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Developmental Biology

केनोहैबडाइटिस एलिगेंस में माइटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव का अध्ययन

Published: March 23, 2019 doi: 10.3791/59301
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center

Summary

सूत्रकृमि केनोहैबडाइटिस एलिगेंस मेजबान-रोगज़नक़ सहभागिताओं को विभाजित करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । यहां वर्णित एक प्रोटोकॉल के लिए mitis समूह स्ट्रेप्टोकोक्की के सदस्यों के साथ कृमि संक्रमित और एच2ओ2 के खिलाफ oxidative तनाव प्रतिक्रिया के सक्रियण का निर्धारण जीवों के इस समूह द्वारा उत्पादित है ।

Abstract

एक मुक्त रहने वाला सूत्रकृमि, केनोहैबडिटिस एलिगेंस (C. एलिगेंस), होस्ट-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल के रूप में उभरा है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल इस मॉडल का उपयोग करता है के लिए एच2ओ2के उत्पादन के माध्यम से mitis समूह स्ट्रेप्टोकोक्की की वजह से रोगजनन का निर्धारण । मिटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की एक उभरते खतरा है कि इस तरह के जीवाणु, एंडोकार्डिटिस, और कक्षीय सेलुलाइटिस के रूप में कई मानव रोगों का कारण रहे हैं । यहां वर्णित एक प्रोटोकॉल के लिए एच2ओ2 के जवाब में इन कीड़ों के अस्तित्व का निर्धारण करने के लिए रोगजनकों के इस समूह द्वारा उत्पादित है । जीन skn-1 एक oxidative तनाव प्रतिक्रिया ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के लिए एंकोडिंग का उपयोग करना, यह दिखाया गया है कि इस मॉडल को मेजबान जीन है कि स्ट्रेप्टोकोकल संक्रमण के खिलाफ आवश्यक है की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि oxidative तनाव प्रतिक्रिया के सक्रियण इन रोगाणुओं की उपस्थिति में एक ट्रांसजेनिक रिपोर्टर कृमि तनाव का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है, जिसमें SKN-1 ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए किया जाता है । इन assays के लिए oxidative तनाव प्रतिक्रिया का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करने के लिए एच2ओ2 एक जैविक स्रोत द्वारा व्युत्पंन के रूप में exogenously प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) स्रोतों से जोड़ा ।

Introduction

मिटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की oropharyngeal गुहा1के मानव commensals हैं । हालांकि, इन जीवों इस जगह से बच सकते है और आक्रामक2रोगों की एक किस्म का कारण । इन सूक्ष्मजीवों के कारण संक्रमण जीवाणुता, एंडोकार्डिटिस, और कक्षीय सेलुलाइटिस2,3,4,5,6शामिल हैं । इसके अलावा, वे immunocompromised में खून संक्रमण के प्रेरणा एजेंटों के रूप में उभर रहे हैं, neutropenic, और कैंसर रोगियों कि रसायन चिकित्सा5,7,8,9 आया है .

मेकेनिज्म समूह रोगजनन अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट है, क्योंकि कुछ विउलेंस कारकों की पहचान की गई है । mitis समूह एच2ओ2, जो मौखिक माइक्रोबियल समुदायों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है उत्पादन के लिए जाना जाता है10. हाल ही में, कई अध्ययनों एच2ओ2 के लिए एक भूमिका पर प्रकाश डाला है के रूप में एक cytoटॉक्सिन कि उपकला सेल मौत11,12लाती । एस निमोनिया, जो इस समूह के अंतर्गत आता है, एच2ओ2 के उच्च स्तर का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है कि एल्वियोलर कोशिकाओं में डीएनए क्षति और apoptosis को प्रेरित करता है13. एक तीव्र निमोनिया जानवर मॉडल का उपयोग कर, एक ही शोधकर्ताओं ने प्रदर्शन किया है कि एच2ओ2 के उत्पादन बैक्टीरिया एक डाह लाभ प्रदान करता है । न्यूमोकोकल मेनिनजाइटिस पर अध्ययन से यह भी पता चला है कि रोगज़नक़-एच2ओ2 के साथ synergistically न्यूरोनल सेल मौत14ट्रिगर करने के लिए निमोनिया । इन टिप्पणियों स्पष्ट रूप से स्थापित है कि एच2ओ बैक्टीरिया के इस समूह द्वारा उत्पादित2 उनके रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण है ।

मजे की बात यह भी है कि मितिस ग्रुप के एस मिटिस और एस ओरालिस के सदस्यों ने एच2ओ215,16के उत्पादन के माध्यम से सूत्रकृमि सी. एलिगेंस की मृत्यु का कारण दर्शाया है । यह मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि कई जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक सरल, आनुवंशिक रूप से सुविधाजनक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हाल ही में, कीड़ा एक मॉडल के रूप में उभरा है मेजबान के अध्ययन-रोगज़नक़17,18। इसके अलावा, कई अध्ययनों से इस जीव19,20,21का उपयोग कर oxidative तनाव का अध्ययन के महत्व को उजागर किया है । इसके लघु जीवन चक्र, RNAi द्वारा ब्याज की जीन पछाडाडाउन करने की क्षमता, और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग (GFP)-fused के लिए जीन अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए संवाददाताओं विशेषताओं है कि यह एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाने के कुछ कर रहे हैं । इससे भी महत्वपूर्ण बात, मार्ग है कि oxidative तनाव और कृमि में जंमजात प्रतिरक्षा को विनियमित उच्च स्तनधारियों के साथ20,22का संरक्षण कर रहे हैं ।

