Summary
תולעים נימיות Caenorhabditis elegans הוא מודל מצוינת לנתח פתוגן-פונדקאי אינטראקציות. המתוארים כאן הוא פרוטוקול להדביק את התולעת עם חברי streptococci קבוצה מיטיס ולקבוע ההפעלה של התגובה סטרס חמצוני נגד H2O2 המיוצר על ידי קבוצה זו של אורגניזמים.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), תולעים נימיות אל-אווירני עצמאי, התפתחה מודל אטרקטיבי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. פרוטוקול הציג משתמשת מודל זה כדי לקבוע את פתוגניות הנגרמת על ידי streptococci קבוצה מיטיס דרך הייצור של2O H2. Streptococci קבוצה מיטיס הם איום המתעוררים הגורמות למחלות רבות כגון בקטרמיה, דלקת פנים הלב, צלוליטיס מסלולית. המתוארים כאן פרוטוקול כדי לקבוע את ההישרדות של תולעים אלה בתגובה2O H2 המיוצר על ידי הקבוצה של פתוגנים. באמצעות קידוד skn-1 ג'ין עבור גורם שעתוק של התגובה סטרס חמצוני, הוא הראה כי מודל זה חשוב לזיהוי גנים המארח החיוניים מפני זיהום streptococcal. יתר על כן, הוא הראה כי ניתן לנטר ההפעלה של התגובה סטרס חמצוני בנוכחות פתוגנים אלה באמצעות זן תולעת כתב מהונדס, שבו SKN-1 היא דבוקה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). מבחני אלה מספקים הזדמנות ללמוד את סטרס חמצוני בתגובה2O H2 נגזר על ידי מקור ביולוגי בניגוד exogenously הוסיף מקורות (ROS) מינים חמצן תגובתי.
Introduction
מיטיס קבוצה streptococci הם commensals האנושי של חלל הלוע התחתון1. עם זאת, אורגניזמים אלה ניתן לברוח הנישה הזאת, לגרום למגוון של מחלות פולשניות2. זיהומים הנגרמים על ידי מיקרואורגניזמים אלה כוללים בקטרמיה, דלקת פנים הלב ו צלוליטיס מסלולית2,3,4,5,6. יתר על כן, הם מתגלים סוכנים סיבתי כמו של מחזור הדם זיהומים בתוך neutropenic immunocompromised, ולאחר חולי סרטן שעברו טיפול כימותרפי5,7,8,9 .
מנגנוני פתוגנזה קבוצה מיטיס המשמש כבסיס הוא מעורפל, כי זוהו מספר גורמים התקפה אלימה. הקבוצה מיטיס ידוע לייצר H2O2, אשר הראו לשחק תפקיד חשוב קהילות מיקרוביאלי אוראלי10. לאחרונה, מספר מחקרים הראו תפקיד עבור H2O2 כמו cytotoxin שגורם תאים אפיתל מוות11,12. S. דלקת ריאות, אשר שייך לקבוצה זו, הוכח לייצר רמות גבוהות של2O H2 שגורם נזק לדנ א של אפופטוזיס בתאים מכתשי13. שימוש במודל חיה דלקת ריאות חריפה, אותם חוקרים הראו כי הייצור של2O H2 על ידי החיידקים מקנה יתרון התקפה אלימה. מחקרים על דלקת קרום המוח pneumococcal הראו גם שאת הפתוגן, נגזר H2O2 פועל בסינרגיה עם pneumolysin כדי לעורר דופאמינרגיים המוות14. תצפיות אלה לקבוע בבירור את2O H2 המיוצר על ידי קבוצת חיידקים חשוב עבור פתוגניות שלהם.
מעניין, גם הוכח כי חברי מיטיס הקבוצה מיטיס ס , ס' oralis לגרום למוות של נמטודות C. elegans דרך הייצור של H2O215,16. תולעים נימיות אל-אווירני עצמאי זה שימש כמודל פשוטה, צייתן גנטית ללמוד תהליכים ביולוגיים רבים. לאחרונה, התולעת התפתחה כמודל ללמוד פתוגן-פונדקאי אינטראקציות17,18. בנוסף, מספר מחקרים הדגישו את החשיבות של לימוד לחץ חימצוני באמצעות זה אורגניזם19,20,21. מחזור חיים קצר שלו, היכולת תמונות ציפורים הגנים של עניין על-ידי RNAi, ושימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-הכתבים מאוחה כדי לפקח על ביטוי גנים, חלק תכונות שהופכות אותו מערכת מודל אטרקטיבי. חשוב מכך, המסלולים המסדירים סטרס חמצוני, מולדת חסינות של התולעת מאוד נשמרים עם יונקים20,22.
