Summary
Rundormer Caenorhabditis elegans er en utmerket modell å dissekere vert-patogen interaksjoner. Beskrevet her, er en protokoll for å infisere ormen med medlemmer av mitis gruppe streptococci og fastsette aktivisering av oksidativt stressrespons mot H2O2 produsert av denne gruppen av organismer.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), et frittlevende nematode, har dukket opp som en attraktiv modell å studere vert-patogen interaksjoner. Presentert protokollen bruker denne modellen til å bestemme virusets forårsaket av mitis gruppe streptococci via produksjon av H2O2. Mitis gruppe streptococci er en trussel som forårsaker mange menneskelige sykdommer som bacteremia, endokarditt og orbital cellulitt. Beskrevet her er en protokoll for å bestemme overlevelse av disse ormene svar til H2O2 produsert av denne gruppen av patogener. Bruker genet skn-1 koding for en oksidativt stress respons transkripsjon faktor, er det vist at denne modellen er viktig for å identifisere vert gener som er viktige mot streptokokk infeksjoner. Videre er det vist at aktivering av oksidativt stressrespons kan overvåkes i nærvær av disse patogener med en transgene reporter ormen belastning, der SKN-1 er smeltet grønne fluorescerende protein (GFP). Disse analyser gir mulighet til å studere oksidativt stressrespons til H2O2 avledet av noen biologiske i motsetning til exogenously lagt reaktive oksygen arter (ROS) kilder.
Introduction
Mitis gruppe streptococci er menneskelige commensals av orofaryngeal hulrom1. Men kan disse organismene unnslippe denne nisje og forårsaker en rekke invasive sykdommer2. Infeksjoner forårsaket av disse mikroorganismer inkluderer bacteremia, endokarditt og orbital cellulitt,2,,3,,4,,5,,6. Videre de dukker opp som forårsaker agenter av blodbanen infeksjoner i immunsupprimerte, neutropenic og pasienter som har gjennomgått kjemoterapi5,7,8,9 .
Mekanismene underliggende mitis gruppe patogenesen er obskure, fordi noen virulens faktorer har blitt identifisert. Gruppen mitis er kjent for å produsere H2O2, som har vist seg for å spille en viktig rolle i oral mikrobielle samfunn10. Flere studier har nylig merket en rolle for H2O2 som en cytotoxin som induserer epithelial celle død11,12. S. lungebetennelse, som tilhører denne gruppen, har vist seg å produsere høye nivåer av H2O2 som induserer DNA skade og apoptose i alveolar celler13. Bruker en akutt lungebetennelse dyremodell, viste samme forskerne at produksjonen av H2O2 av bakterier gir en virulens fordel. Studier på pneumokokk hjernehinnebetennelse har også vist at patogen-avledet H2O2 fungerer synergi med pneumolysin å utløse neuronal celle død14. Disse observasjonene klart å etablere at H2O2 produsert av denne gruppen av bakterier er viktig for deres virusets.
Interessant, har det også vist at medlemmer av mitis gruppe S. mitis og S. oralis forårsake død Rundormer C. elegans via produksjon av H2O215,16. Denne frittlevende Rundormer har blitt brukt som en enkel, genetisk medgjørlig modell for å studere mange biologiske prosesser. Ormen har nylig dukket opp som en modell å studere vert-patogen interaksjoner17,18. I tillegg har flere studier understreket viktigheten av å studere oksidativt stress bruker denne organismen19,20,21. Den korte livssyklusen, evne til å pusse gener av interesse ved RNAi, og bruk av grønne fluorescerende protein (GFP)-smeltet journalister å overvåke genuttrykk er noen av attributtene som gjør det et attraktivt modellsystem. Enda viktigere, er veier som regulerer oksidativt stress og medfødt immunitet i ormen svært bevart med pattedyr20,22.
