慢性成像窗口相结合,使科学家能够研究活小鼠在8日、9日多日的肿瘤细胞的动态行为。使用这种强大的方法,我们可以研究肿瘤细胞的增殖、迁移和渗透行为如何在几天内变化,以响应同一小鼠的活检。与其他允许对活小鼠肿瘤进行多日监测的技术相比,如磁共振成像 (MRI)10、正电子发射断层扫描/计算机断层扫描 (PET/CT)11或生物发光成像12,这方法独特的提供了研究肿瘤细胞行为在单细胞水平和解开肿瘤内部发生的细微变化的可能性。
在这里,我们描述了一种详细的方法,在肿瘤小鼠的大脑中执行活检样损伤和活检前和术后纵向生命内成像。该方法可能应用于研究其他外科手术,如部分肿瘤切除或化疗晶圆的植入。
Protocol
所有实验均按照荷兰皇家艺术和科学学院动物福利委员会的指导方针进行。本手稿中使用的实验协议得到了中央委员会(CCD)和实例蒂·迪尔维尔齐恩(IvD)的批准。
1. 肿瘤细胞植入和颅内成像窗口制备
- 手术准备
- 使用任何菌株或性别的成年小鼠(>6 周大)。在无菌水中以1:1:2的剂量注射(氟尼松[神经素]+芬太尼[阿片类])(0.4 mL/kg)+苯并二氮杂卓镇静剂(2毫克/千克)。通过脚趾捏评估动物的镇颤状态。
注:在本协议中,由于这些实验中使用的肿瘤细胞系的遗传背景相同(GL261),因此使用了雌性和雄性C57BL/6小鼠。小鼠将完全镇静1.5小时。或者,使用吸入麻醉,如非氟(1.5%~2%的黄豆胶/O2混合物)。 - 将鼠标安装在立体定向框架上,并使用鼻夹和两个耳杆固定头部。
- 使用加热灯保持体温。加热灯应谨慎使用,也可以使用水循环加热垫。
- 应用眼膏保护小鼠角膜不干燥。
- 使用锋利的剪刀来剪下头骨上的毛皮(从老鼠眼睛到头骨底部的背区域),用70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。
- 用锋利的剪刀以圆形的方式切割皮肤,用棉签刮掉下面的骨皮。在 5 分钟内涂抹一滴利多卡因 1% + 肾上腺素 1:100,000,用棉签去除多余的。
- 用氰丙烯酸酯胶水将皮肤边缘粘到头骨上。
- 将立体定向帧置于具有 4 倍放大倍率的解剖立体显微镜下。
- 通过解剖显微镜可视化头骨,并在右骨上钻出直径为 5 mm 的圆形凹槽。小心地执行此步骤,只是肤浅地执行此步骤,避免对头骨施加任何压力。
- 应用一滴皮层缓冲液(125 mM NaCl,5 mM KCl,10 mM 葡萄糖,10 mM HEPES 缓冲液,2 mM MgSO4和 2 mM CaCl2 [pH 7.4]),并使用细钳提起骨瓣。
- 对于以下步骤,除非另有说明,否则保持大脑表面覆盖皮层缓冲液。
- 在解剖显微镜下,可视化大脑表面,并使用弯曲的、锥形的、非常精细的点钳去除杜拉母体。如果在此阶段出现出血,请使用可吸收的明胶海绵将其停止。
- 使用任何菌株或性别的成年小鼠(>6 周大)。在无菌水中以1:1:2的剂量注射(氟尼松[神经素]+芬太尼[阿片类])(0.4 mL/kg)+苯并二氮杂卓镇静剂(2毫克/千克)。通过脚趾捏评估动物的镇颤状态。
- 肿瘤细胞注射
- 在PBS的±3μL中重新悬浮所需的荧光肿瘤细胞(例如,对于本方案所示的实验,注射了1 x 105 GL261细胞)。
注:虽然可以使用任何荧光标记,但强烈建议在分析过程中跟踪单个肿瘤细胞。此外,与组蛋白相关的荧光标记,如H2B,可用于可视化染色体凝结,从而监测细胞分裂。使用照片可切换标记,如Dendra2,允许在几天4,13对肿瘤细胞进行照片标记和跟踪。 - 用点型2针将肿瘤细胞装入10μL气密注射器中,并将其固定在立体机械手手臂上。