ב פרוטוקול זה, הוכח כיצד להשתמש C. elegans התירי את פתוגניות נגרם על-ידי streptococcal-derived H2O2. וזמינותו להישרדות ששונה מוצג, חברי הקבוצה מיטיס מסוגלים להרוג את התולעים במהירות דרך הייצור של2O H2. באמצעות חברי הקבוצה מיטיס, מקור ביולוגי מתמשכת של מינים חמצן תגובתי (ROS) מסופק, לעומת מקורות כימי זירוז סטרס חמצוני של התולעים. יתר על כן, החיידקים מסוגלים ליישב את התולעים במהירות, מה שמאפשר עבור2O H2 להיות ממוקד ישירות אל תאי המעי (לעומת מקורות אחרים צריך לחצות את המחסומים מספר). וזמינותו מאומת גם 1) קביעת ההישרדות של המתח מוטציה skn-1 או 2) על-ידי הורסים skn-1 באמצעות RNAi תולעים ביחס N2 פראי-סוג ותולעים שליטה מטופלים וקטור. SKN-1 הוא גורם שעתוק חשובים המסדירה את תגובת לחץ חימצוני ב- C. elegans23,24,25. בנוסף מבחני הישרדות, זן תולעת לבטא כתב מהונדס SKN-1B/C::GFP משמש כדי לפקח על ההפעלה של סטרס חמצוני תגובה דרך הייצור של H-2-O-2 ע י קבוצת מיטיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת את פלטות אגר (תמצית שמרים טוד יואיט)
- 1 ליטר של מדיה, להוסיף 30 גרם של אבקת טוד יואיט, דור 2 של תמצית שמרים וכ 20 גר' אגר אל בקבוק Erlenmeyer 2 ל'. להוסיף התוכן של הבקבוק 970 מ ל מים יונים, כוללים בר מערבבים. אוטוקלב התקשורת-לטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ולחץ של 15 ליברות לאינץ2 למשך 30 דקות. לאחר מכן, הגדר התקשורת על צלחת מערבבים ומאפשרים לקירור עם ערבוב עדין.
- שופכים את המדיה לתוך צלחות פטרי סטריליות בגודל מתאים (100 מ"מ x 15 מ"מ מנות צמיחה ותחזוקה של חיידקים, 35 מ"מ x 10 מ"מ מנות על הורגת מבחני) תחת זרימה שכבתית. לאפשר התקשורת לייבוש על 2 h מתחת למכסה המנוע למינריות. לאחר מכן, ניתן לאחסן את הצלחות ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
2. הכנת מדיום הגידול נמטודות (NGM), RNAi האכלה צלחות (NGM RNAi)
- באמצעות בר stir, להמיס 2.5 g של peptone ו- 3g של NaCl ב 970 מ ל מים יונים בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל'. להוסיף 20 גרם של אגר למדיה. אוטוקלב התקשורת-לטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ולחץ של 15 ליברות לאינץ2 במשך 30 דקות להגדיר כלי התקשורת על צלחת מערבבים ומאפשרים לקירור עם ערבוב עדין.
- להוסיף את הפתרונות הבאים למדיה להכנה של צלחות NGM: 25 מ של 1 מ' אשלגן פוספט מאגר (ה-pH = 6.0), 1 מ"ל של MgSO 1 מ'4, 1 מ"ל של CaCl 1 מ'2, 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל אתנול 95%) , 1 מ"ל של ניסטטין (10% v/w אתנול), ו- 1 מ"ל של 25 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין.
- להוסיף את הפתרונות הבאים למדיה להכנה של RNAi NGM האכלה צלחות: 25 מ של 1 מ' אשלגן פוספט מאגר (ה-pH = 6.0), 1 מ"ל של MgSO 1 מ'4, 1 מ"ל של CaCl 1 מ'2, 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל אתנול 95%) , 1 מ"ל של ניסטטין (10% v/w אתנול), 1 מ"ל של 50 מ"ג/מ"ל carbenicillin ו 1 מ"ל של IM IPTG.
- שופכים המדיה לתוך 60 מ"מ x 15 מ"מ עקר פטרי תחת זרימה שכבתית. לאפשר התקשורת לייבוש על 2 h מתחת למכסה המנוע למינריות. לאחר מכן, ניתן לאחסן צלחות ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
3. תחזוקה של C. elegans
- זרע הלוחות NGM מאת spotting 50 µL של לילה גדלו e. coli OP50 במרכז של הלוחות. התרבות החיידק שהוכנו בעבר בתקשורת לוריה-Bertani (LB) ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. לכסות את הצלחות ולאפשר להם להתייבש במשך 24 שעות ביממה ברדס למינריות, לאחר מכן לאחסן את הלוחות פוליסטירן אריזה.