I denne protokollen, skal vi se hvordan å bruke C. elegans å belyse virusets skyldes streptokokk-avledet H2O2. En modifisert overlevelse analysen vises, og medlemmer av gruppen mitis er kjøpedyktig drepe ormer raskt via produksjon av H2O2. Ved hjelp av medlemmer av gruppen mitis, en vedvarende biologiske kilde til reaktive oksygen arter er (ROS) gitt, i motsetning til kjemiske kilder som induserer oksidativt stress i ormer. Videre kan bakterier kolonisere ormer, hvilke innrømmer for H2O2 å rettes direkte mot intestinal cellene (i forhold til andre kilder som må krysse flere barrierer). Analysen valideres enten 1) for å bestemme overlevelse skn-1 mutert stamme eller 2) ved å banke ned skn-1 bruker RNAi i ormer i forhold til N2 vill-type og vektor kontroll behandlet ormer. SKN-1 er en viktig transkripsjon faktor som regulerer oksidativt stressrespons i C. elegans23,24,25. I tillegg til overlevelse analyser brukes en orm belastning uttrykke SKN-1B/C::GFP transgene reporter overvåke aktivering av oksidativt stress respons via produksjon av H2O2 av gruppen mitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av din (Todd-Hewitt gjærekstrakt) Agar plater
- 1 L media, legge 30 g av Todd-Hewitt pulver, 2 g gjærekstrakt og 20 g agar til en 2 L Erlenmeyer kolbe. Legg 970 mL deionisert vann innholdet i flasken og inkluderer en røre bar. Autoclave media ved en temperatur på 121 ° C og presset av 15 lb/tomme2 for 30 min. Deretter angi media på en røre plate og gi kjøling med mild omrøring.
- Hell media i riktig størrelse sterilt Petri retter (100 x 15 mm retter for vekst og vedlikehold av bakterier, 35 x 10 mm retter for å drepe analyser) under en laminær strømning. Kan media tørke 2t under laminær panseret. Platene kan deretter lagres på 4 ° C for 1 måned.
2. forberedelse av Rundormer vekst Medium (NGM) og RNAi fôring plater (NGM RNAi)
- Bruker en røre bar, løses 2.5 g pepton og 3 g av NaCl i 970 mL deionisert vann i en 2 L Erlenmeyer kolbe. Legge til 20 g agar media. Autoclave media ved en temperatur på 121 ° C og presset av 15 lb/tomme2 for 30 min. satt media på en røre plate og gi kjøling med mild omrøring.
- Legg til følgende løsninger i media for utarbeidelse av NGM plater: 25 mL 1 M kalium fosfat bufferen (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL av (5 mg/mL i 95% etanol) kolesterol , 1 mL av (10% v/w i etanol) nystatin og 1 mL av 25 mg/mL streptomycin.
- Legg til følgende løsninger i media for utarbeidelse av NGM RNAi fôring plater: 25 mL 1 M kalium fosfat bufferen (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL av (5 mg/mL i 95% etanol) kolesterol , 1 mL av (10% v/w i etanol) nystatin, 1 mL av 50 mg/mL carbenicillin og 1 mL av IM IPTG.
- Hell media i 60 x 15 mm sterilt Petri retter under laminær strømning. Kan media tørke 2t under laminær panseret. Platene kan deretter lagres på 4 ° C for 1 måned.
3. vedlikehold C. elegans
- Frø NGM platene av småblødninger 50 µL av overnatting vokst E. coli OP50 i midten av platene. E. coli kulturen er utarbeidet tidligere i Luria-Bertani (LB) media og lagret på 4 ° C i flere måneder. Dekk platene og la dem tørke for 24 timer under laminær hette og deretter lagre platene i polystyren beholder.
- Under dissecting mikroskop, plukke opp 10 til 12 gravid voksne bruker en steril ormen hakke og overføre ormer til et E. coli OP50 seeded NGM plate. Inkuber platene på 20 ° C over natten.
- Neste dag, fjerne voksne bruker en steril ormen hakke og la embryoene å utvikle til L4 Larvene ved 20 ° C (~2.5 dager).
