Summary
여기에서 우리는 동일한 살아있는 동물 내의 침습적 외과 적 개입 (예를 들어, 생검) 전후 뇌 종양 세포의 고해상도 시간 경과 다광자 이미징을위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 종양 세포의 철새, 침략적 인 행동에 대한 이러한 침습적 인 외과 적 절차의 영향을 단일 세포 수준에서 연구 할 수 있습니다.
Abstract
생검은 암 치료를 위한 배려의 표준이고 고체 종양 진단, 예후 및 개인화한 처리 결정을 허용하기 때문에 임상으로 유익합니다. 그러나, 생검 및 그밖 침략적인 절차에 의하여 종양 건축의 교란은 종양 진행에 바람직하지 않은 효력과 연관되었습니다, 이는 이 절차의 임상 이득을 더 향상시키기 위하여 깊이 공부될 필요가 있습니다. 종양의 스냅샷만제공하는 기존의 정적 접근법은 종양 악성종양과 밀접한 관련이 있는 과정인 이동과 같은 종양 세포 행동에 대한 생검의 영향을 밝히는 능력이 제한적입니다. 특히, 종양 세포 이동은 국소 종양 보급이 총 종양 절제술을 사실상 불가능하게 만드는 매우 공격적인 뇌종양의 핵심입니다. 다광자 이미징 및 만성 이미징 창의 발달을 통해 과학자들은 시간이 지남에 따라 살아있는 동물의 동적 과정을 연구 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 동일 살아있는 동물에 있는 생검 전후뇌종양 세포의 고해상도 세로 화상 진찰을 위한 방법을 기술합니다. 이 접근은 종양 세포 행동 (이동, 침략 및 증식)에 이 절차의 충격을 공부하는 것을 가능하게 합니다. 또한, 우리는 이 기술의 장점과 한계뿐만 아니라 종양 절제술 또는 화학 요법의 이식을 포함한 다른 외과 적 개입을위한 암 세포 행동의 변화를 연구하는이 방법론의 능력에 대해 논의합니다. 웨이퍼.
Introduction
대부분의 고형 종양에 대한 치료 표준은 진단, 예후 및 개인화 된치료 결정 1,2에대한 조직 생검을 포함한다. 전반적으로, 이러한 절차는 임상 적 이익을 제공하지만, 최근의 증거는 생검 및 종양 절제술과 같은 다른 더 침습적 인 절차가 종양 진행에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다3,4,5 , 6. 이러한 절차는 필수 환자 치료 남아 있고 그 혜택은 부정적인 영향을 극복하는 동안, 완전히 환자의 안전과 환자의 안전과 최대화하기 위해 이러한 부정적인 영향 뒤에 메커니즘을 이해하는 것이 필요하다 이러한 절차의 긍정적 인 영향과 그들을 더욱 임상적으로 유익하게.
종양 진행에 대한 생검 매개 원치 않는 효과는 조직 중단에 대한 응답으로 종양 미세환경의 전신 변경 및 변화에 의해 유발됩니다 4,5. 따라서 살아있는 동물에서이 과정을 연구 할 필요가 있습니다. 그러나, 이러한 최소 침습 절차의 미묘한 결과 종종 개인 사이 큰 변화에 의해 위장 될 수 있습니다. 면역운동화학 또는 전사발현 분석에 기초한 통상적인 방법은 이러한 효과를 간과하거나 이를 식별하기 위해 많은 수의 동물을 필요로 할 수 있다. 더욱이, 이러한 정적 접근법은 종양 악성종양과 상관관계가 있는 이동 및 침입, 동적 과정과 같은 종양 세포 행동의 변화를 식별하는 능력이 부족하다. 이러한 종양 세포 특징은 교모세포종 다형체(GBM)와 같은 매우 공격적인 뇌종양에 특히 중요하며, 여기서 종양 세포의국부적 확산은 외과적 절제술을 제한하고 환자의 생존을 감소시인7. 생검이 GBM 세포의 행동에 어떻게 영향을 미치는지 완전히 이해하려면 살아있는 유기체의 생리적 맥락에서 이러한 세포를 시각화 할 수있는 세로 접근 이 필요합니다.
최근에는 외과적으로 이식된 만성 이미징 창과 결합하여 고해상도 인트라바이탈 이미징이 개발되어 과학자들이 살아있는쥐에서 종양 세포의 동적 행동을 여러 날 8,9일에걸쳐 연구할 수 있게 되었다. 이 강력한 접근을 사용하여, 우리는 종양 세포의 증식, 철새 및 잠윤행동이 동일 마우스에 있는 생검에 응하여 며칠에 걸쳐 어떻게 변경되는지 연구할 수 있습니다. 자기 공명 영상 (MRI)10,양전자 방출 단층 촬영 /컴퓨터 단층 촬영 (PET / CT)11,또는 생물 발광 이미징12와같은 살아있는 마우스에서 종양의 수일 모니터링을 허용하는 다른 기술과 비교하여, 이것은 접근은 단 하나 세포 수준에 종양 세포 행동을 공부하고 종양 내의 일어나는 미묘한 변경을 해명하는 가능성을 유일하게 제안합니다.