- 取出皮层缓冲液。将注射器的尖端放在颅骨切除术的中间,并将其插入离头骨表面 0.5 mm 的深度。或者,在大脑中创建一个小空间,以适应肿瘤细胞悬浮。为此,将注射器插入至 1 mm 的深度,然后在注射前将其取回至 0.5 mm。
- 应用一滴皮层缓冲液。
- 使用微注射器泵喷油器(250~400 nL/min)缓慢注入细胞悬架。取出注射器,必要时使用可吸收的明胶海绵止血。
- 在PBS的±3μL中重新悬浮所需的荧光肿瘤细胞(例如,对于本方案所示的实验,注射了1 x 105 GL261细胞)。
- 颅内成像窗口准备
- 取出皮层缓冲液,在颅骨切除部位放置一滴硅油,以避免窗户下的气泡。
- 用 6 毫米盖玻片密封暴露的大脑。在盖玻片和头骨之间涂抹氰丙烯酸酯胶水。在细钳的帮助下,轻轻地将盖玻片压在头骨上,以确保大脑和盖玻片之间的距离最小。
- 在头骨表面涂上牙科丙烯酸水泥,覆盖盖玻片的边缘。在颅骨周围放置一个薄的不锈钢环(外径1.5毫米,内径1毫米),让牙科水泥干燥。或者,在边框上添加一些胶水,以确保头部顶部的环。
注:此头部固定系统最适合在倒置显微镜上成像:嵌入在成像盒中的小磁铁有助于颅内成像窗口 (CIW) 固定。在该协议所示的实验中,使用了倒置显微镜。对于直立显微镜,可以通过带凹槽的杆或带凹槽的环实现固定,这些凹槽可以通过螺钉或适合环的板连接到显微镜上。 - 对于疼痛管理,注射单剂量为100微克/千克丁丙诺啡皮下,让动物在加热垫上恢复。
- 将鼠标放入单独的笼子里,用切碎的纸张进行浓缩。在最初几天和之后每周2次密切监视鼠标的正常行为、反应性和外观。
2. 生命内成像
注:肿瘤细胞注射和第一次生命内成像期之间的时间间隔取决于所使用的肿瘤细胞系的类型。对于该协议所示的实验,10 105 GL261细胞在10天后被注射并成像。
- 成像准备
- 通过面罩(1.5%~2%的胶质/O2混合物)使用非法兰吸入麻醉麻醉小鼠。
- 下皮注入小鼠100 μL的盐水缓冲液,以防止脱水。
注:对于长期成像,小鼠可以通过皮下输液泵进行水合。 - 将鼠标正面朝上放在成像框中。使用直径为 1 mm 的金属板和嵌在孔径周围的小磁铁,将 CIW 固定在成像盒上。通过面罩引入电子芦,并通过盒子另一侧的插座(0.8%~1.5%的外卢兰/O2混合物)通风。或者,使用磁带修复鼠标主体。
注:此时可静脉注射荧光标记的dextran,用于血管可视化或其他染料。 - 或者,使用脉冲血氧仪和加热探头来监测小鼠的维有性。
注:在本实验中,由于小鼠在整个成像周期(2~3 小时)中保持稳定,因此无需使用脉冲血氧仪和加热探头。但是,对于较长的成像时间,可能需要更彻底的监控。 - 将 25 倍(例如 HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm)水目标设置为最低z位置,并添加大量水。
注:对于长期实验,强烈建议使用浸入式微型分配器,因为它允许科学家在实验过程中加水。或者,可以使用干燥目标。 - 将成像盒转移到装有37°C黑暗气候室的显微镜上。将目标带到 CIW 盖玻片上,直到水滴碰到它。
- 使用荧光模式,通过目镜观察肿瘤,使细胞进入焦点。
- 延时图像采集
- 选择要成像的多个感兴趣位置,并在软件中记录其坐标。确保所选位置是来自肿瘤不同部位的代表性位置(每个肿瘤可能不同,但为了确保一致性,请选择相同数量的位置,这些位置是肿瘤核心和所有小鼠边缘的核心位置)。