4. forberedelse av alder synkron befolkningen av ormer
-
Vask gravid voksne fra to til fire NGM plater med M9W og samle dem i et 15 mL konisk rør.
- Forberede M9W: kombinere 3 g av NaCl, 6 g Na2HPO4og 3 g av KH2PO4 og løses i et endelig antall 1 L deionisert vann. Autoclave løsningen og legge 1 mL 1 M MgSO4.
- Spin røret på 450 x g for 1 min, så Dekanter nedbryting samtidig at ormen pellet forblir intakt.
- Legge til 400 µL av 8,25% natriumhypokloritt (husholdning bleke) og 100 µL av 5 N NaOH å forberede ormen lysis løsningen. Legg lysis løsningen til ormen pellets og bland innholdet ved å sveipe røret til 70% av de voksne ormene er lysed. Regelmessig observere innholdet i røret under dissecting mikroskop å sikre det er ingen overbleaching av eggene.
- Fortynne blekemiddel blandingen ved å legge 10 mL av M9W innholdet i konisk røret.
- Spin røret på 450 x g for 1 min. Decant nedbryting, deretter legge 10 mL av M9W.
- Gjenta trinn 4.5 to ganger.
- Resuspend den resulterende egg pellet i 3-5 mL av M9W. Sett røret på et rør rotator. Tillate rør for å rotere med en hastighet på 18 rpm ved romtemperatur (RT) over natten.
- Neste dag, spinne røret på 450 x g for 1 min til pellets L1 larvene. Fjerne det meste av M9W av aspirasjon, etterlot ~ 250 µL av væske i røret. Resuspend L1 larvene og sted tre 5 µL dråper av ormen suspensjon på en Petriskål lokk, så anslå hvor mange ormer per µL bruker dissecting mikroskop.
5. induksjon av RNAi i Worms
- Bruke et sterilt loop eller plukke, strek ut de ønskede stammene av RNAi inneholder E. coli fra frosne aksjer (Ahringer og Vidal biblioteker) på 100 x 15 mm LB agar plater som inneholder 50 µg/mL carbenicillin og 15 µg/mL tetracycline. Inkuber platene på 37 ° C i 24 timer.
- Plukk og vaksinere en isolert koloni fra ønsket RNAi stammen i sterilt 15 mL konisk rør som inneholder 2 mL LB supplert med 50 µg/mL carbenicillin. Inkuber rørene på 37 ° C 16 h i en orbital shaker på 150 rpm.
- Neste dag, spre 150 µL overnatting vokst kultur på 65 x 15 mm NGM RNAi fôring tallerkener med en bakteriefri sprederen. Inkuber platene på 37 ° C i 24 timer.
- Tillate platene avkjøles til RT etter inkubasjon på 37 ° C. Legge til en passende mengde M9W inneholder ~ 200 L1 Larvene (hentes fra befolkningen alder synkron ormer trinn) til E. coli seeded NGM RNAi fôring plater. Inkuber platene på 20 ° C til larvene kommer L4 scenen (~2.5 dager).
6. utarbeidelse av Mitis gruppe Streptococci for infeksjon
- Strek ut ønsket stammer av streptococci på 100 mm x 15 mm din agar (hvis platene ble lagret på 4 ° C, pre varme platene til 37 ° C før striper de respektive stammene), deretter ruge platene på 37 ° C over natten (~ 18 h) i en stearinlys krukke gir en gram-negative no vironment for veksten av streptococci (stripete platene kan lagres i en uke på 4 ° C).
- Overføres kliniske isolater av streptococci, bruk tryptic soya blod agar. Inkuber platene på 37 ° C i en stearinlys krukke natten (~ 18 h).