여기에서, 우리는 종양 을 지탱하는 마우스의 두뇌에 있는 생검 같이 상해 및 pre-biopsy 경적 경적 내 활력 화상 진찰을 능력을 발휘하는 상세한 방법을 기술합니다. 이 방법은 잠재적으로 부분 종양 절제술 또는 화학 요법 웨이퍼의 이식과 같은 다른 외과 적 개입을 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다.
Protocol
모든 실험은 네덜란드 왕립 예술 과학 아카데미의 동물 복지 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 원고에 사용된 실험 프로토콜은 중앙 공소사 Dierproeven (CCD)와 인스턴트 보어 디렌웰지엔 (IvD)에 의해 승인되었다.
1. 종양 세포 이식 및 두개골 화상 진찰 창 준비
- 외과 준비
- 어떤 균주 또는 성별의 성인 마우스 (>6 주)를 사용하십시오. (플루아니손 [신경이완제]+ 펜타닐 [오피오이드]) (0.4 mL/kg) + 벤조디아제핀 진정제(2 mg/kg)를 멸균수에서 1:1:2의 용량으로 주입하여 마우스를 진정시. 발가락 핀치로 동물의 진정 상태를 평가합니다.
참고: 본 프로토콜에서, 암컷 및 남성 C57BL/6 마우스는 이들 실험에 사용된 종양 세포주의 동일한 유전적 배경(GL261)으로 인해 사용되었다. 마우스는 완전히 진정 유지 됩니다 1.5 시간. 대안으로, 이소플루란 등 흡입 마 취 를 사용 하 여 (1.5%-2% 이소플루란/O2 혼합물). - 마우스를 입체 프레임에 장착하고 노즈 클램프와 두 개의 이어 바를 사용하여 머리를 고정합니다.
- 체온을 보존하기 위해 가열 램프를 사용합니다. 가열 램프는 주의해서 사용되어야하며, 또는 물 재순환 가열 패드를 사용할 수 있습니다.
- 눈 연고를 적용하여 마우스의 각막이 건조되지 않도록 하십시오.
- 날카로운 가위를 사용하여 두개골의 털을 면도하고 (마우스의 눈에서 두개골 의 기저부까지 등쪽 영역)을 면도하고 노출된 피부를 70 % 에탄올로 소독하십시오.
- 날카로운 가위로 피부를 원형으로 자르고 면봉으로 아래 골막을 긁어냅니다. 리도카인 1% + 에피네프린 1:100,000을 5분 동안 바르고 면봉으로 과량분을 제거합니다.
- 치아노아크릴레이트 접착제로 피부 가장자리를 두개골에 붙입니다.
- 4배 배율의 해골 스테레오 현미경 아래에 입체 프레임을 놓습니다.
- 해부 현미경을 통해 두개골을 시각화하고 오른쪽 정수리 뼈 위에 직경 5mm의 원형 홈을 드릴. 두개골에 대한 압력을 피하면서 이 단계를 신중하고 피상적으로만 수행하십시오.
- 피질 완충액 (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM 포도당, 10 mM HEPES 버퍼, 2 mM MgSO4및 2 mM CaCl2 [pH 7.4])를 한 방울을 적용하고 얇은 집게를 사용하여 뼈 플랩을 들어 올립니다.
- 다음 단계의 경우, 달리 명시되지 않는 한 뇌 표면을 피질 버퍼로 덮습니다.
- 해부 현미경의 밑에, 두뇌 표면을 구상하고 곡면, 테이퍼, 아주 미세한 점 핀셋을 사용하여 dura mater를 제거합니다. 이 단계에서 출혈이 발생하면 흡수성 젤라틴 스폰지를 사용하여 출혈을 멈추십시오.
- 어떤 균주 또는 성별의 성인 마우스 (>6 주)를 사용하십시오. (플루아니손 [신경이완제]+ 펜타닐 [오피오이드]) (0.4 mL/kg) + 벤조디아제핀 진정제(2 mg/kg)를 멸균수에서 1:1:2의 용량으로 주입하여 마우스를 진정시. 발가락 핀치로 동물의 진정 상태를 평가합니다.
- 종양 세포 주입
- PBS의 ~3 μL에서 원하는 형광 종양 세포의 양을 재중단하였다(예를 들어, 본 프로토콜에 도시된 실험에 대해, 1 x 105 GL261 세포를 주입하였다).
참고: 어떤 형광 마커든지 사용될 수 있는 동안, 핵 마커는 분석 도중 개별 적인 종양 세포를 추적하기 위하여 강하게 조언됩니다. 추가적으로, H2B와 같은 히스톤 연결형광마커는, 염색체 응축을 구상하고, 그러므로, 세포 분열을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다. Dendra2와 같은 사진 전환 마커를 사용하면 며칠동안종양 세포의 사진 표시 및 추적이 가능합니다 4,13. - 포인트 스타일 2 바늘로 10 μL 가스 꽉 주사기에 종양 세포를로드하고 스테레오 택시 조작기 팔에 고정.