注:可对肿瘤的一部分或整个可见肿瘤进行瓷砖扫描;然而,如果肿瘤很大,这种方法将增加图像之间的延时。此外,如果肿瘤细胞快速移动,随着时间的推移跟踪相同的细胞可能具有挑战性。 - 切换到多光子模式,并将激光调谐到正确的波长。请注意,为了避免光损伤,需要更高的波长。
注:对于 Dendra2 成像,使用了 960 nm 波长。在这些实验中使用的目标,1.3的变焦足以获得肿瘤核的良好分辨率,并扫描肿瘤的代表性区域。 - 进入活动模式,为每个位置定义一个z-stack,以获得肿瘤细胞的最大体积,而不影响肿瘤细胞的分辨率。将图像之间的步长大小定义为 3 μm。
- 使用双向模式提高扫描速度。图像分辨率应至少为 512 x 512 像素。
- 每20分钟获取不同位置的肿瘤体积图像,每次采集2小时。每次采集图像前向目标加水。
注:通过在软件中设置正确的延时时间,可以自动获取延时图像。但是,鼠标可以移动,位置或z堆栈可能会随时间变化,从而导致数据丢失。因此,建议手动执行延时,并检查和调整收购之间的xyz偏移。 - 在此步骤中,可以选择使用照片切换 Dendra2 荧光标记。
注:与延时成像(允许研究单个肿瘤细胞的特性及其如何随时间变化),这将允许研究肿瘤细胞渗透在大脑的区域在几天内4。格利戈里耶维奇等人对这一步骤作了详细的解释。 - 获取最后一张图像后,将鼠标从舞台上移除,使其在加热垫上恢复。为了防止脱水,100 μL的盐水可以分皮。将鼠标放在笼子中,直到进行活检伤害。
- 选择要成像的多个感兴趣位置,并在软件中记录其坐标。确保所选位置是来自肿瘤不同部位的代表性位置(每个肿瘤可能不同,但为了确保一致性,请选择相同数量的位置,这些位置是肿瘤核心和所有小鼠边缘的核心位置)。
3. 类似活检的伤害和CIW更换
- 在第一次成像后1天,在肿瘤部位创建类似活检的损伤。
注:或者,也可以执行另一个程序,如部分肿瘤切除。- 如步骤 2.1.1 所述,使用非二苯吸入麻醉小鼠。
注:虽然可以使用注射麻醉,但此过程比 CIW 植入短,吸入麻醉可以精确控制和减少小鼠静镇时间。 - 将鼠标放在立体框架上,用两个耳条和鼻夹固定其头部。由于缺乏踏板反射,检查麻醉深度。使用麻醉面罩进行立体手术,使小鼠在手术过程中保持镇静。
- 将棉签浸泡在丙酮中,将其铺在盖玻片的边缘,以软化将盖玻片固定在大脑上的胶水。
- 将薄点钳滑到盖玻片下方以将其提起。如果此时盖玻片断裂,请使用钳子取出玻璃片。
- 应用皮层缓冲液,保持大脑湿润。
- 将25G的针头浸入肿瘤深度为1毫米,必要时应用明胶无菌海绵,取出针头并停止出血。
注:此步骤可在荧光立体显微镜下执行,以更准确地识别肿瘤区域(如果肿瘤太小)。此外,在穿刺过程中,可注射荧光聚苯乙烯1μm珠子的1μL溶液,以识别活检区域。 - 用硅油密封大脑表面,并在顶部粘上6毫米的盖玻片。
- 如步骤 2.1.1 所述,使用非二苯吸入麻醉小鼠。
4. 重复成像
- 在造成活检一样的损伤一天后(如果需要,在连续几天)后,重复生命内成像,如上文第 2 步所述,以评估肿瘤细胞行为如何随时间而变化。选择代表整个肿瘤区域的肿瘤的几个位置。
注:如果使用荧光珠来识别活检区域,则与非活检区域相比,将荧光珠子定位为在活检区域中成像肿瘤细胞行为。
5. 图像分析
- 如果手动获取延时图像,则将它们合并到一个文件夹中。
- 在与显微镜(例如,LasX 或 LAS 自动对焦)相关的商业软件中打开延时 LIF 文件。选择"流程>流程工具>合并"选项卡。选择时间序列的第一个图像,然后单击"第一个"。选择时间序列的第二个图像,然后单击"第二个"。在"合并维度"中,选择t表示时间。单击"应用"。将生成具有两个时间点的新文件。对所有时间点重复此过程,使用新生成的文件作为序列的第一个图像。