- Neste dag, fjerne platene fra stearinlys glasset og plukke isolert kolonier ved hjelp av en steril loop. Vaksinere 15 mL steril konisk rør som inneholder 2 mL av din kjøttkraft. Overføres kliniske isolater av streptococci, supplere THY buljong med 5% v/v sauer blod. Lukk dekslene stramt og ruge rørene på 37 ° C under statisk forhold.
7. overlevelse analyser
Merk: Trinnene involvert i denne analysen er avbildet i figur 1. For å demonstrere at H2O2 avledet av mitis gruppen er ansvarlig for drapet på ormen, supplere media med catalase eller mutert stamme ΔspxB og tillegg strain ΔspxB; spxB + S. gordonii kan brukes. SpxB koder for et pyruvate oksidase, som er ansvarlig for produksjon av H2O2 i gruppen mitis.
- Forvarm 35 x 10 mm din platene til 37 ° C. Legg til 80 µL av natten vokst kulturer av de ønskede stammene av streptococci og spre bakterier helt over agar overflaten med en bakteriefri sprederen. Inkuber platene på 37 ° C i en stearinlys krukke natten (~ 18 h). Som en kontroll, frø to 35 mm x 10 mm NGM plater med 80 µL av natten vokst kulturer av E. coli OP50. Inkuber platene på 37 ° C over natten.
- For å bekrefte at H2O2 produsert av gruppen mitis er ansvarlig for drapet på ormer, legger du til 50 µL inneholder 1000 enheter catalase c på THY plate. Spre catalase løsningen bruker en steril sprederen og la platene tørke i laminær strømning i 30 min. frø platene etterpå med de respektive streptococcus stammene som beskrevet i trinn 7.1.
- Neste dag, Fjern platene fra jar stearinlys og tillate platene avkjøles til RT i 10-15 min. bruker en steril orm plukke, overføring 30 L4 larver fra NGM eller NGM RNAi fôring plater til streptococcus seeded din plater. Bruk to seeded din plater med totalt 60 ormer per stamme av streptococcus. Inkuber platene på 25 ° C.
- Bruker dissecting mikroskop, telle antall levende og døde L4 larver på hver plate på flere timepoints. I utgangspunktet score ormer som døde eller levende enhver 30 min. Deretter, når ormer raskt begynner å dø, score dem i 15 min intervaller. Bruk sterilt ormen hakke å forsiktig prod ormer og avgjøre om de er døde eller levende. En orm anses døde hvis det er ingen bevegelse i respons til den prodding.
- Analysen vil ta 5-6 h å fullføre. Gjenta eksperimentet to ganger. Etter ferdigstillelse av analysen, samle data fra to platene. Legge inn data for hver gruppe, sammenligne den overlevelse kurver og utføre Kaplan-Meier overlevelse analyse ved hjelp av statistisk programvare.
8. utarbeidelse av Agarose Pads for mikroskopi
- Oppløse 2% w/v av agarose i deionisert vann ved å varme løsningen i mikrobølgeovn. Et volum på 5 mL løsning er tilstrekkelig å forberede 20 lysbilder.
- Holde lab bånd langs langs to glass lysbilder. Dette angir tykkelsen på agarose pads. Sett en ren objektglass mellom de to teipede lysbildene.
- Sted 100 µL av smeltet agarose på midten av ren lysbildet. Umiddelbart plassere et rent glass på den flytende agarose og trykk forsiktig ned å en pute. Tillate agarose å stivne og deretter fjerne det øverste lysbildet. Agarose pad er klar til bruk.
9. observasjon av SKN-1 lokalisering svar Streptococcus infeksjon
Merk: Trinnene involvert i denne analysen er avbildet i figur 2. Lokalisering av SKN-1 ble bestemt bruker SKN-1B/C::GFP transgene ormen belastningen. For å demonstrere lokalisering av SKN-1 på grunn av produksjonen av H2O2 av mitis gruppen, vill-type (WT), ΔspxB, og i tillegg belastning ΔspxB; spxB + S. gordonii ble brukt. Videre ble transgene reporter påkjenningen SKN-1B/C::GFP og RNAi forstyrrelser teknikk brukt til å demonstrere at komponenter i p38 MAPK veien regulere lokalisering av SKN-1.