- 피질 버퍼를 제거합니다. 주사기의 끝을 개두술 중간에 놓고 두개골 표면에서 0.5 mm 깊이로 삽입하십시오. 선택적으로, 종양 세포 현탁액을 수용하기 위해 뇌에 작은 공간을 생성한다. 이를 위해 주사기를 최대 1mm 깊이까지 삽입한 다음 주입 전에 최대 0.5mm까지 회수합니다.
- 피질 버퍼 한 방울을 적용합니다.
- 마이크로 시링기 펌프 인젝터 (250-400 nL / min)를 사용하여 셀 현탁액을 천천히 주입하십시오. 주사기를 제거하고 흡수성 젤라틴 스폰지를 사용하여 필요한 경우 출혈을 막습니다.
- PBS의 ~3 μL에서 원하는 형광 종양 세포의 양을 재중단하였다(예를 들어, 본 프로토콜에 도시된 실험에 대해, 1 x 105 GL261 세포를 주입하였다).
- 두개골 이미징 창 준비
- 피질 버퍼를 제거하고 창 아래기 기포를 피하기 위해 개두량 부위에 실리콘 오일 한 방울을 놓습니다.
- 노출된 뇌를 6mm 커버슬립으로 밀봉합니다. 커버 슬립과 두개골 사이에 시아노아크릴레이트 접착제를 바하십시오. 미세 핀셋의 도움으로 두개골에 덮개슬립을 부드럽게 눌러 뇌와 커버슬립 사이의 거리를 최소화합니다.
- 커버 슬립의 가장자리를 덮고, 두개골의 표면에 치과 아크릴 시멘트를 적용합니다. 얇은 스테인레스 스틸 링 (외부 직경 1.5 mm, 내경 1mm)을 개두량 주위에 놓고 치과 시멘트가 건조되도록하십시오. 선택적으로, 머리의 상단에 링을 고정하기 위해 테두리에 약간의 접착제를 추가합니다.
참고 : 이 헤드 고정 시스템은 반전 된 현미경의 이미징에 최적입니다 : 이미징 상자에 내장 된 작은 자석은 두개골 이미징 창 (CIW) 고정을 용이하게합니다. 이 프로토콜에 표시된 실험에서, 반전된 현미경이 사용되었다. 직립 현미경의 경우 나사 또는 링에 맞는 플레이트를 사용하여 현미경에 부착 할 수있는 홈이있는 막대 또는 링을 사용하여 고정을 달성 할 수 있습니다. - 통증 관리를 위해, 피하 적으로 100 μg / kg buprenorphine의 단일 복용량을 주입하고 동물이 가열 패드에서 회복 할 수 있도록.
- 농축을 위해 잘게 썬 종이가 있는 개별 케이지에 마우스를 놓습니다. 매일 처음 며칠 동안, 그리고 일주일에 2회씩 마우스를 면밀히 모니터링하여 정상적인 행동, 반응성 및 외모를 관찰합니다.
2. 인트라바이탈 이미징
참고: 종양 세포 주입과 첫 번째 분과 내 영상 세션 사이의 시간 간격은 사용되는 종양 세포주의 유형에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에 표시된 실험의 경우, 1x 105 GL261 세포를 10일 후에 주입하고 이미지화하였다.
- 이미징 준비
- 얼굴 마스크 (1.5 %-2 % 이소플루란 / O2 혼합물)를 통해 이소플루란 흡입 마취를 사용하여 마우스를 진정시다.
- 탈수를 방지하기 위해 식염수 완충제 100 μL로 마우스를 피하로 주입하십시오.
참고: 장기 이미징의 경우 피하 주입 펌프를 통해 마우스를 수화할 수 있습니다. - 이미징 상자에 마우스를 얼굴을 위로 향하게 놓습니다. 조리개 주위에 1mm 직경의 구멍과 작은 자석이 박힌 금속 판을 사용하여 이미징 박스에 CIW를 고정시됩니다. 이소플루란을 안면 마스크를 통해 소개하고 상자 의 반대편에 있는 콘센트(0.8%-1.5% 이소플루란/O2 혼합물)로 환기시보세요. 선택적으로 테이프를 사용하여 마우스 본문을 고정합니다.
참고: 혈관 시각화 또는 기타 염료를 위해 형광성으로 표지된 덱스트렌은 이 시점에서 정맥 주사될 수 있습니다. - 선택적으로 펄스 산소 측정기와 가열 프로브를 사용하여 마우스의 활력을 모니터링하십시오.
