डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश का शुद्धिकरण
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम एक डेन्ड्रिटिक फिलोपोडायल के बीच विशिष्ट और मजबूत संबंध का लाभ लेने के द्वारा सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स पर phagocytic कप की तरह बहिर्वेश संरचना से डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश को शुद्ध करने के लिए एक विधि परिचय आसंजन अणु, TLCN, और एक extracellular मैट्रिक्स अणु, vitronectin.
Abstract
डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया एक्टिन फिलामेंट के आधार पर पतले और लंबे समय तक बाहर निकालते हैं, और वे एक लक्ष्य एक्सॉन के लिए खोज के रूप में विस्तार और वापस ले लेते हैं। जब डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया एक लक्ष्य एक्सॉन के साथ संपर्क स्थापित करता है, तो वे रीढ़ की हड्डी में परिपक्व होने लगते हैं, जिससे एक synapse के गठन के लिए अग्रणी होता है। टेलीनसेफेलिन (टीएलसीएन) डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में प्रचुर मात्रा में स्थानीयकृत है और धीरे-धीरे रीढ़ की हड्डी से बाहर रखा गया है। सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में टीएलसीएन का अतिव्यंजक डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया गठन को प्रेरित करता है। हमने दिखाया कि टेलिनेसेफेलिन एक अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स अणु, विट्रोनेक्टिन से दृढ़ता से बांधता है। विट्रोनेक्टिन लेपित माइक्रोबीड्स न्यूरोनल डेन्ड्राइट पर फेगोसाइटिक कप गठन को प्रेरित करता है। फागोसाइटिक कप में, टीएलसीएन, टीएलसीएन-बाइंडिंग प्रोटीन जैसे फॉस्फोरिलेटिड एज़रिन/रेडिक्सिन/मोसिन (फॉस्फो-ईआरएम) और एफ-एक्टिन जमा होते हैं, जो बताते हैं कि फागोसाइटिक कप के घटक डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के समान होते हैं। इस प्रकार, हमने डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के स्थान पर फागोसाइटिक कप को शुद्ध करने के लिए एक विधि विकसित की। चुंबकीय पॉलीस्टाइरीन मोती विट्रोनेक्टिन के साथ लेपित थे, जो हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृति माध्यम में प्रचुर मात्रा में मौजूद है और जो न्यूरोनल डेन्ड्राइट पर फेगोसाइटिक कप गठन को प्रेरित करता है। 24 ज ऊष्मायन के बाद, phagocytic कप डिटर्जेंट के साथ हल्के solubilized थे और एक चुंबक विभाजक का उपयोग कर एकत्र. मोती धोने के बाद, बाध्यकारी प्रोटीन eluted और चांदी धुंधला और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया. बाध्यकारी अंश में, TLCN और actin प्रचुर मात्रा में मौजूद थे. इसके अलावा, अंश से पहचाने गए कई प्रोटीन को डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में स्थानीयकृत किया गया; इस प्रकार, हमने बंधनीय अंश को डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के रूप में नामित किया। यह लेख डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के लिए शुद्धि विधि के बारे में विवरण का वर्णन करता है।
Introduction
डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया को रीढ़ की हड्डी का अग्रदूत माना जाता है। डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में एक्टिन फिलामेंट उनके विस्तार और वापसी1,2,3को विनियमित करते हैं . एक एक्सॉन के साथ संपर्क करने के बाद, चयनित डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया रीढ़ की हड्डी में अपनी परिपक्वता शुरू करते हैं, और एक सिनेप्स का गठन4,5होता है। रीढ़ के घटक पोस्टीनैप्टिक घनत्व के व्यापक विश्लेषण से निर्धारित किए गए हैं6,7, जबकि डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के घटक काफी हद तक अज्ञात रहते हैं। यह दिखाया गया है कि टेलीनसेफेलिन (TLCN), ERM, SynGAP, रास, PI3 kinase, Akt, MTOR, पोलो की तरह kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, और EphB को विनियमित डेन्ड्रिटिक filopodia गठन5,8,9 10,11, जबकि डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में मौजूद अणुओं के व्यापक विश्लेषण के लिए एक विधि विकसित नहीं की गई है।
TLCN (ICAM-5) विशेष रूप से सबसे रोस्ट्रल मस्तिष्क खंड में spiny न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त की है, telencephalon12. TLCN अपने extracellular क्षेत्र में 9 आईजी की तरह डोमेन है, एक transmembrane क्षेत्र, और एक साइटोप्लाज्मिक पूंछ13. TLCN अपने extracellular क्षेत्र में vitronectin (VN) और LFA-1 integrin के लिए बांधता है, अपने transmembrane क्षेत्र में presenilin करने के लिए, और फॉस्फो-ईआरएम और अपने साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र में जेड-actinin5,8,14,15 ,16. TLCN रीढ़ की हड्डी और डेन्ड्रिटिक शाफ्ट8,16में डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया और जेड-एक्टिनिन के सुझावों पर फॉस्फो-ईआरएम के माध्यम से actin cytoskeleton को बांधता है।
हमने दिखाया कि टीएलसीएन ने डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के गठन को बढ़ाया और रीढ़ की हड्डी को फिर से शुरू करने के लिए फिलोपोडिया10को प्रेरित किया . TLCN कोशिकाद्रव्यी क्षेत्र और उन्नत डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया गठन8के लिए बाध्य ezrin के गठन सक्रिय रूप . इस प्रकार, TLCN actin-बाध्यकारी प्रोटीन के माध्यम से डेन्ड्रिटिक filopodia गठन को नियंत्रित करता है. Esselens एट अल. प्रदर्शन किया है कि microbeads सुसंस्कृत न्यूरॉन्स17पर TLCN संचय प्रेरित . हमने दिखाया कि वीएन लेपित माइक्रोबीड्स के चारों ओर न्यूरॉनल डेन्ट्रेट्स पर टीएलसीएन-निर्भर तरीके से15के बारे में फेगोसाइटिक कप संरचनाओं का गठन किया गया था। डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के घटक फैगोसाइटिक कप के समान होते हैं। डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया को एकत्र करना मुश्किल है, लेकिन चुंबकीय माइक्रोबीड्स का उपयोग करके फैगोसाइटिक कप एकत्र करना अपेक्षाकृत आसान है। इस प्रकार हमने डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया18के स्थान पर फागोसाइटिक कप को शुद्ध करने की एक विधि विकसित की। यहाँ, हम डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के लिए शुद्धि विधि का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने सेल आसंजन अणु TLCN और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन vitronectin के बीच संबंध का उपयोग कर के डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश के लिए एक शुद्धि विधि विकसित की है. PSD अंश की तुलना में, यह डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश से अपरिपक्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की कम घनत्व संस्कृति के लिए Shigeo Okabe और Hitomi Matsuno धन्यवाद, TLCN कमी चूहों के लिए Masayoshi Mishina, Sachiko Mitsui और Momoko Shiozaki तकनीकी सहायता के लिए, और सहायक विचार विमर्श के लिए Yoshihara प्रयोगशाला के सदस्यों . इस कार्य को जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नं. JP20700307, JP22700354, और JP24500392 और MEXT KAKENHI अनुदान Nos. JP23123525 YF और JP20022046, JP18H04683, और JP18H05146 YY करने के लिए.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