- Forvarm 35 x 10 mm din platene til 37 ° C. Legg til 80 µL av natten vokst kulturer av de ønskede stammene av streptokokker og spre bakterier helt over agar overflaten med en bakteriefri sprederen. Inkuber platene på 37 ° C i en stearinlys krukke natten (~ 18 h). Som en kontroll, frø tre 35 mm x 10 mm NGM plater med 80 µL av natten vokst kulturer av E. coli OP50. Inkuber disse platene på 37 ° C for ~ 18 h.
- Neste dag, fjerne plater fra stearinlys glasset og la den avkjøles til RT i 10-15 min. vask L4 Larvene bruker M9W fra NGM og NGM RNAi fôring plater. Samle ormer i 15 mL konisk rør.
- Spin rørene på 450 x g i 1 Decant nedbryting og tilsett 10 mL av M9W.
- Gjenta trinn 9.3 tre ganger.
- Resuspend ormer i ~ 250 µL M9W og sted tre 5 µL dråper ormen suspensjon på ren Petriskål lokk og anslå hvor mange ormer per µL bruker dissecting mikroskop.
- Legg ~ 100 L4 Larvene til hver din streptococcus seeded og NGM E. coli seeded plater. Bruk tre plater per stamme av bakterien. Inkuber platene for 2 til 3 h på 25 ° C.
- Deretter fjerne platene settefiskanlegg, vaske dem med M9W og samle ormer i 15 mL konisk rør.
- Vask ormer 3 x som beskrevet i trinn 9.3.
- Fjerne det meste av M9W av aspirasjon, og Legg til 500 µL av M9W med 2 mM natrium azide eller 2 mM tetramisole hydrochloride ormen pellets. Dette vil bedøve ormer, sikrer at ingen bevegelse oppstår når fotografert under mikroskopet.
Forsiktig: Bruk personlig verneutstyr (PVU) når du håndterer Natriumazid. Forbered den azide løsningen under kjemiske hette. - Inkuber ormen pellets på RT i 15 min. Deretter spot 15 µL av ormen suspensjon på en forberedt agarose pad. Forsiktig plassere en nr 1,5 dekkglassvæske over agarose puten som inneholder bedøvet ormer.
- Bruke lysstoffrør mikroskop, visualisere lokalisering av SKN-1 bruker FITC og DAPI filtre. Bildet ormer på 10 x og 20 x forstørrelse.
- Score ormer basert på nivået av lokalisering av SKN-1. Ingen kjernefysiske lokalisering av SKN-1B/C::GFP i alle intestinal celler med kjernefysiske lokalisering og lokalisering av SKN-1B/C::GFP i fremre eller bakre av ormen er kategorisert som lav, middels og høye nivåer av lokalisering, henholdsvis.
- Etter scoring fluorescerende micrographs, finne statistiske forskjellene av chi-kvadrat og Fishers pressepenger tester med statistisk programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medlemmer av mitis gruppen S. mitis, S. oralis, og S. gordonii raskt drept ormer, i motsetning til S. mutans, S. salivarius, og ikke-patogene E. coli OP50 (Figur 3A). Median overlevelse for S. mitis, S. oralis, og S. gordonii var 300 min og 300 min 345 min, henholdsvis. For å avgjøre hvis drapet ble formidlet av H2O2, ble catalase supplert til din agar. Drapet på ormer ble avskaffet i nærvær av catalase (Figur 3B). For å ytterligere å bekrefte om streptokokk avledede H2O2 mediert drap av ormer, overlevelse på ΔspxB mutert stamme, WT belastning og tillegg strain ΔspxB; spxB + S. gordonii ble analysert. Død av ormer ble ikke observert på ΔspxB mutert stamme sammenlignet med vill-type og utfyller stammer (Figur 3C). Disse data tyder på at H2O2 produsert av gruppen mitis formidler drapet på ormer. Vi har også observert lignende drapet kinetics når ormer ble utsatt for kliniske isolater av mitis gruppe streptococci fra blod kreftpasienter (Figur 3D). Basert på dataene, ble virusets skyldes H2O2 produsert av mitis gruppe streptococci vurdert.