इस प्रोटोकाल में यह दर्शाया गया है कि स्ट्रेप्टोकॉकल-व्युत्पन्न एच2ओ2के कारण होने वाली रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए सी. एलिगेंस का उपयोग कैसे करें । एक संशोधित अस्तित्व परख दिखाया गया है, और mitis समूह के सदस्यों को तेजी से कीड़े को मारने के लिए एच2ओ2के उत्पादन के माध्यम से कर रहे हैं । माइटिस समूह के सदस्यों का उपयोग, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओज) के एक निरंतर जैविक स्रोत प्रदान की जाती है, के रूप में रासायनिक स्रोतों कि कीड़े में oxidative तनाव पैदा करने के लिए विरोध किया । इसके अलावा, बैक्टीरिया कीड़े तेजी से उपनिवेशित करने में सक्षम हैं, जो एच2ओ2 के लिए अनुमति देता है सीधे आंतों की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए (अन्य स्रोतों है कि कई बाधाओं को पार करने की तुलना में). परख या तो 1) skn-1 उत्परिवर्ती तनाव या 2 के अस्तित्व का निर्धारण द्वारा मांय है) नीचे दस्तक द्वारा skn-1 के कीड़े में Rnai का उपयोग कर N2 जंगली प्रकार और वेक्टर नियंत्रण कीड़े का इलाज किया । skn-1 एक महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शन कारक है जो C. एलिगेंस23,24,25में oxidative तनाव प्रतिक्रिया को नियंत्रित करता है । अस्तित्व assays के अलावा, एक कीड़ा तनाव एक SKN-1B/C:: GFP ट्रांसजेनिक रिपोर्टर को mitis समूह द्वारा एच2ओ2 के उत्पादन के माध्यम से oxidative तनाव प्रतिक्रिया के सक्रियण की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

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Protocol

1. तैयारी तेरी (टोड-हेविट खमीर निकालने की) आगर प्लेट्स

  1. मीडिया के 1 एल के लिए, टोड-हेविट पाउडर के 30 ग्राम, खमीर निकालने के 2 जी और एक 2 एल Erlenmeyer फ्लास्क को आगर के 20 ग्राम जोड़ें । कुप्पी की सामग्री के लिए विआयनीकृत पानी की ९७० मिलीलीटर जोड़ें और एक हलचल पट्टी शामिल हैं । ऑटोक्लेव १२१ डिग्री सेल्सियस के तापमान पर मीडिया और 15 पौंड के दबाव में 30 मिनट के लिए2 / इसके बाद, एक हलचल थाली पर मीडिया सेट और कोमल सरगर्मी के साथ ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. उचित रूप से बाँझ पेट्री व्यंजन आकार में मीडिया डालो (१०० मिमी x 15 मिमी व्यंजन विकास और बैक्टीरिया के रखरखाव के लिए, ३५ मिमी x 10 मिमी व्यंजन हत्या assays के लिए) एक लैमिनर प्रवाह के तहत. मीडिया के लिए अनुमति दें 2 के लिए सूखी स्तरीय हूड के तहत एच । इसके बाद, प्लेट्स को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

2. सूत्रकृमि विकास माध्यम (NGM) और RNAi खिला प्लेट्स (NGM RNAi) की तैयारी

  1. एक हलचल बार का प्रयोग, एक 2 एल erlenmeyer फ्लास्क में विआयनीकृत पानी की ९७० मिलीलीटर में पेप्टोन और 3 जी के nacl के २.५ जी भंग । आगर के 20 ग्राम को मीडिया में जोड़ें । ऑटोक्लेव १२१ डिग्री सेल्सियस और 30 मिनट के लिए 15 पौंड/2 के दबाव के तापमान पर मीडिया. एक हलचल थाली पर मीडिया सेट और कोमल सरगर्मी के साथ ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. NGM प्लेट्स को तैयार करने के लिए मीडिया में निम्नलिखित समाधान जोड़ें: 1 मीटर पोटेशियम फॉस्फेट बफर (pH = ६.०) की 25 मिलीलीटर, 1 मीटर की 1 एमएल MgSO4, 1 मीटर केसीएल की 1 मिलीलीटर2, 1 मिलीलीटर की (5 मिलीग्राम/एमएल में ९५% एथेनॉल) कोलेस्ट्रॉल , 1 मिलीलीटर (इथेनॉल में 10% v/w) nystatin, और एक मिलीलीटर 25 मिलीग्राम/मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन ।
  3. NGM RNAi खिला प्लेट्स की तैयारी के लिए मीडिया के लिए निम्न समाधान जोड़ें: 1 मीटर पोटेशियम फॉस्फेट बफर की 25 मिलीलीटर (pH = ६.०), 1 मीटर MgSO4की 1 मिलीलीटर, 1 m cacl2की 1 मिलीलीटर (5 मिलीग्राम/एमएल में ९५% एथेनॉल) कोलेस्ट्रॉल , 1 मिलीलीटर (एथेनॉल में 10% v/w) nystatin, 1 मिलीलीटर की ५० मिलीग्राम/मिलीलीटर कार्बेन्सिलिन, और आईएम IPTG के 1 मिलीलीटर ।
  4. लेमिनर फ्लो के तहत ६० मिमी x 15 मिमी बाँझ पेट्री व्यंजन में मीडिया डालो । मीडिया के लिए अनुमति दें 2 के लिए सूखी स्तरीय हूड के तहत एच । इसके बाद, प्लेट्स को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है ।

3. सी. एलिगेंस का रखरखाव

  1. प्लेटों के केंद्र में रातोंरात उगाया गया ई. कोलाई OP50 के ५० μl खोलना द्वारा ngm प्लेटों बीज । ई. कोलाई संस्कृति पहले luria में तैयार किया जाता है-bertani (LB) मीडिया और कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । प्लेटों को ढक कर उन्हें एक लेमिनर हुड के नीचे 24 एच के लिए सूखने की अनुमति दें और उसके बाद पॉलीस्टाइरीन कंटेनर में प्लेट्स को स्टोर करें ।
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, 10 से 12 अंडपूर्ण वयस्कों उठाओ एक कृमि उठाओ और एक ई. कोलाई OP50 के लिए कीड़े स्थानांतरण का उपयोग कर ngm प्लेट वरीयता प्राप्त । प्लेटें 20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते ।
  3. अगले दिन, एक कृमि उठाओ और भ्रूण को 20 डिग्री सेल्सियस (~ २.५ दिन) में L4 लार्वा को विकसित करने की अनुमति का उपयोग कर वयस्कों को हटा दें ।

