Summary
De nematode Caenorhabditis elegans is een uitstekend model te ontleden gastheer-pathogeen interacties. Hier beschreven is een protocol te infecteren de worm met leden van de mitis groep streptokokken en activering van de oxidatieve stressrespons tegen H2O2 geproduceerd door deze groep van organismen te bepalen.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), een free-living nematode, heeft ontpopt als een aantrekkelijk model te bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties. Dit model wordt in het gepresenteerde protocol gebruikt om te bepalen van de pathogeniteit veroorzaakt door de mitis groep streptokokken via de productie van H2O2. De mitis groep streptokokken zijn een nieuwe bedreiging die ervoor zorgen dat vele menselijke ziekten zoals bacteriëmie endocarditis en orbitale cellulitis (sinaasappelhuid). Hier beschreven is een protocol om het voortbestaan van deze wormen in reactie op H2O2 geproduceerd door deze groep van ziekteverwekkers. Met behulp van de gene skn-1 codering voor een oxidatieve stress reactie transcriptiefactor, wordt aangetoond dat dit model belangrijk zijn voor de identificatie van de host-genen die essentieel zijn tegen streptokokken infectie. Bovendien is aangetoond dat de activering van de oxidatieve stressrespons kan worden gecontroleerd in de aanwezigheid van deze ziekteverwekkers met behulp van een transgene verslaggever worm stam, waarin SKN-1 is gesmolten tot groen fluorescente proteïne (GFP). Deze tests bieden de mogelijkheid om te studeren van de oxidatieve stress reactie op H2O2 afgeleid door een biologische bron in tegenstelling tot exogenously reactieve zuurstof soorten (ROS) bronnen toegevoegd.
Introduction
Mitis groep streptokokken zijn menselijke commensals van de orofaryngeale holte1. Deze organismen kunnen echter ontsnappen deze niche en een verscheidenheid van invasieve ziekten2veroorzaken. De infecties veroorzaakt door deze micro-organismen bevatten bacteriëmie endocarditis en orbitale cellulitis (sinaasappelhuid)2,3,4,5,6. Bovendien komen ze als oorzakelijke agens van infecties van de bloedbaan in immuungecompromitteerde, neutropenic en kankerpatiënten die chemotherapie5,7,8,9 hebben ondergaan .
De mechanismen onderliggende mitis groep pathogenese is duister, omdat enkele virulentiefactoren zijn geïdentificeerd. De mitis-groep is bekend voor de productie van H2O2, waaruit blijkt een belangrijke rol spelen in mondelinge microbiële gemeenschappen10. Meer recentelijk, verschillende studies hebben gewezen op een rol voor de H2O2 als een cytotoxin dat epitheliale cellen dood11,12 induceert. S. longontsteking, die behoort tot deze groep, is aangetoond dat het produceren van hoge niveaus van H2O2 die DNA-beschadiging en apoptosis in alveolaire cellen13induceert. Met behulp van een acute longontsteking diermodel, de dezelfde onderzoekers aangetoond dat de productie van H2O2 door de bacteriën een virulentie voordeel toekent. Studies op pneumokokken meningitis hebben ook aangetoond dat pathogen afkomstige H2O2 werkt synergetisch met pneumolysin om te activeren van neuronale cel dood14. Deze opmerkingen duidelijk vaststellen dat H2O2 geproduceerd door deze groep van bacteriën is belangrijk voor hun pathogeniteit.
Het is interessant, ook aangetoond dat leden van de mitis groep S. mitis en S. oralis leiden tot de dood van de nematode C. elegans via de productie van H2O215,16. Deze free-living nematode is gebruikt als een eenvoudige, genetisch hanteerbare model om vele biologische processen te bestuderen. Meer recentelijk, de worm heeft ontpopt als een model voor het bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties17,18. Bovendien hebben verschillende studies gewezen op het belang van het bestuderen van oxidatieve stress met behulp van dit organisme19,20,21. Zijn korte levenscyclus, mogelijkheden voor vechtpartij genen van belang door RNAi en het gebruik van groen fluorescent proteïne (GFP)-gesmolten verslaggevers om te controleren van genexpressie zijn enkele van de kenmerken die het een aantrekkelijk modelsysteem maken. Wat nog belangrijker is, zijn de trajecten die regelen van oxidatieve stress en aangeboren immuniteit in de worm zeer geconserveerd met zoogdieren20,22.