For å identifisere vert gener som er viktige mot streptokokk infeksjoner, skn-1 ble slått ned, som koder for oksidativt stress respons transkripsjon faktor i C. elegans. Deretter ble overlevelse i forhold til vektor kontroll behandlet ormer sammenlignet. En betydelig reduksjon i overlevelse av skn-1 knockdown ormer ble observert i forhold til vektor kontroll behandlet ormer (Figur 4A). Disse dataene ble ytterligere bekreftes med en skn-1 mutert stamme, og overlevelse ble sammenlignet av ormene N2 vill-type. Vi observerte en lignende drapet fenotypen som skn-1 mutant, sett med skn-1 knockdown, demonstrere at SKN-1 påvirket overlevelse av ormer på gruppen mitis (Figur 4B).
Deretter ble det bestemt om den H2O2 produsert av mitis forårsaket lokalisering av SKN-1B/C::GFP i ormer. Lokalisering av SKN-1B/C::GFP ble observert i worms utsatt til vill-type og supplement flekker og ikke som svar ΔspxB mutert stamme av S. gordonii (figur 5A, B). Videre for å avgjøre aktivering av SKN-1, ble komponenter i p38 MAPK veien slått ned. Redusert lokalisering av SKN-1B/C::GFP i nsy-1, sek-1, pmk-1, og skn-1 knockdown ormer i forhold til vektor kontroll behandlet ormer ble observert. Dataene tyder p38 MAPK kreves for aktivering av SKN-1 H2O2 produsert av gruppen mitis (figur 5C, D) som svar.
Figur 1 : Flytskjema som viser trinnene involvert i utarbeidelsen av de overlevelse analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Flytskjema som viser trinnene involvert i lokalisering av SKN-1 under infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : H2O2-mediert drepe C. elegans av mitis gruppe streptococci. Kaplan-Meier overlevelse kurver av L4 Larvene utsatt for (A) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans, og E. coli OP50. (B) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans, og E. coli OP50 på din plater i nærvær av 1000 U av catalase. (C) S. gordonii WT ΔspxB mutant og ΔspxB; spxB + utfyller påkjenningene på N2 L4 larver. (D) S. oralis (VGS #3), S. oralis (VGS #4), S. mitis (VGS #10), S. mitis (VGS #13) og E. coli OP50. Dataene er representant for eksperimenter gjentatt to eller flere ganger, med n = 60 ormer for hvert vilkår. Kaplan-Meier rank analyse ble brukt til å sammenligne overlevelse kurver og beregne medianen overlevelse. P-verdier < 0,05 ble ansett å være statistisk signifikant. Dette tallet har blitt endret og tilpasset med tillatelse15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : SKN-1 er nødvendig for overlevelsen av ormer på S. gordonii. (A) overlevelse vektor kontroll behandlet og skn-1 knockdown ormer utsatt for S. gordonii. (B) overlevelse av N2 og skn-1(zu67) mutant ormer matet på S. gordonii. Dataene er representant for eksperimenter gjentatt to eller flere ganger, med n = 60 ormer for hvert vilkår. Kaplan-Meier rank analyse ble brukt til å sammenligne overlevelse kurver og beregne medianen overlevelse. P-verdier < 0,05 ble ansett å være statistisk signifikant. Dette tallet har blitt endret og tilpasset med tillatelse15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Streptokokk H2O2 mediert aktivering av SKN-1 er avhengig av p38 MAPK veien. (A) representant bilder av lokalisering av SKN-1B/C::GFP i worms utsatt til WT, ΔspxB mutant og ΔspxB; spxB + supplement stammer av S. gordonii. Nærbilder vises i øvre høyre hjørnene av hvert bilde. Skala bar = 100 