4. कीड़े की उम्र तुल्यकालिक जनसंख्या की तैयारी

  1. M9W का उपयोग कर दो से चार ngm प्लेटों से अंडपूर्ण वयस्कों धोने और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में उन्हें इकट्ठा ।
    1. M9W तैयार करने के लिए: nacl के 3 ग्राम, Na2hpo4के 6 जी, और ख2पो4 के 3 जी गठबंधन और विआयनीकृत पानी की 1 एल की एक अंतिम मात्रा में भंग । ऑटोक्लेव समाधान और 1 एम MgSO4की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. 1 मिनट के लिए ४५० x g पर ट्यूब स्पिन, तो यह सुनिश्चित करना है कि कृमि गोली बरकरार रहता है जबकि supernatant छानना ।
  3. कृमि lysis समाधान तैयार करने के लिए ४०० μL की ८.२५% सोडियम हाइपोक्लोराइट (घरेलू ब्लीच) और 5 एन नाओह की १०० μL जोड़ें । कीड़ा गोली के लिए lysis समाधान जोड़ें और ट्यूब flicking द्वारा सामग्री मिश्रण जब तक ७०% वयस्क कीड़े lysed हैं । किसी विच्छेददर्शी माइक्रोस्कोप के अंतर्गत ट्यूब की सामग्रियों का आवधिक रूप से प्रेक्षण कीजिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंडों का कोई ओवरब्लीचिंग न हो ।
  4. शंक्वाकार ट्यूब की सामग्री के लिए M9W के 10 मिलीलीटर जोड़कर ब्लीच मिश्रण पतला ।
  5. 1 मिनट के लिए ४५० x g पर ट्यूब स्पिन. decant supernatant, तो M9W के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. चरण ४.५ दो बार दोहराएं ।
  7. परिणामस्वरूप अंडा गोली M9W के 3-5 मिलीलीटर में Resuspend । ट्यूब को रोटेटर पर लगाएं । ट्यूब रात को कमरे के तापमान (आरटी) पर 18 rpm की गति से घुमाने के लिए अनुमति देते हैं ।
  8. अगले दिन, 1 मिनट के लिए ४५० x g पर ट्यूब स्पिन L1 लार्वा गोली करने के लिए । आकांक्षा द्वारा M9W के अधिकांश निकालें, पीछे छोड़ ~ तरल के ट्यूब में ~ २५० μL । L1 लार्वा Resuspend और एक पेट्री डिश ढक्कन पर कृमि निलंबन के तीन 5 μL बूंदें जगह है, तो एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रति μL कीड़े की संख्या का अनुमान ।

5. कीड़े में RNAi का प्रेरण

  1. एक बाँझ पाश या लेने का उपयोग करना, जमे हुए शेयरों (Ahringer और विडल पुस्तकालयों) से RNAi युक्त ई. कोलाई के वांछित उपभेदों बाहर लकीर ५० μg/मिलीलीटर कार्बेन्सिलिन और टेट्रासाईक्लिन की 15 μg/मिलीलीटर से युक्त १०० मिमी x 15 मिमी पौंड आगर प्लेटें । प्लेट्स को ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए इनसेबेट कर ।
  2. उठाओ और एक अलग कॉलोनी बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में वांछित rnai तनाव से ५० μg/मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन के साथ पौंड के 2 मिलीलीटर से युक्त संरोपण । १५० rpm पर एक कक्षीय शेखर में 16 ज के लिए ३७ ° c पर ट्यूबों सेते ।
  3. अगले दिन, एक स्प्रेडर का उपयोग करते हुए ६५ मिमी x 15 मिमी NGM RNAi खिला प्लेटों पर रातोंरात उगाई संस्कृति के १५० μL फैल गया । प्लेट्स को ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए इनसेबेट कर ।
  4. प्लेटों को ३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद आर टी को शांत करने की अनुमति दें । M9W की एक उचित मात्रा में जोड़ें ~ २०० L1 लार्वा (कीड़े कदम की आयु तुल्यकालिक जनसंख्या से प्राप्त) ई. कोलाई के लिए बीज Ngm rnai खिला प्लेटें । जब तक लार्वा L4 स्टेज (~ २.५ दिन) तक पहुँच जाते हैं तब तक प्लेट्स को 20 डिग्री सेल्सियस पर सेटे ।

6. संक्रमण के लिए माइटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की की तैयारी

  1. १०० मिमी x 15 मिमी पर स्ट्रेप्टोकोक्की के वांछित उपभेदों बाहर स्ट्रीक (यदि प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया, पूर्व-संबंधित उपभेदों streaking से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए प्लेटें गर्म), तो एक मोमबत्ती जार में रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें (~ 18 एच) एक microaerophilic en प्रदान स्ट्रेप्टोकोक्की के विकास के लिए पर्यावरण (streaked प्लेटों 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है) ।
  2. streptococci के नैदानिक आइसोलेट्स का प्रचार करने के लिए, tryptic सोया रक्त आगर का उपयोग करें । प्लेटें ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मोमबत्ती जार में रात भर (~ 18 एच) ।
  3. अगले दिन, मोमबत्ती जार से प्लेटें हटा दें और एक बाँझ पाश का उपयोग कर अलग कालोनियों उठाओ । 15 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूबों जिसमें से 2 मिलीलीटर तेरा शोरब हो । streptococci के नैदानिक आइसोलेट्स का प्रचार करने के लिए, भेड़ रक्त के 5% v/ बंद कैप्स तंग और स्थिर स्थितियों के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते ।