- 更正任何xyz移位时获取的z堆栈。
注:对于该协议中描述的实验,使用自定义设计的 Visual Basic 软件程序进行更正。或者,可以使用其他可用的软件,如 ImageJ 或 Imaris。- 通过右键单击合并的延时文件从软件导出 TIFF 文件。选择"保存原始数据"。导出的文件将导出到根据通道、时间和z位置命名的一个文件夹。
- 在自定义设计的可视化基本软件程序中打开 TIFF 文件。
- 定义时间点、z 堆栈和通道的数量。
- 按外观顺序为每个通道分配颜色。
- 在"窗体显示"面板中,每个时间点通过单击向上 (U) 或向下 (D) 按钮来更正z中的偏移。
- 在"生命内部图像构建"面板中,选择要用于校正xy偏移的通道。根据来自肿瘤细胞的信号选择要纠正的绿色通道。单击"自动"进行xy校正。
- 导出更正后的图像,作为三个连续z堆栈的最大投影。在"选择"面板中,引入要导出的第一个 (开始)和最后一个 (结束) z切片的编号。选择"最大值"。为 Z 选择单独的文件夹。单击"执行"。对于每个 z 堆栈,将导出到单独的文件夹的延时图像。
- 或者,纠正组织弹性变形。
注:对于组织弹性变形实验,使用匹配运动补偿软件程序对刚性和弹性组织变形进行校正14。 - 在延时影片中跟踪完整z堆栈中的单个单元格。
注:可以使用ImageJ插件(MTrackJ)等手动跟踪肿瘤细胞。虽然准确,这是限于xy平面,是非常耗时的。或者,肿瘤细胞可以在整个z体积中自动跟踪,使用肿瘤细胞分割(例如,Imaris软件)。然而,在高致密的肿瘤中,自动跟踪不太准确,并可能导致更多的跟踪错误。- 分别打开和跟踪每个延时序列(连续三个z堆栈)。将包含延时图像的文件夹拖动到 ImageJ。
- 选择选项卡插件>跟踪> MtrackJ.通过选择每个时间点的"添加"和"单击每个单元格"来跟踪每个单独的单元格。
- 通过单击"测量"并保存文件来提取轨道的度量。
Representative Results
为了评估活检对脑肿瘤细胞行为的影响,我们执行了本协议中描述的程序。胶质瘤-GL261细胞——表达核荧光蛋白(H2B-Dendra2)被注射到C57BL/6小鼠的大脑中,并植入了慢性CIW。对同一动物进行术后生命内成像,对肿瘤进行活检前和术后损伤(图1A,B)。单个肿瘤细胞的迁移是通过跟踪z-stack的不同xy平面随时间推移的迁移路径(图1C)确定的,并绘制为活检前和术后迁移细胞的百分比(图1F)。 肿瘤细胞增殖率根据H2B标记的Dendra2在线粒体化时的凝结(图1D)进行量化,并绘制成在益生前和术后分裂细胞的百分比(图1E)。我们比较了同一肿瘤活检前后迁移速度的分布,发现干预后迁移细胞(速度 > 4 μm/h)增加,慢/非迁移细胞数量相关减少(速度 < 4 μm/h ) (图 2A)与未进行活检的对照小鼠相比,我们观察到,在进行活检损伤时,迁移细胞的百分比增加了1.75(SD = 0.16),比未进行活检的对照小鼠增加1.75倍(SD = 0.16)。我们又对肿瘤细胞行为进行了一周的监测,发现尽管对照小鼠和活检小鼠中迁移性肿瘤细胞的百分比最终都有所下降,但活检小鼠的迁移能力仍然高于对照小鼠(图 2C.对肿瘤细胞增殖行为的分析表明,与非活检对照小鼠相比,活检时的线粒事件数量增加了1.52(SD = 0.26)-倍(图2D)。
为了测试活检对肿瘤细胞增殖和迁移行为的观察效果是否是CIW置换手术(需要执行活检损伤)的工件,我们监测了一组接受CIW的小鼠的肿瘤细胞行为更换没有活检。在这个组中,我们未观察到肿瘤细胞的迁移或增殖的任何诱导,这表明肿瘤细胞增殖和迁移率的提升是由活检样损伤引起的(图3A,B)。