µm. (B) graden av kjernefysiske lokalisering av SKN-1B/C::GFP og prosentandel av ormer i hver kategori matet på WT, ΔspxB mutant og ΔspxB; spxB + supplement stammer av S. gordonii. Betydelig ble lave nivåer av kjernefysiske lokalisering av SKN-1B/C::GFP observert i ΔspxB mutant (p < 0,0001) sammenlignet med WT og ΔspxB; spxB + supplement toner av S. gordonii. (C) representant bilder av lokalisering av SKN-1B/C::GFP i nsy-1 sek-1, pmk-1, skn-1 knockdown og vektor kontroll behandlet ormer på S. gordonii. Nærbilder vises i øvre høyre hjørnene av hvert bilde. Skala bar = 100 µm. (D) graden av SKN-1B/C::GFP kjernefysiske lokalisering og prosentandel av ormer i hver kategori matet på nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 knockdown og vektor kontroll behandlet ormer på S. gordonii. Betydelig ble lave nivåer av kjernefysiske lokalisering av SKN-1B/C::GFP observert i nsy-1 (p < 0,01), sek-1 (p < 0,001), pmk-1 (p < 0,0001),og skn-1 knockdown (p < 0,0001) sammenlignet med vektoren kontroll behandlet ormer på S. gordonii. Større enn 100 ormer for hver påkjenninger ble fotografert, og forsøket ble gjentatt tre ganger. Dette tallet har blitt endret og tilpasset med tillatelse15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene beskrevet kan brukes for andre patogene bakterier som Enterococcus faecium, som også produserer H2O2 dyrket under anaerob eller gram-negative forhold26. For mest sykdomsfremkallende organismer tar det vanligvis flere dager til uker å fullføre de overlevelse analyser. Men på grunn av robust produksjon av H2O2 av medlemmer av gruppen mitis, kan disse analyser fullføres innen 5-6 timer under forholdene beskrevet. Dette sikrer evnen å skjermen flere genet kandidater involvert i vert immunitet og oksidativt stressrespons over en kort tidsperiode.
I denne protokollen er H2O2 produsert av bakterier i direkte kontakt med intestinal celler av ormen, i motsetning til andre eksogene ROS kilder som må krysse flere barrierer. Dette sikrer at H2O2 leveres til intestinal cellene; Derfor er mer robust drapet svar observert i ormen. Bruker fluorescently merket bakterier, ble det fastslått at ormer må utsettes til patogener i 30 min for komplett kolonisering av tarmkanalen15. Det anbefales å bruke mindre enn 1 uke gamle strek plater streptokokk stammer for å sikre sin levedyktighet og evne til å produsere H2O2. I tillegg må de streptokokk stammene dyrkes gram-negative vilkår for optimal produksjon av H2O2. L4 larver eller 1 dag gammel voksne kan brukes for denne analysen. Det er viktig at alle ormer brukt i et eksperiment er på samme alder og kjønn. Yngre ormer tendens til å dø saktere i forhold til eldre hermafroditter. L4 dyr er lettere fordi deres utvikling vulva er synlig på midten av kroppen som en klar patch som står i kontrast til resten av kroppen. Det er også viktig at ingen E. coli OP50 overføres til streptococcus seeded platene. Forurensing dreper plater med E. coli kan forårsake signalsvekking eller forverring av drapet på ormer. For å unngå forurensning, er det nødvendig å plukke ormer fra E. coli plenen. Når scoring de overlevelse analyser, anbefales det å observere disse strukturene pumpe, foraging virkemåten til hodet, og kroppens bevegelser. For å sikre at ormen er død, anbefales det å forsiktig prod nesen, side av kroppen, eller hale og observere noen bevegelse.