7. जीवन रक्षा Assays

नोट: इस परख में शामिल कदम चित्रा 1में चित्रित कर रहे हैं । को प्रदर्शित करने के लिए है कि एच2ओ मिटिस समूह द्वारा व्युत्पंन2 O कृमि की हत्या के लिए जिंमेदार है, catalase, या उत्परिवर्ती तनाव δSpxb और पूरक तनाव δ spxb के साथ मीडिया के पूरक; एस gordonii केspxb + कर सकते है किया जा सकता है । एक पायरुवेट oxidase के लिए spxb encodes, जो mitis समूह में एच2ओ2 के उत्पादन के लिए जिंमेदार है ।

  1. पूर्व गर्म ३५ मिमी x 10 मिमी तेरी प्लेटें ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए । स्ट्रेप्टोकोक्की के वांछित उपभेदों की रातोंरात बढ़ी संस्कृतियों के ८० μl जोड़ें और एक स्प्रेडर का उपयोग कर पूरी तरह से आगर सतह भर में बैक्टीरिया फैल गया । प्लेटें ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मोमबत्ती जार में रात भर (~ 18 एच) । एक नियंत्रण के रूप में, ई. कोलाई OP50 के रातोंरात उगाई संस्कृतियों के ८० μl के साथ बीज २ ३५ मिमी x 10 मिमी ngm प्लेटें । प्लेटों को ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात में सेते ।
  2. की पुष्टि करने के लिए कि एच2ओ mitis समूह द्वारा उत्पादित2 कीड़े की हत्या के लिए जिंमेदार है, ५० μl जोड़ें कैटालेज सी की १,००० इकाइयों से तेरी थाली पर । एक बाँझ स्प्रेडर का उपयोग कर कैटालेज समाधान बिखरा हुआ है और प्लेटें 30 मिनट के लिए लैमिना प्रवाह में सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं । इसके बाद प्लेटों को संबंधित स्ट्रेप्टोकोकस उपभेदों के साथ मिलाकर चरण ७.१ में वर्णित किया गया.
  3. अगले दिन, मोमबत्ती जार से प्लेटें हटा दें और प्लेटों 10-15 मिनट के लिए आरटी के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । एक बाँझ कृमि उठाओ का उपयोग करना, 30 L4 लार्वा को NGM या NGM RNAi खिला प्लेटों से स्ट्रेप्टोकोकस तक स्थानांतरित करें, जो आपकी प्लेटों को वरीयता देता है । दो बोये हुए तेरी पट्टियों का उपयोग स्ट्रेप्टोकोकस के कुल ६० कीड़े के साथ करें । प्लेटों को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं ।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप का प्रयोग, कई timepoints पर प्रत्येक थाली पर जीवित और मृत L4 लार्वा की संख्या की गणना । शुरू में, मृत के रूप में कीड़े स्कोर या हर 30 मिनट रहते हैं । इसके बाद, जब कीड़े तेजी से मरने के लिए शुरू, उंहें 15 मिनट के अंतराल पर स्कोर । बाँझ कृमि का उपयोग करने के लिए धीरे कीड़े जुर्रत और निर्धारित अगर वे मर चुके है या जीवित है उठाओ । एक कीड़ा मृत माना जाता है अगर वहां prodding के जवाब में कोई आंदोलन है ।
  5. परख पूरी करने के लिए 5-6 ज लगेगा । प्रयोग को दो बार दोहराएं । परख के पूरा होने के बाद, दो प्लेटों से डेटा पूल । प्रत्येक समूह के डेटा इनपुट, अस्तित्व घटता की तुलना, और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर Kaplan-Meier अस्तित्व विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं ।

8. माइक्रोस्कोपी के लिए Agarose पैड की तैयारी

  1. एक माइक्रोवेव में विलयन को गर्म करके डिआयनीकृत जल में 2% w/ समाधान के 5 मिलीलीटर की मात्रा 20 स्लाइड तैयार करने के लिए पर्याप्त है ।
  2. छड़ी लैब टेप लंबाई दो ग्लास स्लाइड के साथ । यह ऐगेरोस पैड की मोटाई का निर्धारण करेगा । दो टेप स्लाइड के बीच एक साफ गिलास स्लाइड प्लेस ।
  3. साफ स्लाइड के केंद्र पर पिघला हुआ ऐगेरोस के १०० μl प्लेस । तुरंत पिघला हुआ ऐगेरोस के शीर्ष पर एक और साफ गिलास जगह और धीरे से नीचे प्रेस के लिए एक पैड बनाने के लिए । अग्रोसे को जमना और बाद में ऊपर की स्लाइड को हटाने की अनुमति दें । ऐगेरोस पैड उपयोग के लिए तैयार है ।

9. SKN-1 स्थानीयकरण स्ट्रेप्टोकोकस संक्रमण के जवाब में अवलोकन

नोट: इस परख में शामिल कदम चित्रा 2में चित्रित कर रहे हैं । skn-1 का स्थानीयकरण SKN-1B/C:: GFP ट्रांसजेनिक कृमि तनाव का उपयोग करके निर्धारित किया गया था । माइटिस समूह द्वारा एच2ओ2 के उत्पादन के कारण skn-1 के स्थानीयकरण को प्रदर्शित करने के लिए, जंगली-प्रकार (Wt), Δspxb, और पूरक तनाव δspxb; एस गोर्डोनिई के एसएक्सबी + का उपयोग किया गया । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक रिपोर्टर तनाव SKN-1B/C:: GFP और RNAi हस्तक्षेप तकनीक p38 MAPK मार्ग के घटकों को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया गया था SKN-1 के स्थानीयकरण को विनियमित ।