- תחת מיקרוסקופ ויבתר, לאסוף 10 ל-12 מבוגרים gravid באמצעות איסוף סטרילית תולעת ולהעביר את התולעים e. coli OP50 נזרע NGM צלחת. דגירה הלוחות ב 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, להסיר את המבוגרים באמצעות איסוף סטרילית תולעת ולאפשר את העוברים לפתח הזחלים L4-20 ° C (~2.5 ימים).
4. הכנת אוכלוסיית גיל סינכרונית של תולעים
-
לשטוף מבוגרים gravid בין 2 ל 4 צלחות NGM באמצעות M9W ולאסוף אותם צינור חרוטי 15 מ"ל.
- להכנת M9W: לשלב דור 3 של NaCl, 6 גר' נה2HPO4, ו- 3g של2פו ח'4 , להמיס נפח סופי של 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב הפתרון ולהוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4.
- לסובב את הצינור ב x 450 גרם עבור 1 דקות, ואז decant את תגובת שיקוע תוך הקפדה כי בגדר תולעת נשאר שלם וללא פגע.
- הוסף µL 400 של 8.25% נתרן תת-כלורי (אקונומיקה משק הבית), 100 µL של 5 N NaOH להכין את הפתרון פירוק של התולעת. להוסיף את הפתרון פירוק בגדר תולעת ומערבבים את התוכן על ידי מצליף את הצינורית עד 70% של תולעים בוגרות הן lysed. מעת לעת לבחון את התוכן של הצינור מתחת למיקרוסקופ ויבתר כדי להבטיח יש אין overbleaching של הביצים.
- לדלל את התערובת אקונומיקה על-ידי הוספת 10 מ"ל של M9W התוכן של הצינור חרוט.
- לסובב את הצינור ב 450 x גרם עבור מינימלית 1 Decant תגובת שיקוע ולאחר מכן להוסיף 10 מ של M9W.
- חזור על שלב 4.5 פעמיים נוספות.
- Resuspend בגדר ביצה שנוצר ב- 3-5 מ של M9W. במקום הצינור על rotator הרכבת התחתית. לאפשר הצינורות לסובב במהירות של 18 סל ד בטמפרטורת החדר (RT) בן לילה.
- למחרת, לסובב את הצינור ב x 450 גרם עבור 1 דקות הצניפה הזחלים L1. להסיר את רוב M9W על ידי השאיפה, כשמאחוריו ~ 250 µL של נוזל בצינור. Resuspend את הזחלים L1, µL מקום 5 שלוש טיפות של המתלה תולעת על גבי צלחת פטרי המכסה, ואז להעריך מספר תולעים לכל µL באמצעות מיקרוסקופ ויבתר.
5. אינדוקציה של RNAi בעיר וורמס
- שימוש סטרילי של לולאה או לבחור, פס החוצה זנים הרצוי של RNAi המכילות חיידקי ממניות קפואים (Ahringer ווידאל ספריות) על גבי פלטות אגר 100 מ"מ x 15 מ"מ LB המכיל 50 carbenicillin µg/mL ו- µg/mL 15 של טטרציקלין. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- לבחור, לחסן של המושבה מבודד מן המתח RNAi הרצוי לתוך צינורות חרוט סטרילי 15 מ"ל, המכיל 2 מ ל LB בתוספת 50 carbenicillin µg/mL. דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 ש ח בחודש תפקודי לב / נשימה-150 סל ד.
- למחרת, התפשטה 150 µL של תרבות מבוגר לילה על 65 מ"מ x 15 מ"מ NGM RNAi צלחות האכלה באמצעות מפזר סטרילי. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- לאפשר את הצלחות להצטנן עד RT לאחר דגירה ב 37 º C. הוסף אמצעי אחסון המתאים של M9W המכיל ~ 200 L1 הזחלים (המתקבל האוכלוסייה סינכרונית גיל של תולעים צעדים) החיידק נזרע RNAi NGM האכלה צלחות. דגירה הצלחות ב- 20 ° C עד הזחלים מגיעים לשלב L4 (~2.5 ימים).
6. הכנה של קבוצה מיטיס Streptococci זיהום
- צובעות את הרצוי זנים של streptococci על 100 מ"מ x 15 מ"מ מלכותך אגר (אם הצלחות היו מאוחסנים ב 4 ° C, לחמם את הצלחות עד 37 ° C לפני ומבטא זנים בהתאמה), ואז דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (~ 18 h) בתוך צנצנת נר מתן של en microaerophilic vironment לצמיחה של streptococci (הלוחות מרוחים ניתן לאחסן במשך שבוע ב 4 ° C).
- להפיץ מבודד קליני של streptococci, השתמש אגר דם סויה tryptic. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך צנצנת נר הלילה (~ 18 h).