荧光蛋白Dendra2稳定的光转换性允许研究肿瘤细胞渗透数天。在紫外线/蓝光照射下,Dendra2 从绿色到红色不可逆转地切换。利用这个特性,肿瘤的一个方形区域被照亮,在活检前对200个Dendra2表达的肿瘤细胞进行照片标记(图4)。活检后的一天,我们重新对光切换区域进行了调整,并测量了渗入周围肿瘤组织的肿瘤细胞的体积。我们发现,在活检损伤后,肿瘤的渗透面积比非生物样控制肿瘤大1.72(SD = 0.41),与非生物病对照肿瘤相比(图4)。虽然这种方法只提供有关肿瘤细胞大量渗透行为的信息,而不是单个细胞级别,但它比延时成像方法更耗时,并且可能是专门研究问题的首选方法。研究渗透行为。
图1:活检对肿瘤细胞行为的纵向生命内成像的实验设置。(A) 显示环和磁架设计的图表.(B) 实验工作流程的原理表。肿瘤细胞被注射到小鼠的大脑中,并建立了CIW。肿瘤发育后,进行第一次(预生检)延时成像过程。第二天,实施活检和CIW置换。成像后的第二天(术后)执行第二次延时成像会话。对于长期影响,可以进行后续成像会话。(C) 图像显示了一个延时电影的代表性快照,其中GL261 H2B-Dendra2肿瘤细胞被跟踪。红线描绘了单个肿瘤细胞轨迹。刻度条 = 50 μm. (D) 在体内延时图像中显示 GL261 H2B-Dendra2 肿瘤中的分裂细胞。表示线粒体的不同阶段:前相(P)、临孕相(Pm)、元相(M)、Aa相(A)和端相(T)。比例尺 = 50 μm. 图表指示 (E) 移位和 (F) 分裂细胞在预和后生菌的百分比.每个点表示迁徙细胞在单个动物中测量的所有位置中的百分比。数据显示为六只小鼠的平均值 = S.E.M.(*P < 0.01,成对t-test)。这个数字已由阿利耶娃等人4.请点击此处查看此图的较大版本。
图2:显示活检对肿瘤细胞迁移和增殖率影响的代表性结果。(A) 瀑布图显示细胞速度分布相对于单个小鼠的基础迁移的变化。数据显示为五只小鼠的平均值和S.E.M.。(B) 控制中的迁移细胞(蓝色)和活检(红色)动物的数量标准化为候先干预的迁移细胞数量(n = 6只小鼠,=P <0.0001,学生t-测试)。 (C) 肿瘤细胞行为被跟踪了几天.图中所示是一段时间内单个小鼠的迁移细胞的标准化(相对于干预前)数量(每个条件为4只小鼠,=P <0.0001,双向方差分析)。(D) 控制(蓝色)和活检(红色)动物的分裂细胞的标准化数量。每只动物,干预后的值被归化为干预前的值(n = 5个小鼠,=P <0.01,学生t-测试)。 这个数字已由阿利耶娃等人4.请点击此处查看此图的较大版本。
图3:CIW置换对肿瘤细胞行为无影响。纵向生命内成像表明,在没有活检的情况下更换CIW对迁移和增殖率没有影响。(A) 为所述条件增加的迁移细胞数量增加.每个符号表示单个鼠标和n= 4 个鼠标的平均值。(B) 在所述条件下增殖细胞数目的增加。每个符号表示单个鼠标的平均值(n= 4 个鼠标,=P < 0.01, =P < 0.001,ns = 非显著单向 ANOVA,具有纽曼-基尔斯后临时测试)。这个数字已由阿利耶娃等人4.请点击此处查看此图的较大版本。