  1. पूर्व गर्म ३५ मिमी x 10 मिमी तेरी प्लेटें ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए । स्ट्रेप्टोकोकस के वांछित उपभेदों की रातोंरात बढ़ी संस्कृतियों के ८० μl जोड़ें और एक स्प्रेडर का उपयोग कर पूरी तरह से आगर सतह भर में बैक्टीरिया फैल गया । प्लेटें ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मोमबत्ती जार में रात भर (~ 18 एच) । एक नियंत्रण के रूप में, ई. कोलाई OP50 के रातोंरात उगाई संस्कृतियों के ८० μl के साथ बीज ३ ३५ मिमी x 10 मिमी ngm प्लेटें । इन प्लेटों को ३७ डिग्री सेल्सियस पर ~ 18 ज के लिए सेटे ।
  2. अगले दिन, मोमबत्ती जार से प्लेटें हटा दें और प्लेटों 10-15 मिनट के लिए आरटी के लिए शांत करने की अनुमति । धोने L4 लार्वा NGM और NGM RNAi खिला प्लेटों से M9W का उपयोग कर । 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में कीड़े ले लीजिए ।
  3. 1 मिनट के लिए ४५० x g पर ट्यूबों स्पिन. decant supernatant और M9W के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. चरण ९.३ तीन बार दोहराएं ।
  5. M9W के ~ २५० μL में कीड़े Resuspend और एक साफ पेट्री डिश ढक्कन पर कृमि निलंबन के तीन 5 μL बूंदें जगह और एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रति μL कीड़े की संख्या का अनुमान है ।
  6. जोड़ें ~ १०० L4 लार्वा प्रत्येक के लिए तेरा स्ट्रेप्टोकोकस वरीयता प्राप्त और ngm ई. कोलाई बीज प्लेटें । बैक्टीरिया के तनाव के प्रति तीन प्लेटों का प्रयोग करें । 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 से 3 एच के लिए प्लेटें सेते ।
  7. उसके बाद, मशीन से प्लेट हटा दें, M9W के साथ उन्हें धोने, और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में कीड़े इकट्ठा ।
  8. चरण ९.३ में वर्णित के रूप में कीड़े 3x धोने ।
  9. आकांक्षा द्वारा M9W के अधिकांश निकालें और कृमि गोली के लिए 2 मिमी सोडियम ऐज़ाइड या 2 मिमी tetramisole हाइड्रोक्लोराइड युक्त M9W के ५०० μl जोड़ें । इस कीड़े को निश्चेतक, यह सुनिश्चित करना होगा कि कोई आंदोलन तब होता है जब माइक्रोस्कोप के नीचे imaged ।
    चेतावनी: सोडियम azide हैंडलिंग जब व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (PPE) का उपयोग करें । एक रासायनिक हुड के तहत ऐज़ाइड समाधान तैयार करते हैं ।
  10. 15 मिनट के लिए आरटी पर कृमि छर्रों सेते । फिर, एक तैयार ऐगेरोस पैड पर कृमि निलंबन के 15 μl स्पॉट । धीरे अग्रासे पैड पर कोई १.५ coverslip जगह ऊपर कीड़े युक्त ।
  11. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का प्रयोग, SKN के स्थानीयकरण-1 FITC और DAPI फिल्टर का उपयोग कल्पना । 10x और 20x magnifications पर छवि कीड़े ।
  12. SKN-1 के स्थानीयकरण के स्तर पर आधारित कीड़े स्कोर । कोई नाभिकीय स्थानीयकरण, SKN-1B/C का स्थानीयकरण:: कृमि के पूर्वकाल या पश् चवर्ती में जीएफपी, और SKN-1B/C का नाभिकीय स्थानीयकरण:: सभी आंत्र कोशिकाओं में जीएफपी को क्रमशः निम्न, मध्यम और उच्च स्तर के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं ।
  13. फ्लोरोसेंट micrographs स्कोरिंग के बाद, ची द्वारा सांख्यिकीय मतभेदों को निर्धारित-चुकता है और फिशर सटीक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परीक्षण ।

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Representative Results

मिटिस समूह के सदस्यों के एस mitis, एस oralis, और एस gordonii तेजी से कीड़े मारे गए, के रूप में एस mutans, एस सालिवरियस, और गैर रोगजनक ई. कोलाई OP50 (चित्रा 3ए) । एस मिटिस, एस oralis, और एस gordonii के लिए औसत अस्तित्व ३०० मिनट, ३०० मिनट, और ३४५ मिनट, क्रमशः था । अगर हत्या एच2ओ2, कैटालेज द्वारा मध्यस्थता की गई थी यह निर्धारित करने के लिए तेरा आगर को पूरक था । कीड़े की हत्या कैटालेज (चित्रा 3बी) की उपस्थिति में समाप्त हो गया था । आगे की पुष्टि करने के लिए कि क्या स्ट्रेप्टोकोकल ली गई एच2ओ2 मध्यस्थता कीड़े की हत्या, δSPXB उत्परिवर्ती तनाव, Wt तनाव, और पूरक तनाव δ Spxb पर अस्तित्व; एस gordonii केspxb + विश्लेषण किया गया था । कीड़े की मौत ΔSpxb उत्परिवर्ती तनाव पर जंगली प्रकार और पूरक उपभेदों (चित्रा 3सी) की तुलना में नहीं देखा गया था । इन आंकड़ों से पता चलता है कि मिटिस समूह द्वारा उत्पादित एच2ओ2 कीड़े की हत्या मध्यस्थता करता । हम भी इसी तरह की हत्या कैनेटीक्स मनाया जब कीड़े मिटिस समूह के नैदानिक आइसोलेट्स को उजागर किया गया स्ट्रेप्टोकोक्की कैंसर रोगियों के रक्त से प्राप्त (चित्रा 3डी) । आंकड़ों के आधार पर, एच2ओ2 के कारण होने वाली रोगजनकता को माइटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की द्वारा उत्पादित किया गया था ।