- למחרת, להסיר את הלוחות מצנצנת נר ולבחור מושבות המבודד באמצעות לולאה סטרילי. לחסן צינורות חרוט סטרילי 15 מ"ל, המכיל 2 מ ל מרק מלכותך. להפיץ מבודד קליני של streptococci, תוספת של טורקיש איירלייס מרק עם 5% v/v של דם כבשים. סגור את הפקקים חזק, דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים סטטי.
7. הישרדות מבחני
הערה: הצעדים הכרוכים assay זו מתוארת באיור1. כדי להדגים2O H2 הנגזרים מיטיס הקבוצה אחראית על הריגתו של התולעת, תוספת של התקשורת עם קטלאז, או את Δ זן מוטציהspxB , המשלים זן ΔspxB; spxB + של gordonii ס יכול ניתן להשתמש. SpxB מקודד עבור אוקסידאז פירובט, אשר אחראית על הייצור של2O H2 בקבוצה מיטיס.
- לחמם 35 מ"מ x 10 מ"מ מלכותך צלחות 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים 80 µL של תרבויות בוגר לילה של זנים הרצוי של streptococci, להפיץ את החיידק לחלוטין פני אגר, שימוש מפזר סטרילי. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך צנצנת נר הלילה (~ 18 h). בתור פקד, זרע שני 35 מ"מ x 10 מ"מ NGM צלחות עם 80 µL של תרבויות בוגר לילה של e. coli OP50... דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- כדי לוודא2O H2 המיוצר על ידי הקבוצה מיטיס אחראי לרצח של התולעים, להוסיף 50 µL המכיל 1000 יחידות של קטלאז c על גבי טורקיש איירלייס צלחת. להפיץ את הפתרון קטלאז באמצעות מפזר סטרילי ולאפשר את הצלחות להתייבש בזרם שכבתית במשך 30 דקות זרע צלחות לאחר מכן עם זנים סטרפטוקוקוס המתאימים כמתואר בשלב 7.1.
- למחרת, להסיר את הלוחות מצנצנת נר ולאפשר לאסוף הצלחות כדי להתקרר כדי RT למשך 10-15 דקות באמצעות תולעת סטרילי, העברת 30 L4 הזחלים NGM או RNAi NGM להאכלת צלחות סטרפטוקוקוס נזרע את הצלחות. השתמשו בשני נזרע את הצלחות עם סך של 60 תולעים לכל זן של סטרפטוקוקוס. דגירה הלוחות ב 25 º C.
- באמצעות מיקרוסקופ ויבתר, לספור את כמות הזחלים L4 חיה ומתה על כל צלחת-timepoints מספר. בתחילה, להבקיע את התולעים מתה או חיה בכל 30 דקות. לאחר מכן, כאשר תולעים במהירות מתחילים למות, ציון אותם במרווחים של 15 דקות. השתמש האיסוף תולעת סטרילי בעדינות ויפיצו את התולעים ולקבוע אם הם חי או מת. תולעת נחשב מת אם יש תנועה בתגובה ה.
- וזמינותו ייקח 5-6 h כדי להשלים. חזור על הניסוי עוד פעמיים. לאחר השלמת וזמינותו, מאגר הנתונים שתי צלחות. להזנת הנתונים של כל קבוצה, להשוות את עקומות הישרדות, ולבצע ניתוח הישרדות קפלן-מאייר באמצעות תוכנה סטטיסטית.
8. הכנה של רפידות Agarose מיקרוסקופ
- לפזר 2% w/v של agarose במים יונים על-ידי חימום הפתרון במיקרוגל. אמצעי אחסון של 5 מ של פתרון מספיקה להכין 20 שקפים.
- מקל מעבדה הקלטת לאורך שתי שקופיות זכוכית ופורסים. זה יקבע את עובי הידיות agarose. המקום שקופית זכוכית נקי בין שתי שקופיות מוקלט.
- µL מקום 100 של agarose מותכת על המרכז של השקופית נקי. מיד מקום עוד כוס נקי מעל agarose מותכת ולחץ בעדינות כדי להפוך כרית. אפשר את agarose לחזק ולהסיר לאחר מכן השקופית העליונה. משטח agarose הוא מוכן לשימוש.
9. התבוננות לוקליזציה SKN-1 בתגובה לזיהום סטרפטוקוקוס
הערה: הצעדים הכרוכים assay זו מתוארת באיור2. לוקליזציה של SKN-1 נקבע באמצעות המתח תולעת הטרנסגניים SKN-1B/C::GFP. כדי להדגים לוקליזציה של SKN-1 עקב הייצור של H2O2 ע י קבוצת מיטיס, פראי-סוג (WT), ΔspxB, ו את המשלים זן ΔspxB; spxB + של ס' gordonii שימשו. יתר על כן, הלחץ כתב מהונדס SKN-1B/C::GFP ואת טכניקת התערבות RNAi שימשו כדי להדגים כי רכיבים של הנתיב MAPK p38 לווסת הלוקליזציה של SKN-1.