RNAi fôring og overlevelse av ormer for mitis-gruppen ble kombinert for å identifisere kandidater som er involvert i forsvar mot H2O2. Bruke genet skn-1 som koder for en oksidativt stress respons transkripsjon faktor, sitt krav for overlevelse av svar på H2O2 er demonstrert her. Denne analysen kan derfor tilpasses til skjermen for flere gener og identifisere potensielle kandidater kreves for oksidativt stress og immunitet. RNAi fôring av ormer oppnås ved å legge til alder synkronisert L1 Larvene til RNAi uttrykke E. coli plener. Under ormen synkroniseringen protokollen er det viktig å overvåke lysis av ormen neglebåndene i nærvær av blekemiddel og natriumhydroksid. Cuticle av voksne og larver løses kontinuerlig, mens embryoene er delvis beskyttet av tykke eggeskall. Langvarig inkubasjon i nærvær av blede natriumhydroksid blandingen kan imidlertid føre embryoene til å dø. Derfor er det viktig å observere røret som inneholder ormer under dissecting mikroskop med jevne mellomrom under bleking. Et annet skritt å vurdere i synkroniseringen protokollen er vedlikehold av arrestert L1 larver. Arrestert Larvene kan vedlikeholdes på røret rotator 5 dager ved romtemperatur. Det anbefales å bruke Larvene RNAi fôring innen 1-2 dager etter klekking. Langvarig vedlikehold i M9W kan føre til dannelse av dauer scenen.
Endelig ble transgene orm uttrykke SKN-1 del GFP brukt til å overvåke aktivering av oksidativt stressrespons i nærvær av gruppen mitis. Det vises av RNAi at komponentene i p38-MAPK er nødvendig for lokalisering av SKN-1B/C::GFP til kjerner i intestinal cellene. Det er viktig å bruke L3 eller L4 stadier av denne stammen for å observere lokalisering av SKN-1B/C::GFP, som lokalisering av SKN-1 tendens til å avta i det voksne stadiet. Å bedre observere lokalisering av SKN-1B/C::GFP, anbefales det å overlappe fått bildene benytter filterinnstillingene FITC og DAPI. Autofluorescence genereres av lipofuscins å gi kontrast for observasjon av SKN-1 lokalisering i ormen. Men har det også vært vist at signalet fra svakt uttrykt GFP journalister er maskert av autofluorescence fra ulike kilder i tarmen av ormen. Autofluorescence har vist seg å øke med alderen og er høyest i tarmen og livmoren C. elegans27. For å overkomme dette problemet utnyttet en fersk studie en trippel bandet GFP Filteroppsett for å overvåke lokaliseringen av SKN-1B/C::GFP i C. elegans28. Dette oppsettet skiller GFP signalet fra autofluoresence, viser GFP og autofluoresence i grønn og gul kanaler, henholdsvis.
C. elegans brukes i denne protokollen til å studere vert-patogen interaksjoner og fastslå hvordan H2O2 produsert av gruppen mitis fører virusets. Enda viktigere, bruker denne modellen, kan effekten av H2O2 på endoplasmic reticular stress, mitokondrie skader, mitophagy, autophagy og oksidativt stress studeres. Videre kan mekanismer som H2O2 fungerer som en virulens faktor å lokke fram immunreaksjoner ved å forstyrre kjerneprosesser i cellen identifiseres. Derfor er denne ormen anerkjent som en kraftig modellsystem for å oppdage ny innsikt i vert-patogen interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (University of Texas, School of Dentistry), Dr. Richard Lamont (Universitetet i Louisville, School of Dentistry) og Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) for å gi laboratorie- og kliniske stammer av mitis gruppe streptococci. Vi takker også Dr. Keith Blackwell (genetikk, Harvard Medical School) for C. elegans stammer. Til slutt, vi takker Dr. Danielle Garsin og hennes lab (University of Texas, McGovern Medical School) for å gi reagenser og ormen stammer å gjennomføre studiet. Noen ormen stammer ble levert av CGC, som finansieres av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