In dit protocol, wordt aangetoond hoe met C. elegans verhelderen van de pathogeniteit veroorzaakt door streptokokken afkomstige H2O2. Een gemodificeerde overleving assay wordt weergegeven, en leden van de groep mitis kunnen doden de wormen snel via de productie van H2O2. Met behulp van de leden van de mitis-groep, een duurzame biologische bron van reactieve zuurstof soorten wordt (ROS) verstrekt, in tegenstelling tot chemische bronnen die oxidatieve stress in het wormen veroorzaken. Bovendien, de bacteriën kunnen koloniseren de wormen snel, waardoor voor H2O2 rechtstreeks gericht aan de intestinale cellen (ten opzichte van andere bronnen die moeten oversteken van de verscheidene barrières). De test wordt gevalideerd of 1) door het bepalen van het voortbestaan van de gemuteerde stam van skn-1 of 2) door neerhalend skn-1 met behulp van RNAi in wormen ten opzichte van de N2 wild-type en vector controle behandeld wormen. SKN-1 is een belangrijke transcriptiefactor die de oxidatieve stressrespons in C. elegans23,24,25 regelt. Naast overleving testen, is een stam van de worm uiting van een transgene verslaggever van SKN-1B/C::GFP gebruikt om te controleren van de activering van de oxidatieve stress reactie via de productie van H2O2 door de mitis-groep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van uw platen van de Agar (Todd-Hewitt gistextract)
- Voeg voor 1 liter media, 30 g van Todd-Hewitt poeder, 2 g gistextract en 20 g agar aan een erlenmeyer van 2 L. 970 mL gedeïoniseerd water toevoegen aan de inhoud van de kolf en omvatten een roer-bar. Autoclaaf de media op een temperatuur van 121 ° C en een druk van 15 lb/inch2 voor 30 min. Daarna stellen de media op een bord roer en laat voor koeling met zachte roeren.
- Giet de media in gepaste afmetingen steriele petrischalen (100 x 15 mm gerechten voor de groei en het onderhoud van bacteriën, 35 x 10 mm gerechten voor het doden van tests) onder een laminaire flow. Laat de media te drogen voor 2 h onder de laminaire motorkap. Daarna kunnen de platen voor 1 maand bij 4 ° C worden opgeslagen.
2. voorbereiding van de Nematode groeimedium (NGM) en RNAi voederen platen (NGM RNAi)
- Met behulp van een roer-bar, los 2,5 g pepton en 3 g NaCl in 970 mL gedeïoniseerd water in een erlenmeyer van 2 L. Voeg 20 g agar aan de media. Autoclaaf de media op een temperatuur van 121 ° C en een druk van 15 lb/inch2 voor 30 min. de media instellen op een bord roer en laat voor koeling met zachte roeren.
- Toevoegen van de volgende oplossingen aan de media voor bereiding van NGM platen: 25 mL van de 1 M kalium fosfaatbuffer (pH = 6.0), 1 mL van de 1 M MgSO4, 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL in ethanol van 95%) cholesterol , 1 mL (10% v/w in ethanol) nystatine, en 1 mL 25 mg/mL streptomycine.
- Toevoegen van de volgende oplossingen aan de media voor bereiding van NGM RNAi voederen platen: 25 mL van de 1 M kalium fosfaatbuffer (pH = 6.0), 1 mL van de 1 M MgSO4, 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL in ethanol van 95%) cholesterol , 1 mL (10% v/w in ethanol) nystatine, 1 mL van de carbenicillin van 50 mg/mL en 1 mL IM IPTG.
- Giet de media in 60 x 15 mm steriele petrischalen onder laminaire flow. Laat de media te drogen voor 2 h onder de laminaire motorkap. Vervolgens kunnen platen voor 1 maand bij 4 ° C worden opgeslagen.