- לחמם 35 מ"מ x 10 מ"מ מלכותך צלחות 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים 80 µL של תרבויות בוגר לילה של זנים הרצוי של סטרפטוקוקוס, להפיץ את החיידק לחלוטין פני אגר, שימוש מפזר סטרילי. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך צנצנת נר הלילה (~ 18 h). בתור פקד, זרע שלוש 35 מ"מ x 10 מ"מ NGM צלחות עם 80 µL של תרבויות בוגר לילה של e. coli OP50... דגירה הצלחות האלה ב 37 ° C עבור ~ 18 h.
- למחרת, להסיר את הלוחות מצנצנת נר ולאפשר את הצלחות כדי להתקרר כדי RT למשך 10-15 דקות לשטוף L4 הזחלים באמצעות M9W מ NGM ואת צלחות האכלה NGM RNAi. לאסוף את התולעים צינורות חרוט 15 מ"ל.
- לסובב את הצינורות ב x 450 גרם עבור 1 מינימלית Decant תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל של M9W.
- חזור על שלב 9.3 שלוש פעמים נוספות.
- Resuspend התולעים ב ~ 250 µL M9W ומקום µL 5 שלוש טיפות של המתלה תולעת על גבי מכסה נקי פטרי, להעריך את מספר תולעים לכל µL באמצעות מיקרוסקופ ויבתר.
- להוסיף ~ 100 L4 הזחלים אחד מלכותך סטרפטוקוקוס נזרע וצלחות NGM החיידק נזרע. השתמש שלוש צלחות לכל זן של חיידקים. דגירה הצלחות במשך 2-3 h ב 25 º C.
- לאחר מכן, להסיר את הלוחות של החממה, לשטוף אותם עם M9W, ולאסוף את התולעים צינורות חרוט 15 מ"ל.
- לשטוף את התולעים 3 x כפי שמתואר צעדים 9.3.
- להסיר את מרבית M9W על ידי השאיפה ולהוסיף 500 µL של M9W המכילה 2 מ מ נתרן אזיד או 2 מ מ tetramisole הידרוכלוריד בגדר תולעת. זה עזים ומתנגד את התולעים, המבטיח כי אין תנועה מתרחשת כאשר תמונה תחת המיקרוסקופ.
התראה: השתמש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) בעת טיפול אזיד הנתרן. להכין את הפתרון אזיד ברדס כימי. - דגירה כדורי תולעת ב RT למשך 15 דקות. ואז, במקום 15 µL של ההשעיה תולעת על גבי משטח agarose מוכן. הנח בעדינות coverslip 1.5 מס מעל משטח agarose המכיל את התולעים anesthetized.
- באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דמיינו הלוקליזציה של SKN-1 ניצול FITC, דאפי מסננים. התמונה תולעים-10 x ו- 20 x הגדלה.
- ציון התולעים בהתבסס על הרמה של לוקליזציה של SKN-1. אין לוקליזציה גרעינית, לוקליזציה של SKN-1B/C::GFP הקדמי או האחורי של התולעת, גרעיני לוקליזציה של SKN-1B/C::GFP בתאי כל מסווגים נמוך, בינוני, וכן רמות גבוהות של לוקליזציה, בהתאמה.
- לאחר הבקיע את micrographs פלורסנט, לקבוע את ההבדלים סטטיסטי על ידי chi-squared ובדיקות של פישר המדויק באמצעות תוכנה סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חברי מיטיס קבוצה מיטיס ס, ס oralis, וס' gordonii במהירות הרג את התולעים, בניגוד mutans ס, ס salivarius, ו פתוגניים שאינם e. coli OP50 (איור 3א). חציון ההישרדות של מיטיס ס, ס oralis, וס' gordonii היה 300 דקות, מינימום 300 ו מין 345, בהתאמה. כדי לקבוע אם הרצח היה מתווך על ידי H2O2, קטלאז היה מצורפים ל מלכותך אגר. הריגתו של התולעים בוטלה בנוכחות קטלאז (איור 3ב). לאשר עוד יותר אם streptococcal נגזר H2O2 מתווכת הריגתו של תולעים, הישרדות על זן מוטציהspxB Δ, WT זן, המשלים זן ΔspxB; spxB + של ס' gordonii נותחו. מותו של התולעים לא נצפתה בδspxB מוטציה המתח בהשוואה להפראי-סוג ולהשלים זנים (איור 3ג'). נתונים אלו מראים2O H2 המיוצר על ידי הקבוצה מיטיס שמתווכת הריגתו של התולעים. הבחנו גם קינטיקה הרג דומה כאשר התולעים נחשפו מבודד קליני של streptococci קבוצה מיטיס המתקבל הדם של חולי סרטן (איור 3ד'). בהתבסס על הנתונים, פתוגניות הנגרמת על ידי H2O2 שמפיק את streptococci קבוצה מיטיס הוערך.