참고: 본 실험에서는 마우스가 이미징 기간(2-3시간)에 걸쳐 안정되었기 때문에 펄스 산소 측정기와 가열 프로브를 사용할 필요가 없었습니다. 그러나 이미징 시간이 길어지면 보다 철저한 모니터링이 필요할 수 있습니다. - 25x(예: HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5mm)의 물 목표를 가장 낮은 z-위치로 설정하고 큰 물 방울을 추가합니다.
참고: 과학자들이 실험 중에 물을 추가할 수 있기 때문에 수분 침지 마이크로 디스펜서를 사용하는 것이 장기적인 실험에 매우 권장됩니다. 또는, 건조 한 목표를 사용할 수 있습니다. - 37°C에 보관된 어두운 기후 챔버가 장착된 현미경으로 이미징 박스를 옮김을 옮김. 물방울이 닿을 때까지 목표를 CIW 커버슬립에 넣습니다.
- 에피인광 모드를 사용하여 접안 렌즈를 통해 종양을 관찰하고 세포를 초점으로 가져옵니다.
- 타임랩스 이미지 수집
- 이미지에 관심 있는 여러 위치를 선택하고 소프트웨어에 좌표를 기록합니다. 선택된 위치가 종양의 다른 부위의 대표적인 위치인지 확인합니다(각 종양은 다를 수 있지만 일관성을 보장하기 위해 종양 코어의 중심인 동일한 양의 위치와 모든 마우스의 가장자리에 대해 선택하십시오).
참고 : 종양 또는 전체 가시 종양의 일부의 타일 스캔이 수행 될 수있다; 그러나 종양이 크면이 방법은 이미지 사이의 시간 경과를 증가시게됩니다. 또한, 종양 세포가 빠르게 움직이면, 시간이 지남에 따라 동일한 세포를 추적하는 것이 어려울 수 있다. - 다광자 모드로 전환하고 레이저를 올바른 파장에 맞춰 조정합니다. 광손상을 피하기 위해 더 높은 파장이 필요합니다.
참고: Dendra2 이미징의 경우 960 nm 파장이 사용되었습니다. 이러한 실험에서 사용된 객관적으로, 1.3의 줌은 종양 핵의 양호한 분해능을 얻고 종양의 대표적인 영역을 스캔하기에 충분하였다. - 라이브 모드로 이동하여 종양 세포 분해를 손상시키지 않고 종양 세포의 최대 부피를 획득하기 위해 각 위치에 대한 z-stack을 정의한다. 이미지 사이의 단계 크기를 3 μm로 정의합니다.
- 양방향 모드를 사용하여 스캔 속도를 높입니다. 이미지 해상도는 512 x 512 픽셀 이상이어야 합니다.
- 2시간 동안 20분마다 다른 위치에서 종양 볼륨의 이미지를 획득합니다. 각 이미지 획득 전에 목표에 물을 추가합니다.
참고: 소프트웨어에서 적절한 시간 경과를 설정하여 타임랩스 이미지를 자동으로 획득할 수 있습니다. 그러나 마우스가 이동할 수 있으며 위치 또는 z-stack이 시간이 지남에 따라 이동하여 데이터 손실을 초래할 수 있습니다. 따라서 시간 경과를 수동으로 수행하고 획득 간에 xyz 시프트가 있는지 확인하고 조정하는 것이 좋습니다. - 이 단계에서는 선택적으로 Dendra2 형광 마커를 사진 으로 전환합니다.
참고 : 시간 경과 이미징 (개별 종양 세포 특성을 연구하고 시간이 지남에 따라 어떻게 변화하는지 연구 할 수 있음)과는 달리, 이것은 며칠 동안 뇌의 종양 세포 침투 영역을 연구 할 수 있습니다4. 이 단계에 대한 자세한 설명은 글리고리예비치 외13에의해 설명된다. - 마지막 이미지를 획득한 후 스테이지에서 마우스를 제거하고 가열 패드에서 복구할 수 있습니다. 탈수를 방지하기 위해 식염수 100 μL을 피하로 투여 할 수 있습니다. 생검 같은 상해가 수행될 때까지 마우스를 케이지에 놓습니다.
- 이미지에 관심 있는 여러 위치를 선택하고 소프트웨어에 좌표를 기록합니다. 선택된 위치가 종양의 다른 부위의 대표적인 위치인지 확인합니다(각 종양은 다를 수 있지만 일관성을 보장하기 위해 종양 코어의 중심인 동일한 양의 위치와 모든 마우스의 가장자리에 대해 선택하십시오).
3. 생검 같은 상해 및 CIW 보충
- 첫 번째 이미징 세션 후 1 일 종양 부위에서 생검과 같은 부상을 만듭니다.
참고 : 또는 부분 종양 제거와 같은 다른 절차를 수행 할 수 있습니다.- 앞서 단계 2.1.1에 설명된 바와 같이 이소플루란 흡입 마취를 사용하여 마우스를 분리한다.
