Summary

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश का शुद्धिकरण

Published: May 02, 2019
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Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम एक डेन्ड्रिटिक फिलोपोडायल के बीच विशिष्ट और मजबूत संबंध का लाभ लेने के द्वारा सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स पर phagocytic कप की तरह बहिर्वेश संरचना से डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश को शुद्ध करने के लिए एक विधि परिचय आसंजन अणु, TLCN, और एक extracellular मैट्रिक्स अणु, vitronectin.

Abstract

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया एक्टिन फिलामेंट के आधार पर पतले और लंबे समय तक बाहर निकालते हैं, और वे एक लक्ष्य एक्सॉन के लिए खोज के रूप में विस्तार और वापस ले लेते हैं। जब डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया एक लक्ष्य एक्सॉन के साथ संपर्क स्थापित करता है, तो वे रीढ़ की हड्डी में परिपक्व होने लगते हैं, जिससे एक synapse के गठन के लिए अग्रणी होता है। टेलीनसेफेलिन (टीएलसीएन) डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में प्रचुर मात्रा में स्थानीयकृत है और धीरे-धीरे रीढ़ की हड्डी से बाहर रखा गया है। सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में टीएलसीएन का अतिव्यंजक डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया गठन को प्रेरित करता है। हमने दिखाया कि टेलिनेसेफेलिन एक अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स अणु, विट्रोनेक्टिन से दृढ़ता से बांधता है। विट्रोनेक्टिन लेपित माइक्रोबीड्स न्यूरोनल डेन्ड्राइट पर फेगोसाइटिक कप गठन को प्रेरित करता है। फागोसाइटिक कप में, टीएलसीएन, टीएलसीएन-बाइंडिंग प्रोटीन जैसे फॉस्फोरिलेटिड एज़रिन/रेडिक्सिन/मोसिन (फॉस्फो-ईआरएम) और एफ-एक्टिन जमा होते हैं, जो बताते हैं कि फागोसाइटिक कप के घटक डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के समान होते हैं। इस प्रकार, हमने डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के स्थान पर फागोसाइटिक कप को शुद्ध करने के लिए एक विधि विकसित की। चुंबकीय पॉलीस्टाइरीन मोती विट्रोनेक्टिन के साथ लेपित थे, जो हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृति माध्यम में प्रचुर मात्रा में मौजूद है और जो न्यूरोनल डेन्ड्राइट पर फेगोसाइटिक कप गठन को प्रेरित करता है। 24 ज ऊष्मायन के बाद, phagocytic कप डिटर्जेंट के साथ हल्के solubilized थे और एक चुंबक विभाजक का उपयोग कर एकत्र. मोती धोने के बाद, बाध्यकारी प्रोटीन eluted और चांदी धुंधला और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया. बाध्यकारी अंश में, TLCN और actin प्रचुर मात्रा में मौजूद थे. इसके अलावा, अंश से पहचाने गए कई प्रोटीन को डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में स्थानीयकृत किया गया; इस प्रकार, हमने बंधनीय अंश को डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के रूप में नामित किया। यह लेख डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के लिए शुद्धि विधि के बारे में विवरण का वर्णन करता है।

Introduction

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया को रीढ़ की हड्डी का अग्रदूत माना जाता है। डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में एक्टिन फिलामेंट उनके विस्तार और वापसी1,2,3को विनियमित करते हैं . एक एक्सॉन के साथ संपर्क करने के बाद, चयनित डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया रीढ़ की हड्डी में अपनी परिपक्वता शुरू करते हैं, और एक सिनेप्स का गठन4,5होता है। रीढ़ के घटक पोस्टीनैप्टिक घनत्व के व्यापक विश्लेषण से निर्धारित किए गए हैं6,7, जबकि डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के घटक काफी हद तक अज्ञात रहते हैं। यह दिखाया गया है कि टेलीनसेफेलिन (TLCN), ERM, SynGAP, रास, PI3 kinase, Akt, MTOR, पोलो की तरह kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, और EphB को विनियमित डेन्ड्रिटिक filopodia गठन5,8,9 10,11, जबकि डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में मौजूद अणुओं के व्यापक विश्लेषण के लिए एक विधि विकसित नहीं की गई है।

TLCN (ICAM-5) विशेष रूप से सबसे रोस्ट्रल मस्तिष्क खंड में spiny न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त की है, telencephalon12. TLCN अपने extracellular क्षेत्र में 9 आईजी की तरह डोमेन है, एक transmembrane क्षेत्र, और एक साइटोप्लाज्मिक पूंछ13. TLCN अपने extracellular क्षेत्र में vitronectin (VN) और LFA-1 integrin के लिए बांधता है, अपने transmembrane क्षेत्र में presenilin करने के लिए, और फॉस्फो-ईआरएम और अपने साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र में जेड-actinin5,8,14,15 ,16. TLCN रीढ़ की हड्डी और डेन्ड्रिटिक शाफ्ट8,16में डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया और जेड-एक्टिनिन के सुझावों पर फॉस्फो-ईआरएम के माध्यम से actin cytoskeleton को बांधता है।