כדי לזהות גנים המארח החיוניים נגד זיהומים streptococcal, skn-1 הופל ארצה, אשר מקודד עבור סטרס חמצוני התגובה שעתוק הגורם C. elegans. לאחר מכן, נמשל ההישרדות ביחס התולעים שליטה מטופלים וקטור. נצפתה ירידה משמעותית ההישרדות של התולעים תמונות ציפורים skn-1 לעומת התולעים שליטה מטופלים וקטור (איור 4א). הנתונים נוספים אומתה באמצעות זן מוטציה skn-1 , הישרדותה הושוותה לזו של התולעים פראי-סוג N2. הבחנו הפנוטיפ הרג דומה כמו החשבונאי skn-1 , כפי שניתן לראות עם נוק-אאוט? skn-1 , הוכחת SKN-1 השפיעו על ההישרדות של התולעים בקבוצה מיטיס (איור 4B).
בשלב הבא, נקבע אם2O H2 המיוצר על ידי הקבוצה מיטיס גרמה לוקליזציה של SKN-1B/C::GFP של התולעים. לוקליזציה של SKN-1B/C::GFP נצפתה ב- worms נחשפים פראי-סוג ואת כתמי המשלים לא בתגובה ΔspxB מוטציה מזן ס' גורדוני (איור 5A, B). יתר על כן, כדי לקבוע את ההפעלה של SKN-1, רכיבים של הנתיב MAPK p38 שהפילו. לוקליזציה מופחתת של SKN-1B/C::GFP בעיר וורמס תמונות ציפורים nsy-1, sek-1, pmk-1, ו- skn-1 ביחס התולעים שליטה מטופלים וקטור נצפתה. הנתונים מציע את ה p38 ש-MAPK נדרש עבור הפעלת SKN-1 בתגובה2O H2 המיוצר על ידי הקבוצה מיטיס (איור 5C, D).
איור 1 : תרשים זרימה המתאר את השלבים הכרוכים בהכנה של מבחני ההישרדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תרשים זרימה המתאר את השלבים הכרוכים בלוקליזציה של SKN-1 במהלך זיהום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 :2O H2-בתיווך הריגתו של C. elegans מיטיס קבוצה streptococci. קפלן-מאייר עקומות הישרדות של הזחלים L4 חשופים (א) ס gordonii, ס oralis, מיטיס ס, ס salivarius, S. mutans, ו e. coli OP50. (B) ס gordonii, ס oralis, מיטיס ס, ס salivarius, mutans ס, ו e. coli OP50 על הצלחות את בנוכחות 1,000 U של קטלאז. (ג) ס gordonii WT, מוטציהspxB Δ וδspxB; spxB + משלימים זנים על הזחלים N2 L4. (ד) Oralis ס (VGS #3), ס' oralis (VGS #4), ס' מיטיס (VGS #10), ס' מיטיס (VGS #13) ו- e. coli OP50. הנתונים הם נציג של ניסויים חזר על שניים או יותר פעמים, עם n = 60 תולעים עבור כל תנאי. קפלן-מאייר יומן ניתוח דרגה שימש כדי להשוות הישרדות עקומות ולחשב חציון ההישרדות. ערכים P < 0.05 נחשבו משמעותיים מבחינה סטטיסטית. איור זה שונה ומותאמים עם הרשאה15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : SKN 1 נדרש להישרדות של התולעים על גורדוני ס. (א) ההישרדות של וקטור שליטה מטופלים ותולעים תמונות ציפורים skn-1 נחשפים ס gordonii. (B) הישרדות של N2 ותולעים מוטציה skn-1(zu67) ניזון ס gordonii. הנתונים הם נציג של ניסויים חזר על שניים או יותר פעמים, עם n = 60 תולעים עבור כל תנאי. קפלן-מאייר יומן ניתוח דרגה שימש כדי להשוות הישרדות עקומות ולחשב חציון ההישרדות. ערכים P < 0.05 נחשבו משמעותיים מבחינה סטטיסטית. איור זה שונה ומותאמים עם הרשאה15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : Streptococcal H2O הפעלת2 מתווכת SKN-1 תלויה מסלול MAPK p38. (א) להחליפן בתמונות של הלוקליזציה של SKN-1B/C::GFP בעיר וורמס חשוף WT, מוטציהspxB Δ וδspxB; spxB + משלים זנים של ס' gordonii. תצלומי מוצגים בפינות העליונות במראות של