3. onderhoud van C. elegans
- Zaad de NGM platen door spotten 50 µL van overnachting gegroeid E. coli OP50 in het midden van de platen. De cultuur van de E. coli is eerder bereid in Luria Bertani (LB) media en opgeslagen bij 4 ° C voor enkele maanden. Dekking van de platen en laten drogen gedurende 24 uur onder de motorkap van een laminaire en daarna de platen in polystyreenschuim reservoir bewaren.
- Onder een Microscoop ontleden, oppakken van 10 tot 12 gravid volwassenen met behulp van een steriele worm pick en de wormen overbrengen in een E. coli OP50 zaadjes NGM plaat. Incubeer de platen bij 20 ° C's nachts.
- De volgende dag, verwijder de volwassenen met behulp van een steriele worm pick en toestaan dat de embryo's ontwikkelen tot larven van de L4 bij 20 ° C (~2.5 dagen).
4. voorbereiding van de synchrone beroepsbevolking van Worms
-
Wassen gravid volwassenen twee tot vier NGM platen met behulp van M9W en verzamelen ze in een conische tube van 15 mL.
- Ter voorbereiding van de M9W: 3 g NaCl, 6 nb2HPO4g en 3 g van KH2PO4 combineren en los op in een eindvolume van 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf de oplossing en voeg 1 mL 1 M MgSO4.
- Draai de buis bij 450 x g gedurende 1 min, waarna het supernatant decanteren en tegelijkertijd te garanderen dat de worm pellet intact blijft.
- Voeg 400 µL van 8,25% natriumhypochloriet (huishoudelijk bleekmiddel) en 100 µL van 5 N NaOH te bereiden de worm lysis van de oplossing. Toevoegen van de lysis van de oplossing aan de worm pellet en meng de inhoud door flicking de buis tot 70% van de volwassen wormen zijn lysed. Periodiek observeren de inhoud van de buis onder een ontleden Microscoop om ervoor te zorgen is er geen overbleaching van de eieren.
- Verdun de mix bleekmiddel door 10 mL van de M9W toe te voegen aan de inhoud van de conische buis.
- Draai de buis bij 450 x g gedurende 1 min. Decant supernatant, voeg vervolgens 10 mL M9W.
- Herhaal stap 4.5 twee meer tijden.
- Resuspendeer de pellet ei resulterende in 3-5 mL M9W. Plaats de buis op een buis rotator. Toestaan dat de buizen te draaien met een snelheid van 18 rpm bij kamertemperatuur (RT) 's nachts.
- De volgende dag, draai de buis bij 450 x g gedurende 1 min aan de L1-larven pellet. Meeste M9W verwijderen door aspiratie, weggaand achter ~ 250 µL van vloeistof in de buis. Resuspendeer de L1-larven en plaats drie 5 µL druppels van de schorsing van de worm op een petrischaal deksel, dan de raming van het aantal wormen per µL met behulp van een Microscoop ontleden.
5. de inductie van RNAi in Worms
- Met behulp van een steriele lus of ophalen, streak uit de gewenste stammen van RNAi-bevattende E. coli uit bevroren voorraden (Ahringer en Vidal bibliotheken) op 100 mm x 15 mm LB agar platen met 50 µg Mo/mL carbenicillin en 15 µg/mL tetracycline. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Kies en een geïsoleerde kolonie van de gewenste RNAi-stam in steriele 15 mL conische buizen met 2 LB aangevuld met 50 µg Mo/mL carbenicillin mL beënten. Incubeer de buizen bij 37 ° C gedurende 16 uur in een roteerschudapparaat bij 150 t/min.
- De volgende dag, verspreid 150 µL van overnachting volwassen cultuur op 65 x 15 mm NGM RNAi voeding platen met behulp van een steriele strooier. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Toestaan dat de platen afkoelen tot RT na incubatie bij 37 ° C. Voeg een juiste hoeveelheid M9W met ~ 200 L1 larven (verkregen uit synchrone bevolking in de leeftijd van wormen stappen) aan de E. coli ontpit NGM RNAi voederen platen. Incubeer de platen bij 20 ° C tot de larven de L4-fase (~2.5 dagen).