참고 : 주사용 마취를 사용할 수 있지만,이 절차는 CIW 이식보다 짧고, 흡입 마취는 정확하게 제어하고 마우스가 진정 남아있는 시간을 줄일 수 있습니다. - 마우스를 스테레오택 프레임에 놓고 두 개의 이어 바와 노즈 클램프로 머리를 고정합니다. 페달 반사 의 부족에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 수술 중에 마우스를 진정시키기 위해 스테레오택시 수술을 위해 마취 마스크를 사용하십시오.
- 면봉을 아세톤에 담그고 커버슬립 가장자리에 펴서 뇌에 덮개가 있는 접착제를 부드럽게 합니다.
- 커버슬립 아래에 얇은 점집을 밀어 들어 올립니다. 이 시점에서 커버슬립이 파손되면 포셉을 사용하여 유리 조각을 제거합니다.
- 피질 버퍼를 적용하여 뇌를 촉촉하게 유지하십시오.
- 종양에 25G 바늘을 1mm 깊이로 담그십시오.
참고 : 이 단계는 형광 입체 현미경으로 종양 영역을 보다 정확하게 식별 할 수 있습니다 (종양이 너무 작은 경우). 부가적으로, 형광 폴리스티렌 1 μm 비드의 1 μL 용액은 생검 영역을 확인하기 위해 펑크 동안 주입될 수 있다. - 실리콘 오일로 뇌 표면을 밀봉하고 상단에 6mm 커버 슬립을 붙입니다.
- 앞서 단계 2.1.1에 설명된 바와 같이 이소플루란 흡입 마취를 사용하여 마우스를 분리한다.
4. 반복된 화상 진찰
- 생검 같이 상해를 입히고 (그리고 필요한 경우에 연속된 일에) 1 일 후에, 종양 세포 행동이 시간이 지남에 따라 어떻게 변경되는지 평가하기 위하여 위의 단계 2에서 기술한 대로 활력 내 화상 진찰을 반복하십시오. 전체 종양 영역을 대표할 종양의 여러 위치를 선택합니다.
참고: 형광 비드가 생검 부위를 확인하기 위해 사용된 경우, 비생검 부위에 비해 생검 부위에서 종양 세포 행동을 이미지화합니다.
5. 이미지 분석
- 시간 경과 이미지를 수동으로 획득한 경우 하나의 폴더로 결합합니다.
- 현미경과 관련된 상용 소프트웨어에서 타임랩스 LIF 파일을 엽니다(예를 들어, LasX 또는 LAS AF). 탭 프로세스 > 프로세스 도구 > 병합을선택합니다. 시간 시퀀스의 첫 번째 이미지를 선택하고 첫 번째를 클릭합니다. 시간 시퀀스의 두 번째 이미지를 선택하고 두 번째를 클릭합니다. 차원병합에서 시간 t를 선택합니다. 적용을클릭합니다. 두 개의 타임포인트가 있는 새 파일이 생성됩니다. 새로 생성된 파일을 시퀀스의 첫 번째 이미지로 사용하여 모든 타임포인트에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
- 모든 xyz 시프트에 대해 획득한 z-스택을 수정합니다.
참고: 이 프로토콜에 설명된 실험의 경우 사용자 지정 디자인Visual Basic 소프트웨어 프로그램이 수정에 사용되었습니다. 또는 ImageJ 또는 Imaris와 같은 다른 사용 가능한 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.- 병합된 타임랩스 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 소프트웨어에서 TIFF 파일을 내보냅니다. RAW 데이터저장을 선택합니다. 내보낸 파일은 채널, 시간 및 z-position에 따라 명명된 하나의 폴더로 내보내집니다.
- 사용자 지정 설계된 Visual Basic 소프트웨어 프로그램에서 TIFF 파일을 엽니다.
- 타임포인트, z-스택 및 채널 수를 정의합니다.
- 모양 순서에 따라 각 채널에 색상을 지정합니다.
- 양식 표시 패널에서 각 타임포인트에 대해 위(U) 또는 아래(D) 버튼을 클릭하여 z의 이동을 수정합니다.
- Intravital 이미지 빌드 패널에서 xy 시프트에 대해 수정할 채널을 선택합니다. 종양 세포의 신호에 따라 수정할 녹색 채널을 선택합니다. xy 보정을 위해 자동을 클릭합니다.
- 수정된 이미지를 3개의 연속 z-스택의 최대 프로젝션으로 내보냅니다. 패널 선택에서내보낼 첫 번째(시작)와 마지막(끝) z-slices의 숫자를 소개합니다. 최대 . Z 에 대한 별도의 폴더를선택합니다. 수행을클릭합니다. 각각에 대해 3개의 z-stack, 시간 경과 이미지가 별도의 폴더로 내보내집니다.
- 선택적으로, 조직 탄성 변형에 대한 올바른.
참고: 조직 탄성 변형 실험의 경우, 일치 운동 보상 소프트웨어 프로그램은 단단하고 탄성 조직 변형을 교정하기 위해 사용되었다14. - 타임랩스 동영상에서 전체 z-스택에서 단일 셀을 추적합니다.