כל תמונה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) מידת גרעיני לוקליזציה של SKN-1B/C::GFP ואת האחוזים של תולעים בכל קטגוריה ניזונו WT, מוטציהspxB Δ וδspxB; spxB + משלים זנים של ס' gordonii. באופן משמעותי נצפו רמות נמוכות של גרעיני לוקליזציה של SKN-1B/C::GFP ב המוטציהspxB Δ (p < 0.0001) בהשוואה ל- WT וδspxB; spxB + משלים זנים של ס' gordonii. (ג) להחליפן בתמונות של הלוקליזציה של SKN-1B/C::GFP nsy-1, sek-1, pmk-1, נוקאאוט skn-1 ו וקטור שליטה מטופלים תולעים על ס' gordonii. תצלומי מוצגים בפינות העליונות במראות של כל תמונה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ד) את מידת לוקליזציה גרעיני SKN-1B/C::GFP ואת האחוזים של תולעים בכל קטגוריה ניזונו nsy-1, sek-1, pmk-1, נוקאאוט skn-1 ושליטה וקטור יחס תולעים על ס' gordonii. באופן משמעותי נצפו רמות נמוכות של גרעיני לוקליזציה של SKN-1B/C::GFP nsy-1 (0.01 < p), sek-1 (0.001 < p), pmk-1 (p < 0.0001),ו- skn-1 נוקאאוט (p < 0.0001) לעומת וקטור שליטה מטופלים תולעים על ס' gordonii. יותר מ 100 תולעים נחשפים כל זן היו עם תמונה, הניסוי היה חוזר על עצמו שלוש פעמים. איור זה שונה ומותאמים עם הרשאה15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתן להשתמש בשיטות המתוארות חיידקים פתוגניים אחרים כגון Enterococcus faecium, המייצרת גם את2O H2 גדל תחת אנאירובי או microaerophilic תנאים26. בדרך כלל, עבור אורגניזמים פתוגניים ביותר, זה לוקח מספר ימים עד שבועות כדי להשלים את מבחני הישרדות. עם זאת, עקב ייצור חזקות של2O H2 על ידי חברי הקבוצה מיטיס, מבחני אלה יוכלו להסתיים בתוך 5-6 h בתנאים המתוארים. פעולה זו מבטיחה את היכולת מסך מספר מועמדים הגן מעורב חסינות מארח ואת התגובה סטרס חמצוני על פני פרק זמן קצר.
ב פרוטוקול זה, H2O2 מיוצר על ידי החיידקים הוא במגע ישיר עם תאי המעי של התולעת, לעומת מקורות ROS אקסוגני אחרים חייב לחצות מספר מחסומים. פעולה זו מבטיחה כי2O H2 מועבר לתאים מעיים; לפיכך, תגובה הרג יותר חזקים הוא ציין את התולעת. באמצעות חיידקים fluorescently שכותרתו, נקבע כי התולעים חייבת להיות חשופה פתוגנים במשך 30 דקות על מושבת מלאה של מערכת העיכול15. מומלץ להשתמש פחות בן שבוע רצף הצלחות של זנים streptococcal על מנת להבטיח את הכדאיות שלהם ואת היכולת לייצר2O H2. בנוסף, חייבים לגדל זנים streptococcal בתנאים microaerophilic לייצור אופטימלית של H2O2- הזחלים L4 או מבוגרים בן 1 יום יכול לשמש עבור זה וזמינותו. . זה קריטי כי כל התולעים בשימוש ניסוי הם באותו הגיל של סקס תולעים צעירים נוטים למות לאט יותר בהשוואה בוגרים אנדרוגינוסים. L4 בעלי החיים שיבלטו כי הפות המתפתח שלהם מוצגת ב אמצע הגוף כטלאי ברורה שעומדת בניגוד לשאר חלקי הגוף. חשוב גם כי אין OP50 e. coli מועברים אל צלחות סטרפטוקוקוס נזרע. זיהום של הריגת צלחות עם החיידק יכול לגרום את הנחתה או עקירת הריגתו של התולעים. כדי למנוע זיהום, יש צורך לבחור תולעים מן הדשא e. coli . כאשר הבקיע את מבחני הישרדות, מומלץ לבחון את לועיים שאיבה, שיחור מזון התנהגות של ראש, תנועות הגוף. כדי להבטיח כי שהתולעת מתה, מומלץ בעדינות ויפיצו את האף, את הצד של הגוף או זנב ולבחון כל תנועה.