图4:图显示了使用Dendra2光切换获得的实验设置和代表性结果。为了监测活检时的肿瘤细胞渗透,Dendra2表达的肿瘤细胞在活检前1天通过紫外线/蓝光照明和图像在方形区域进行光切换。活检后的一天,照片切换区域被重新本地化和重新成像。所示为具有代表性的Dendra2肿瘤细胞渗透图像,使用通道减法进行校正。白色虚线表示渗透区域。刻度柱 = 50 μm。该图显示了为活检(红色)和控制(蓝色)小鼠绘制的增加的光切换区域。每个点表示单个鼠标的平均值(n =5 个鼠标,=P < 0.05,学生 t-test)。 这个数字已由阿利耶娃等人4.请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
在这里,我们描述了一种方法,研究在单个细胞水平的肿瘤细胞行为的变化,以响应侵入性外科手术,如活检,在活的动物的大脑。纵向多光子成像与慢性CIW的外科植入相结合,使肿瘤细胞迁移、入侵和增殖在活检前后的定量化。与用于肿瘤多日监测的其他方法(如生物发光成像 12、MRI10或 PET/CT11)相比,此方法在单个细胞水平上独特地可视化肿瘤,从而提供细胞行为的洞察潜在的肿瘤进展。
要成功执行此方法,应掌握多个过程。该协议最关键的步骤是 CIW 植入和替换。这些步骤的技术复杂性要求精度和外科技能,可以通过稳定的培训获得。CIW 手术期间的并发症,如可能覆盖大脑表面的出血,可能证明对后续成像具有挑战性。缺乏无菌工具或环境,以及不能完全密封大脑表面,可能导致大脑表面感染(盖玻片下的白色液体),这将使成像出现问题,并严重危及由此产生的解释。该协议的另一个常见问题是延时成像过程中的动物运动。虽然任何xyz偏移都可以在实验后进行校正,但建议在每个时间点之前更正每个位置的坐标,以防止任何信息丢失。在倒置显微镜上成像时,组织变形是发现的另一个问题。当小鼠被置于苏普因位置时,脑组织会受到压缩。根据组织变形的程度,肿瘤细胞跟踪可能导致细胞位移的错误定量。为了防止这种情况,可以使用用于刚性和弹性变形的软件14。
虽然这个程序为研究肿瘤行为的变化提供了广泛的应用,但应考虑某些限制。这种方法允许科学家成像到1.6毫米的深度(使用光学参数振荡器);然而,这意味着成像仅限于表面大脑皮层区域15。因此,一些位于深层脑结构的脑肿瘤,包括位于脑干区的漫射性固有胶质瘤,不能用此方案在它们的原始大脑环境中进行研究。该协议的另一个限制是可以成像的肿瘤的体积。虽然需要肿瘤总体积扫描才能获得最大的信息,但通常,肿瘤的大小和迁移细胞的速度是限制因素。对于每种肿瘤类型,必须考虑成像的最佳延时时间。如果图像之间的时间范围太长,可能很难跟踪肿瘤细胞。使用谐振扫描仪可以大大减少扫描时间,使更大的肿瘤成像16。最后,该协议的手动图像分析可能非常耗时,因此可以使用自动 3D 跟踪程序。但是,跟踪的结果应始终受到视觉监督,因为自动细胞跟踪的算法很少设计为准确概括感兴趣的细胞的迁移。
稍微调整此处描述的协议可以支持更广泛的应用。可以实施其他(外科)干预,如部分肿瘤切除或化疗晶圆的提供,而不是进行活检。通过手术植入的微管添加化合物可与该协议结合使用,以药理学方式瞄准感兴趣的特定分子。我们期望该模型在旨在分析某种干预对肿瘤细胞行为的影响的研究中非常有用。在同一动物中重复测量的可能性不仅提供了更准确的肿瘤变化数据,而且大大减少了每次研究所需的实验动物数量。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢安科·德格拉夫和胡布雷希特成像中心对影像的支持,并感谢埃伦·韦伦斯和汉娜·约翰逊对手稿进行校对和编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
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