स्त्रेप्तोकोच्कल संक्रमण के खिलाफ आवश्यक है कि मेजबान जीन की पहचान करने के लिए, skn-1 नीचे दस्तक दी थी, जो सी. elegans में oxidative तनाव प्रतिक्रिया ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के लिए encodes । फिर, वेक्टर नियंत्रण इलाज कीड़े के सापेक्ष अस्तित्व की तुलना में किया गया था । वेक्टर नियंत्रण इलाज कीड़े (चित्रा 4ए) की तुलना में skn-1 पछाड़ना कीड़े के अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई । यह डेटा आगे एक skn-1 उत्परिवर्ती तनाव का उपयोग कर मांय किया गया था, और इसके अस्तित्व की तुलना में था N2 जंगली प्रकार के कीड़े । हम skn-1 उत्परिवर्ती के रूप में एक समान हत्या phenotype मनाया, के रूप में skn-1 knockdown के साथ देखा, प्रदर्शन है कि skn-1 मिटिस समूह (चित्रा 4बी) पर कीड़े के अस्तित्व को प्रभावित किया ।

अगला, यह निर्धारित किया गया था कि क्या मिटिस समूह द्वारा उत्पादित एच2ओ2 के कारण skn-1b/C के स्थानीयकरण: कीड़े में gfp । SKN-1B/C का स्थानीयकरण:: GFP जंगली प्रकार के संपर्क में कीड़े में पाया गया था और दाग और एस gordonii के Δspxb उत्परिवर्ती तनाव के जवाब में नहीं (चित्रा 5A, B) । इसके अलावा, SKN-1 के सक्रियण का निर्धारण करने के लिए, p38 MAPK मार्ग के घटक नीचे खटखटाया गया । SKN-1B/C के स्थानीयकरण में कमी:: nsy-1, sek-1, pmk-1 , और skn-1 में एक-एक पछाड़ें कीड़े वेक्टर नियंत्रण इलाज कीड़े के सापेक्ष में gfp मनाया गया । डेटा पता चलता है p38 MAPK के सक्रियकरण के लिए आवश्यक है SKN-1 के जवाब में एच2ओ2 के द्वारा उत्पादित Mitis समूह (चित्रा 5सी, डी).

Figure 1
चित्रा 1 : फ़्लोचार्ट अस्तित्व assays की तैयारी में शामिल कदम का चित्रण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : फ्लो चार्ट संक्रमण के दौरान SKN-1 के स्थानीयकरण में शामिल चरणों का चित्रण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : एच2ओ2-mediated mitis समूह streptococci द्वारा सी. एलिगेंस की हत्या । (क) एस. गोर्डोनी, एस. ओरालिस, एस मिटिस, एस सालिवेरियस, एस मुटंस , और ई. कोलाई OP50 के संपर्क में L4 लार्वा का कापलान-मीयर जीवन (ब) एस गोर्डोनी, एस. ओरालिस, एस. माइटिस, एस सालिवेरियस, एस मुटन, और ई. कोलाई OP50 की उपस्थिति में तेरी प्लेटों पर कैटलेस की १,००० यू. (ग) एस गोर्डोनी -डब्ल्यूटी, δएसएक्सबी उत्परिवर्ती, और δएसएक्सबी; सक्सब + द2 L4 लार्वा पर उपभेदों का पूरक है । (घ)   एस oralis (vgs # 3), एस oralis (vgs # 4), एस mitis (# 10 vgs), एस mitis (# 13 vgs), और ई. कोलाई OP50 । डेटा दो या अधिक बार दोहराया प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, प्रत्येक शर्त के लिए n = ६० कीड़े के साथ. Kaplan-Meier लॉग रैंक विश्लेषण अस्तित्व घटता तुलना और औसत अस्तित्व की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । P मान < ०.०५ सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माने जाते थे । यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ अनुकूलित15। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : Skn-1 कीड़े के अस्तित्व के लिए आवश्यक है पर एस गोरडोनीने की। (क) एस गोर्डोनीके संपर्क में आने वाले वेक्टर नियंत्रण उपचारित और skn-1 पछाड़ें कृमि का अस्तित्व । (ख) एस गोर्डोनीपर छ2 और skn-1(zu67) उत्परिवर्ती कृमि की उत्तरजीविता । डेटा दो या अधिक बार दोहराया प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, प्रत्येक शर्त के लिए n = ६० कीड़े के साथ. Kaplan-Meier लॉग रैंक विश्लेषण अस्तित्व घटता तुलना और औसत अस्तित्व की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । P मान < ०.०५ सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माने जाते थे । यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ अनुकूलित15। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : स्ट्रेप्टोकोकल एच2ओ2 के मध्यस्थता सक्रियण skn-1 p38 mapk मार्ग पर निर्भर है । (क) skn-1B/C के स्थानीयकरण के प्रतिनिधि चित्र:: कीड़े में GFP Wt, δspxb उत्परिवर्ती, और δ spxb के संपर्क में; एस. गोर्डोनिईकेएसएक्सबी + पूरक उपभेदों । Closeups प्रत्येक छवि के ऊपरी righthand कोनों में दिखाए जाते हैं । स्केल बार = १०० μm । (ख) skn-1B/C के नाभिकीय स्थानीयकरण की मात्रा: जीएफपी और प्रत्येक श्रेणी में वॉर्म का प्रतिशत, जो डब्ल्यूटी, δएसएक्सबी उत्परिवर्ती, और δ एसएक्सबी पर खिलाया जाता है; एस गोर्डोनीकेएसपीएक्सबी + पूरक उपभेदों । SKN-1B/C के नाभिकीय स्थानीयकरण का काफ़ी निम्न स्तर:: जीएफपी को डब्ल्यूटी और Δ एसएक्सबी की तुलना में Δspxb उत्परिवर्ती (p < ०.०००१) में देखा गया; एस. गोर्डोनीकेएसएक्सबी + पूरक उपभेदों. (c) Skn-1B/C के स्थानीयकरण की प्रतिनिधि छवियां:: nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 पछाड़ें, और S. gordoniiपर वेक्टर नियंत्रण उपचार कीड़े में gfp । Closeups प्रत्येक छवि के ऊपरी righthand कोनों में दिखाए जाते हैं । स्केल बार = १०० μm. (घ) skn-1b/C:: gfp नाभिकीय स्थानीयकरण और प्रत्येक श्रेणी में कीड़े का प्रतिशत nsy-1, sek-1, pmk-1, skn- 1 पछाड़ें, और वेक्टर नियंत्रण इलाज पर फेड की डिग्री एस gordoniiपर कीड़े । skn-1b/C के नाभिकीय स्थानीयकरण का काफ़ी निम्न स्तर:: gfp को nsy-1 (p < ०.०१), sek-1 (p < ०.००१), pmk-1 (p < ०.०००१),और skn-1 पछाड़ना (p < ०.०००१) में वेक्टर की तुलना में देखा गया एस gordoniiपर इलाज कीड़े नियंत्रण । १०० से अधिक कीड़े प्रत्येक तनाव से अवगत कराया imaged थे, और प्रयोग तीन बार दोहराया गया था । यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ अनुकूलित15। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वर्णित तरीकों एंटेरोकोकस faeciumके रूप में अंय रोगजनक बैक्टीरिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो भी एच2ओ2 अवायवीय या microaerophilic शर्तों26के तहत हो उत्पादन । आमतौर पर, सबसे रोगजनक जीवों के लिए, यह जीवन रक्षा assays को पूरा करने के लिए हफ्तों के लिए कई दिन लगते हैं । तथापि, एमआईटीआई समूह के सदस्यों द्वारा एच2ओ2 के दमदार उत्पादन के कारण इन assays को वर्णित शर्तों के तहत 5-6 एच के भीतर पूरा किया जा सका । यह कई जीन मेजबान प्रतिरक्षा में शामिल उंमीदवारों और एक कम समय अवधि में oxidative तनाव प्रतिक्रिया स्क्रीन करने की क्षमता सुनिश्चित करता है ।