RNAi האכלה והישרדות של התולעים על הקבוצה מיטיס משולבת לזיהוי מועמדים המעורבים בפרשת ההגנה נגד H2O2. שימוש של ג'ין skn-1 מקודד עבור גורם שעתוק התגובה סטרס חמצוני, דרישה שלה על הישרדות של התולעת בתגובה H-2-O-2 הוא המודגמות כאן. לפיכך, assay הזה יכול להיות מותאם למסך עבור מספר גנים ולזהות מועמדים פוטנציאליים הדרושים עבור תגובה סטרס חמצוני, חסינות. RNAi האכלה של התולעים מושגת על-ידי הוספת גיל מסונכרנים L1 הזחלים להוסיף RNAi לבטא מדשאות e. coli . במהלך פרוטוקול סינכרון תולעת, זה חיוני כדי לפקח על פירוק של ציפורנייך תולעת בנוכחות אקונומיקה נתרן הידרוקסידי. הקוטיקולה של בוגרים וזחלים יתמוסס ללא הרף, ואילו העוברים מוגנים חלקית על ידי קליפת עבה. עם זאת, דגירה ממושך בנוכחות המיקס סודיום הידרוקסיד blead עלול לגרום העוברים למות. לכן, חשוב לבחון את הצינור המכיל את התולעים תחת מיקרוסקופ ויבתר מעת לעת במהלך הלבנה. צעד נוסף שיש לקחת בחשבון כאשר פרוטוקול הסינכרון הוא שמירה על הזחלים L1 נעצר. הזחלים נעצר יכול להישמר על מסובב צינור 5 ימים בטמפרטורת החדר. מומלץ להשתמש הזחלים RNAi האכלה בתוך 1-2 ימים לאחר הבקיעה. תחזוקת ממושך M9W עלולה לגרום להיווצרות של השלב dauer.
לבסוף, תולעת הטרנסגניים לבטא SKN-1 דבוקה GFP שימש כדי לפקח על ההפעלה של התגובה סטרס חמצוני בנוכחות הקבוצה מיטיס. זה מוצג על ידי RNAi כי מרכיבי MAPK p38 נדרשים עבור לוקליזציה של SKN-1B/C::GFP כדי הגרעינים של תאי המעי. חשוב להשתמש בשלבים L3 או L4 של זן זה להתבונן לוקליזציה של SKN-1B/C::GFP, לוקליזציה של SKN-1 נוטה להמעיט בשלב למבוגרים. כדאי לצפות הלוקליזציה של SKN-1B/C::GFP, מומלץ לחפוף את התמונות שהושג באמצעות הגדרות המסנן FITC, דאפי. Autofluorescence שנוצר על ידי lipofuscins לעזור לספק ניגוד להשגחה של לוקליזציה SKN-1 בהתולעת. עם זאת, גם הוכח כי האות מכתבים GFP ביטוי בחולשה הוא מוסווה autofluorescence הנפלטת ממקורות שונים בבטן של התולעת. Autofluorescence הוכח עם העלייה בגיל, הוא הגבוה ביותר המעי והרחם של C. elegans27. כדי להתגבר על בעיה זו, מחקר שנערך לאחרונה מנוצל מלכודת מסנן הלהקה טריפל GFP כדי לפקח על הלוקליזציה של SKN-1B/C::GFP C. elegans28. תוכנית התקנה זו מפרידה את האות ה-GFP מן autofluoresence, מציג את ה-GFP ואת autofluoresence בערוצים ירוק וצהוב, בהתאמה.
C. elegans משמש פרוטוקול זה ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ואף לברר איך H2O2 המיוצר על ידי הקבוצה מיטיס גורם פתוגניות. חשוב יותר, באמצעות מודל זה, ההשפעות של H-2-O-2 על מתח רשתי endoplasmic ', ' נזק מיטוכונדריאלי ', ' mitophagy ', autophagy, סטרס חמצוני שניתן ללמוד. יתר על כן, ניתן לזהות מנגנון שבאמצעותו H2O2 פועל כגורם התקפה אלימה להפיק תגובות מערכת החיסון על ידי לשבש תהליכי הליבה של התא. לפיכך, תולעת זו מזוהה כמערכת מודל רב עוצמה עבור גילוי תובנות חדשות פתוגן-פונדקאי אינטראקציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר בינג-יאן וואנג, ד ר ג'ינה Tribble (אוניברסיטת טקסס, בית הספר לרפואת שיניים), ד ר ריצ'רד למונט (אוניברסיטת לואיוויל, בית הספר לרפואת שיניים), ד ר סמואל Shelburne (MD Anderson Cancer Center) עבור מתן מעבדה קלינית זנים של מיטיס קבוצת streptococci. אנו מודים גם ד ר קית בלקוול (במחלקה לגנטיקה, הרוורד) עבור זנים C. elegans . לבסוף, אנו מודים ד ר דניאל Garsin, המעבדה שלה (אוניברסיטת טקסס, מבית הספר לרפואה מקגוורן) לאספקת ריאגנטים וללחצים תולעת לערוך את המחקר. כמה זנים תולעת נמסרו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