참고: 종양 세포는 예를 들어 ImageJ 플러그인(MTrackJ)을 사용하여 수동으로 추적할 수 있습니다. 정확하지만 xy 평면으로 제한되며 시간이 많이 걸립니다. 대안적으로, 종양 세포는 종양 세포 분절(예를 들어, Imaris 소프트웨어)을 사용하여 전체 z-volume 을 통해 자동으로 추적될 수 있다. 그러나 고밀도 종양에서는 자동화된 추적이 덜 정확하며 더 많은 추적 오류를 초래할 수 있습니다.- 각 타임랩스 시리즈(연속 3회 z-스택)를 별도로 열고 추적합니다. 시간 경과 이미지가 포함된 폴더를 ImageJ로 끕습니다.
- 탭 플러그인을 선택 > 추적 > MtrackJ. 각 시간대의 셀 추가 및 클릭을 선택하여 각 개별 셀을 추적합니다.
- 측정값을 클릭하고 파일을 저장하여 트랙의 측정값을 추출합니다.
Representative Results
뇌종양 세포 행동에 생검의 영향을 평가하기 위하여는, 우리는 이 프로토콜에 기술된 절차를 수행했습니다. GLIOMA-GL261 세포-핵 형광 단백질을 발현 (H2B-Dendra2) C57BL/6 마우스의 뇌에 주입 하 고 만성 CIW 이식 했다. 시간 경과 내 활력 화상 진찰은 종양에 동일한 동물 사전 및 사후 생검 유사 상해에 수행되었다 (도1A,B). 개별 종양 세포의 이동은 z-stack(도1C)의상이한 xy 평면에서 시간이 지남에 따라 이동 경로를 추적하고 전-및 후생검세포의 백분율로 플롯하였다(도 1F). 종양 세포 증식률은 유사분열 시 H2B 태그덴드라2 응축에 기초하여 정량화되었고(도1D)및 전-및 후생생물세포 분열의 백분율로 플롯하였다(도1E). 우리는 동일한 종양에서 생검 전후의 이동 속도 분포를 비교한 결과, 개입 후 철새 세포 수(속도 > 4 μm/h)가 증가하고, 느린/비이민 세포의 수가 감소한다는 것을 발견했습니다. 속도 및 lt; 4 μm/h) (그림2A). 종양당 평균적으로, 우리는 생검유사 상해가 수행되었을 때 철새 세포의 백분율에서 1.75(SD = 0.16)-배 증가를 관찰하였고, 생검되지 않은 대조군 마우스에 비해 (도2B). 우리는 또 다른 주에 대한 종양 세포 행동을 모니터링하고, 철새 종양 세포의 비율이 결국 대조군과 생검 마우스 모두에서 감소하더라도, 생검 마우스는 여전히 대조군 마우스보다 더 높은 철새 용량을 나타냈다는 것을 발견했습니다. 그림2C)를 참조하십시오. 시간이 지남에 따라 종양 세포 증식 행동의 분석은 생검 시 유사분열 사건의 수가 1.52배(SD = 0.26)-비생검 대조군마우스에 비해 1.52배 증가한 것으로 나타났다(도 2D).
종양 세포 증식 및 철새 행동에 대한 생검의 관찰된 효과가 CIW 대체 수술 (생검과 같은 상해를 수행하는 데 필요한)으로 인한 유물인지 여부를 테스트하기 위해 CIW를 시행한 마우스 그룹에서 종양 세포 행동을 모니터링했습니다. 생검없이 교체. 이 그룹에서, 우리는 종양 세포의 이동 또는 증식의 어떤 유도를 관찰하지 않았다, 종양 세포 증식 및 이동 속도에 부스트가 특히 생검 유사 부상에 의해 트리거되었음을 나타내는 (그림3A,B).
형광 성 단백질 Dendra2의 안정적인 광 변환은 며칠 동안 종양 세포 침투를 연구 할 수 있습니다. 자외선/청색광에 노출되면 Dendra2는 비가역적으로 녹색에서 빨간색으로 전환됩니다. 이 성질을 이용하여, 종양의 정사각형 영역을 조명하고 ~200덴드라2 발현 종양 세포를생검 전에 사진표시하였다(도 4). 생검 후 하루, 우리는 광 전환 영역을 지역화하고 주변 종양 조직으로 침투 한 종양 세포의 양을 측정했습니다. 우리는 침윤 부위가 비생검 대조군 종양에 비해 생검 유사 상해 후 종양에서 1.72(SD = 0.41)배 더 크다는 것을 발견하였다(그림 4). 이 접근법은 종양 세포 대량 침윤 행동에 대한 정보를 제공하고 단일 세포 수준이 아니라 시간 경과 이미징 접근법보다 시간이 덜 소요되며 독점적으로 초점을 맞춘 연구 질문에 대한 선택 방법이 될 수 있습니다. 침투 행동을 연구.