इस प्रोटोकॉल में, एच2ओ2 बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित कृमि की आंतों की कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में है, के रूप में अंय बहिर्जात ROS सूत्रों का विरोध किया है कि कई बाधाओं को पार करना चाहिए । यह सुनिश्चित करता है कि एच2ओ2 आंत्र कोशिकाओं को दिया जाता है; अतः कृमि में अधिक मजबूत हत्या की प्रतिक्रिया पाई जाती है । प्रतिदीप् त लेबल बैक्टीरिया का प्रयोग, यह निर्धारित किया गया था कि कीड़े आंत्र पथ15के पूर्ण औपनिवेशीकरण के लिए 30 मिनट के लिए रोगजनकों को उजागर किया जाना चाहिए । यह से कम 1 सप्ताह स्त्रेप्तोकोच्कल उपभेदों के पुराने लकीर प्लेटों का उपयोग करने के लिए उनकी व्यवहार्यता और एच2ओ2उत्पादन की क्षमता सुनिश्चित करने की सलाह दी है । इसके अलावा, स्त्रेप्तोकोच्कल उपभेदों एच2ओ 2 के इष्टतम उत्पादन के लिए microaerophilic शर्तों के तहत उगाया जाना चाहिए। L4 लार्वा या 1 दिन पुराने वयस्कों इस परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह महत्वपूर्ण है कि एक प्रयोग में प्रयुक्त सभी कीड़े एक ही उंर और सेक्स कर रहे हैं । युवा कीड़े अधिक धीरे से पुराने उभयलिंगी की तुलना में मर जाते हैं । L4 जानवरों को और अधिक आसानी से प्रतिष्ठित कर रहे हैं क्योंकि उनके विकासशील योनी शरीर के बाकी के साथ विरोधाभासों कि एक स्पष्ट पैच के रूप में मध्य शरीर पर दिखाई दे रहा है । यह भी महत्वपूर्ण है कि कोई ई. कोलाई OP50 स्ट्रेप्टोकोकस वरीयता प्राप्त प्लेटों को हस्तांतरित कर रहे हैं । E. कोलाई के साथ हत्या प्लेटों के संदूषण क्षीणन या कीड़े की हत्या के निराकरण के कारण हो सकता है । संदूषण से बचने के लिए, यह ई. कोलाई लॉन से कीड़े दूर लेने के लिए आवश्यक है । जब अस्तित्व assays स्कोरिंग, यह ग्रसनी पम्पिंग, सिर के व्यवहार foraging, और शरीर आंदोलन का पालन करने की सलाह दी है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि कीड़ा मर गया है, यह धीरे से नाक की जुर्रत करने के लिए सिफारिश की है, शरीर की ओर, या पूंछ और किसी भी आंदोलन का पालन.

RNAi खिला और मिटिस समूह पर कीड़े के अस्तित्व के लिए उंमीदवारों कि एच2ओ2के खिलाफ रक्षा में शामिल है पहचान संयुक्त था । जीन skn-1 कि एक oxidative तनाव प्रतिक्रिया ट्रांसक्रिप्शन कारक के लिए Encodes का उपयोग करना, एच2ओ2 के जवाब में कृमि के अस्तित्व के लिए अपनी आवश्यकता यहां का प्रदर्शन किया है। इसलिए, इस परख कई जीन के लिए स्क्रीन अनुकूलित किया जा सकता है और संभावित oxidative तनाव प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा के लिए आवश्यक उंमीदवारों की पहचान । कीड़े की RNAi खिला RNAi व्यक्त ई. कोलाई लॉन के लिए आयु सिंक्रनाइज़ L1 लार्वा जोड़कर प्राप्त की है । कृमि तुल्यकालन प्रोटोकॉल के दौरान, यह ब्लीच और सोडियम हाइड्रॉक्साइड की उपस्थिति में कृमि cuticles के lysis की निगरानी करने के लिए आवश्यक है । वयस्कों और लार्वा के क्यूटिकल लगातार भंग हो जाएगा, जबकि भ्रूण आंशिक रूप से मोटी eggshell द्वारा संरक्षित कर रहे हैं । हालांकि, blead सोडियम हाइड्रॉक्साइड मिश्रण की उपस्थिति में लंबे समय तक ऊष्मायन भ्रूण मरने के लिए कारण हो सकता है । इसलिए, ब्लीचिंग के दौरान आवधिक रूप से विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कीड़े युक्त ट्यूब का निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है । एक और कदम तुल्यकालन प्रोटोकॉल में विचार करने के लिए गिरफ्तार L1 लार्वा के रखरखाव है । गिरफ्तार लार्वा को कमरे के तापमान पर 5 दिनों के लिए ट्यूब रोटेटर पर रखा जा सकता है । यह सलाह दी जाती है कि लार्वा को हैचिंग के बाद 1 से 2 दिनों के भीतर रनाई खिलाने के लिए इस्तेमाल करें । M9W में लंबे समय तक रखरखाव dauer चरण के गठन में परिणाम कर सकते हैं ।