हमने दिखाया कि टीएलसीएन ने डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के गठन को बढ़ाया और रीढ़ की हड्डी को फिर से शुरू करने के लिए फिलोपोडिया10को प्रेरित किया . TLCN कोशिकाद्रव्यी क्षेत्र और उन्नत डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया गठन8के लिए बाध्य ezrin के गठन सक्रिय रूप . इस प्रकार, TLCN actin-बाध्यकारी प्रोटीन के माध्यम से डेन्ड्रिटिक filopodia गठन को नियंत्रित करता है. Esselens एट अल. प्रदर्शन किया है कि microbeads सुसंस्कृत न्यूरॉन्स17पर TLCN संचय प्रेरित . हमने दिखाया कि वीएन लेपित माइक्रोबीड्स के चारों ओर न्यूरॉनल डेन्ट्रेट्स पर टीएलसीएन-निर्भर तरीके से15के बारे में फेगोसाइटिक कप संरचनाओं का गठन किया गया था। डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के घटक फैगोसाइटिक कप के समान होते हैं। डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया को एकत्र करना मुश्किल है, लेकिन चुंबकीय माइक्रोबीड्स का उपयोग करके फैगोसाइटिक कप एकत्र करना अपेक्षाकृत आसान है। इस प्रकार हमने डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया18के स्थान पर फागोसाइटिक कप को शुद्ध करने की एक विधि विकसित की। यहाँ, हम डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के लिए शुद्धि विधि का वर्णन करते हैं।

Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को रिकेन वाको की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। 1. हिप्पोकैम्पस न्यूरोंस की संस्कृति संस्कृति माध्यम की तैयारी 200x विटा…

Representative Results

सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में, TLCN प्रचुर मात्रा में डेन्ड्रिटिक filopodia, शाफ्ट, और सोमा के लिए स्थानीयकृत किया गया था और एफ-एक्टिन के साथ colocalized (चित्र 1A, बी)। जब polystyrene microbeads स?…

Discussion

हमने सेल आसंजन अणु TLCN और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन vitronectin के बीच संबंध का उपयोग कर के डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश के लिए एक शुद्धि विधि विकसित की है. PSD अंश की तुलना में, यह डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश से अपरिपक्…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की कम घनत्व संस्कृति के लिए Shigeo Okabe और Hitomi Matsuno धन्यवाद, TLCN कमी चूहों के लिए Masayoshi Mishina, Sachiko Mitsui और Momoko Shiozaki तकनीकी सहायता के लिए, और सहायक विचार विमर्श के लिए Yoshihara प्रयोगशाला के सदस्यों . इस कार्य को जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नं. JP20700307, JP22700354, और JP24500392 और MEXT KAKENHI अनुदान Nos. JP23123525 YF और JP20022046, JP18H04683, और JP18H05146 YY करने के लिए.

Materials

1 M HEPES Gibco 15630-080
1.7 ml Low Binding MCT Sorenson BioScience 39640T
200 mM L-Glutamine Gibco 2530149
35-mm plastic cell culture dishes Corning 430165
Anti-actin Sigma-Aldrich A-5060
Anti-alpha-Actinin Sigma-Aldrich A-5044
Anti-alpha-tubulin Sigma-Aldrich T-9026
Anti-Ezrin Sigma-Aldrich clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq Santacruz sc-393
Anti-MAP2 Chemicon clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin Sigma-Aldrich clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1 Santacuz sc-5291
Anti-PSD95 MA2 ABR
Anti-Spectrin beta Chemicon MAB1622
B27 Gibco 0080085SA
BCA protein assay kit Thermo 23227
Bromophenol blue Merck 1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous Wako 038-19735
Cell scraper Falcon 353085
Cell strainer Falcon 352350
Choline chloride Sigma-Aldrich C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C-6645
DNase-I Sigma-Aldrich DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich P5155
DynaMag-2 Magnet Thermo 12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel ATTO E-T520L
Folic acid Sigma-Aldrich F8758
HBSS Gibco 14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
i-Inositol Sigma-Aldrich I7508
LAS-1000 mini Fuji Film LAS-1000 mini For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads Sperotech PM-20-10
MEM amino acid solution Gibco 11130-051 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system ATTO AE-6530
Niacinamide Sigma-Aldrich N0636
Penicilin / Streptomycin Gibco 15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail Roche 4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide Nacali 28360-14
Pyridoxal HCl Sigma-Aldrich P6155
Riboflavin Sigma-Aldrich R9504
Silver Stain 2 Kit wako Wako 291-5031
Thiamine HCl Sigma-Aldrich T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-rad 1703940JA
Ultra pure water MilliQ For production of ultra pure water

References

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Cite This Article
Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).

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