그림 1: 종양 세포 행동에 대한 생검 효과의 종방향 내 생체 내 이미징을 위한 실험 적 설정. (A) 링과 마그네틱 홀더의 디자인을 보여주는 다이어그램. (B) 실험 워크플로우의 개략적 표현. 종양 세포는 마우스의 두뇌로 주입되고 CIW는 설치됩니다. 종양 발달시, 첫번째 (prebiopsy) 시간 경과 화상 진찰 세션이 수행됩니다. 다음 날, 생검 및 CIW 교체가 구현됩니다. 이미징 후 다음 날 (사후 생검), 두 번째 타임 랩스 이미징 세션이 수행됩니다. 장기적인 효과를 위해 후속 이미징 세션을 수행할 수 있습니다. (C) 이미지는 GL261 H2B-Dendra2 종양 세포가 추적된 타임랩스 영화의 대표적인 스냅샷을 보여준다. 빨간 선은 개별적인 종양 세포 트랙을 묘사합니다. 스케일 바 = 50 μm. (D) GL261 H2B-Dendra2 종양에서 분할 세포를 나타내는 생체 내 타임랩스 이미지의 대표적인. 유사분열의 다른 단계는 표시됩니다: prophase (P), prometaphase (Pm), 메타 페이즈 (M), anaphase (A) 및 말단 단계 (T). 스케일 막대 = 50 μm. 그래프는(E) 철새 및 (F) 전세포 및 사후 생검세포를 나누는 비율을 나타낸다. 각 점은 개별 동물에서 측정된 모든 위치에서 철새 세포의 백분율을 나타냅니다. 데이터는 6개의 마우스의 평균 ±S.E.M.로 도시된다(**P < 0.01, 쌍을 이룬 t-test). 이 그림은 Alieva 등에서 수정되었습니다.4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 종양 세포 이동 및 증식 비율에 대한 생검의 영향을 보여주는 대표적인 결과. (a) 폭포 플롯은 개별 마우스의 기저 이동에 대한 세포 속도 분포의 변화를 나타낸다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균 ±S.E.M.로 도시된다. (B) 대조군(파란색) 및 생검(red) 동물의 수에 대한 철새 세포의 수 [n=6 마우스, ***P < 0.0001, 학생의 t-test). (C) 종양 세포 거동을 며칠에 걸쳐 추적하였다. 도시된 것은 정규화된(사전 개입에 상대적) 시간이 지남에 따라 개별 마우스에서 철새 세포의 수(n > 4 마우스조건당, ***P < 0.0001, 양방향 ANOVA)이다. (D) 대조군(파란색) 및 생검(빨강) 동물에서 분할 세포의 정규화된 수. 개별 동물당, 사후개입 값은 사전개입(n=5 마우스, **P < 0.01, 학생의 t-test)값으로 정규화되었다. 이 그림은 Alieva 등에서 수정되었습니다.4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: CIW 치환술은 종양 세포 거동에 영향을 미치지 않는다. 종방향 내 활력 화상 진찰은 생검 없이 CIW의 보충이 이동 및 증식 비율에 영향을 미치지 않다는 것을 보여줍니다. (A) 표시된 조건에 대한 철새 셀수의 증가. 모든 심볼은 개별 마우스및 n≥ 4 마우스의 평균을 나타낸다. (B) 표시된 조건에 대한 증식 세포의 수의 증가. 모든 심볼은 개별 마우스의평균을 나타냅니다(n ≥ 4 마우스, **P < 0.01,***P < 0.001, ns = 중요하지 않은, 뉴먼-쿨스 포스트 혹 검정을 가진 편도 ANOVA). 이 그림은 Alieva 등에서 수정되었습니다.4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Dendra2 광 스위칭으로 얻은 실험 설정 및 대표적인 결과를 보여주는 다이어그램. 생검시 종양 세포 침투를 모니터링하기 위해, Dendra2 발현 종양 세포는 UV/청색광 조명에 의해 정사각형 영역에서 사진 전환되고 생검 1일 전에 이미지화됩니다. 생검 후 하루, 사진 전환 영역은 지역화및 재이미지된다. 도시된 것은 채널 빼기용하여 보정된 종양 세포 침투의 대표적인 Dendra2 이미지이다. 흰색 점선은 침투 영역을 나타냅니다. 스케일 막대 = 50 μm. 그래프는 생검(빨간색) 및 대조군(파란색) 마우스에 대해 플롯된 증가된 광 전환 영역을 보여줍니다. 모든 점은 개별 마우스의 평균값을 나타냅니다(n ≥ 5 마우스, *P < 0.05, 학생의 t-test). 이 그림은 Alieva 등에서 수정되었습니다.4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에서 우리는 살아있는 동물의 두뇌에 있는 생검과 같은 침략적인 외과 절차에 응하여 단 하나 세포 수준에 있는 종양 세포 행동에 있는 변경을 공부하는 방법을 기술합니다. 만성 CIW의 외과 적 이식과 세로 다광자 이미징의 조합은 동일한 동물4에서 생검 전후의 종양 세포 이동, 침습및 증식의 정량화를 가능하게 한다. 생물 발광 화상 진찰12,MRI10,또는 PET/CT11와같은 종양 다일 감시를 위해 이용된 그밖 접근에 비교해, 이 방법은 단 하나 세포 수준에 종양을 유일하게 구상하고, 그러므로, 세포 행동에 있는 통찰력을 제공합니다 근본적인 종양 진행.