अंत में, एक ट्रांसजेनिक कृमि को व्यक्त करने के लिए GFP-1 का उपयोग किया गया था, जो कि एमआईटीआई समूह की उपस्थिति में ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया के सक्रियण को मॉनीटर करने के लिए प्रयुक्त था । यह RNAi द्वारा दिखाया गया है कि p38 MAPK के घटक SKN-1B के स्थानीयकरण के लिए आवश्यक हैं:: GFP आंत्र कोशिकाओं के नाभिक करने के लिए. SKN-1B/C:: GFP का स्थानीयकरण देखने के लिए इस विकृति के L3 या L4 चरणों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है क्योंकि SKN-1 का स्थानीयकरण वयस्क अवस्था में कम हो जाता है । SKN-1B/C के स्थानीयकरण का बेहतर निरीक्षण करने के लिए:: GFP, यह FITC और DAPI फ़िल्टर सेटिंग्स का उपयोग कर प्राप्त छवियों पर ओवरलैप करने के लिए सलाह दी जाती है । लिपोफ्यूसिन द्वारा उत्पन्न ऑटोफ्लोरेंस मदद कृमि में SKN-1 स्थानीयकरण के अवलोकन के लिए कंट्रास्ट प्रदान करते हैं । तथापि, यह भी दर्शाया गया है कि कमजोर जीएफपी रिपोर्टरों से सिगनल कृमि के आंत में विभिन्न स्त्रोतों द्वारा उत्सर्जित ऑटोफ्लोरेंस द्वारा मास्क किया जाता है । स्वप्रतिदीप्ति उम्र के साथ वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है और आंत और C. एलिगेंस27के गर्भाशय में सबसे अधिक है. इस समस्या से उबरने के लिए, हाल ही के एक अध्ययन में skn-1b/c के स्थानीयकरण की निगरानी करने के लिए ट्रिपल बैंड gfp फ़िल्टर सेटअप का उपयोग किया गया:: gfp c. एलिगेंसमें28. इस सेटअप GFP संकेत autofluoresence से अलग करता है, क्रमशः हरे और पीले रंग के चैनलों में GFP और ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित ।

C. एलिगेंस इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने और पता लगाने के कैसे एच2ओ2 मिटिस समूह द्वारा उत्पादित रोगजनन का कारण बनता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस मॉडल का उपयोग करके, अंतर्द्रव्यी लाक्षणिक तनाव पर एच2ओ2 के प्रभाव, mitochondrial क्षति, mitophagy, autophagy, और oxidative तनाव का अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, तंत्र है जिसके द्वारा एच2ओ2 एक विलक्षणीय कारक के रूप में कार्य करता है कोशिका की कोर प्रक्रियाओं को बाधित द्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने की पहचान की जा सकती है । इसलिए, इस कीड़ा मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत में नए अंतर्दृष्टि की खोज के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली के रूप में पहचाना जाता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम डॉ बिंग-यान वांग, डॉ Gena Tribble धंयवाद (टेक्सास विश्वविद्यालय, दंत चिकित्सा के स्कूल), डॉ रिचर्ड Lamont विश्वविद्यालय (Louisville, दंत चिकित्सा के स्कूल), और Dr. शमूएल शेलब्रने (एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र) के लिए प्रयोगशाला और नैदानिक उपभेदों प्रदान करने के लिए मिटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की । C. एलिगेंस उपभेदों के लिए हम भी डॉ कीथ ब्लैकवेल (आनुवंशिकी विभाग, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) का शुक्र है । अंत में, हम डॉ डेनिएल Garsin और उसकी प्रयोगशाला धंयवाद (टेक्सास विश्वविद्यालय, McGovern मेडिकल स्कूल) अभिकर्मकों और कृमि उपभेदों प्रदान करने के लिए अध्ययन का संचालन । कुछ कृमि उपभेदों CGC, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and chemicals
Agarose  Sigma Aldrich A9539-50G
Bacto peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Broth Fisher Scientific DF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated   Fisher Scientific B11947
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood) Fisher Scientific R01200
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Carbenicillin Fisher Scientific BP26481
Catalase  Sigma Aldrich C1345-1G
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
IPTG Fisher Scientific MP21021012
Magnesium sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-500
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
Tetracyclin Sigma Aldrich 87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochloride Sigma Aldrich L9756
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 
Consumables 
15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL Fisher Scientific 07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) Fisher Scientific 08-757-100A
No. 1.5  18 mm x 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis  
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
N2 C. elegans wild isolate CGC
EU1 skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) CGC
LD002 IdIs1 SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) Keith Blackwell

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान निर्गम १४५ केनोहैबडाइटिस एलिगेंस स्ट्रेप्टोकोक्की ऑक्सीडेटिव तनाव skn-1 हाइड्रोजन पेरोक्साइड जीएफपी
<em>केनोहैबडाइटिस एलिगेंस</em> में माइटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव का अध्ययन
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Naji, A., Al Hatem, A., van der Hoeven, R. Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59301, doi:10.3791/59301 (2019).

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