이 메서드를 성공적으로 수행하려면 여러 절차를 마스터해야 합니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 CIW 이식 및 교체입니다. 이러한 단계의 기술적 복잡성은 꾸준한 교육을 통해 얻을 수 있는 정밀도와 수술 기술이 필요합니다. CIW 수술 도중 합병증은, 두뇌 표면을 덮을 수 있는 출혈과 같은, 후속 화상 진찰을 위해 도전을 증명할 수 있습니다. 멸균 도구 또는 환경의 부족뿐만 아니라 뇌 표면을 완전히 밀봉하지 못하면 뇌 표면에 감염 (커버 슬립 아래의 흰색 액체)이 발생할 수 있으며, 이는 이미징을 문제가만들고 그 결과로 강하게 손상될 수 있습니다. 해석. 이 프로토콜의 또 다른 일반적인 문제는 시간 경과 화상 진찰 도중 동물 운동입니다. 실험 후 xyz 시프트를 수정할 수 있지만 정보 손실을 방지하기 위해 각 시점 전에 각 위치의 좌표를 수정하는 것이 좋습니다. 조직 변형은 반전된 현미경에 화상 진찰할 때 찾아낸 추가 문제입니다. 마우스가 척추 위치에 놓일 때 뇌 조직은 압축으로 고통받습니다. 조직 변형의 정도에 따라, 종양 세포 추적은 세포 변위의 잘못된 정량화로 이어질 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 강성 및 탄성 변형을위한 소프트웨어가14를 사용할 수 있습니다.
이 절차는 종양 행동에 있는 변경을 공부하기 위한 광범위한 응용을 제안하는 동안, 특정 한계는 고려되어야 합니다. 이 방법을 통해 과학자들은 최대 1.6 mm 깊이까지 이미지화 할 수 있습니다 (광학 파라 메트릭 발진기를 사용하여); 그러나, 이것은 화상 진찰이 표면적인 두뇌 피질 지역15로제한된다는 것을 의미합니다. 따라서, 깊은 뇌 구조에 있는 몇몇 뇌 종양, 뇌간 지구에 있는 확산 본질적인 pontine gliomas를 포함하여, 이 프로토콜을 가진 그들의 본래 두뇌 환경에서 공부될 수 없습니다. 이 프로토콜의 또 다른 제한은 이미지화 될 수있는 종양의 부피입니다. 총 종양 부피 스캐닝이 최대 정보를 얻기 위해 요구되지만, 종종 종양 크기 및 철새 세포의 속도는 요인을 제한할 수 있다. 각 종양 모형을 위해, 화상 진찰을 위한 최적 시간 경과는 고려되어야 합니다. 심상 사이 시간 프레임이 너무 길면 종양 세포를 추적하기 어려울 수 있습니다. 공진 스캐너의 사용은 더 큰 종양16의화상 진찰을 허용하는 스캐닝 시간을 높게 감소시킬 수 있습니다. 마지막으로 이 프로토콜의 수동 이미지 분석은 매우 시간이 많이 소요될 수 있으므로 자동화된 3D 추적 프로그램을 사용할 수 있습니다. 그러나 자동화된 셀 추적 알고리즘은 관심 셀의 마이그레이션을 정확하게 재현하도록 설계되지 않으므로 추적 결과를 항상 시각적으로 감독해야 합니다.
여기에 설명된 프로토콜을 약간 적용하면 더 넓은 범위의 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 생검을 수행하는 대신, 부분 종양 절제술 또는 화학 요법 웨이퍼의 전달과 같은 다른 (외과적) 개입이 구현될 수 있다. 외과적으로 이식된 마이크로튜브를 통한 화합물의 첨가는 관심 있는 특정 분자를 약리학적으로 표적화하기 위해 이 프로토콜과 결합될 수 있다. 우리는 이 모형이 종양 세포 행동에 특정 내정간섭의 충격을 분석하는 것을 겨냥한 연구 결과에서 유용할 것이라는 점을 기대합니다. 동일한 동물에서 반복적인 측정을 수행할 수 있는 가능성은 종양에서 발생하는 변화에 대한 보다 정확한 데이터를 제공 할뿐만 아니라 연구 당 필요한 실험 동물의 수를 크게 줄입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자들은 앙코 드 그라프와 허브레흐트 이미징 센터의 이미징 지원에 감사드리며, 엘렌 웨렌스와 한나 존슨은 원고를 교정하고 편집해 주었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
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