6. bereiding van Mitis groep streptokokken infectie
- Strijk uit gewenste stammen van streptokokken op de 100 mm x 15 mm uw agar (als platen werden bewaard bij 4 ° C, vooraf warm de platen tot 37 ° C voordat de strepen van de respectieve soorten), vervolgens Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts (~ 18 h) in een pot van de kaars die een microaerophilic-en bieden: vironment voor de groei van de streptokokken (de gestreepte platen kunnen worden opgeslagen voor een week bij 4 ° C).
- Gebruiken voor het doorgeven van klinische isolaten van streptokokken, al soja bloed agar. Incubeer de platen bij 37 ° C in een kaars pot 's nachts (~ 18 h).
- De volgende dag, verwijderen van de platen uit de pot van de kaars en geïsoleerde kolonies met een steriele lus te kiezen. Inoculeer 15 mL steriele conische buizen met 2 mL THY Bouillon. Voor het doorgeven van klinische isolaten van streptokokken, vullen de THY bouillon met 5% v/v van schapen bloed. Sluit de strakke caps en Incubeer de buizen bij 37 ° C onder statische omstandigheden.
7. survival Assays
Opmerking: De stappen in deze test zijn afgebeeld in Figuur 1. Om aan te tonen dat de H2O2 afgeleid door de mitis group is verantwoordelijk voor het doden van de worm, aanvulling van de media met katalase, of de gemuteerde stam ΔspxB en aanvulling stam ΔspxB; spxB + van S. gordonii kan worden gebruikt. SpxB codeert voor een pyruvaat oxidase, die verantwoordelijk is voor de productie van H2O2 in de mitis-groep.
- Vooraf warm 35 x 10 mm THY platen tot 37 ° C. Voeg 80 µL van overnachting geteelde culturen van de gewenste soorten streptokokken en de bacteriën volledig verspreid over de oppervlakte van de agar met behulp van een steriele strooier. Incubeer de platen bij 37 ° C in een kaars pot 's nachts (~ 18 h). Als een besturingselement, zaad twee 35 mm x 10 mm NGM platen met 80 µL van overnachting geteelde culturen van E. coli OP50. Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts.
- Om te bevestigen dat de H2O-2 , geproduceerd door de mitis-groep verantwoordelijk voor het doden van de wormen is, voeg 50 µL met 1.000 eenheden van katalase c op de THY plaat. Verspreid de katalase oplossing om met een steriele strooier en laat de platen te drogen in de laminaire flow voor 30 min. zaad de platen daarna met de respectieve streptococcus stammen zoals beschreven in stap 7.1.
- De volgende dag, verwijderen van de platen uit de kaars pot en laat de platen afkoelen tot RT voor 10-15 min. met behulp van een steriele worm pick, overdracht 30 L4 larven uit de NGM of NGM RNAi platen vervoederen aan de streptococcus ontpit THY platen. Gebruik twee zaadjes THY platen met een totaal van 60 wormen per stam van streptococcus. Incubeer de platen bij 25 ° C.
- Met behulp van een Microscoop ontleden, tellen het aantal levende en dode L4 larven op elke plaat op verschillende tijdstippen. In eerste instantie de wormen als dood score of live elke 30 min. Daarna, wanneer wormen snel beginnen te sterven, scoren ze 15 min tussenpozen. Gebruik de steriele worm pick zachtjes prod de wormen en bepalen of ze dood of levend zijn. Een worm wordt beschouwd als doden als er geen verkeer in reactie op het porren bestaat.
- De test duurt 5-6 h om te voltooien. Herhaal het experiment twee keer. Zwembad na voltooiing van de bepaling, de gegevens uit de twee platen. Invoer van de gegevens van elke groep, vergelijk de overleving bochten en Kaplan-Meier overleving analyses met behulp van statistische software uit te voeren.
8. bereiding van Agarose Pads voor microscopie
- Los 2% w/v van agarose in gedeïoniseerd water door verwarming van de oplossing in een magnetron. Een hoeveelheid van 5 mL is voldoende om te bereiden 20 dia's.
- Stok lab tape in de lengte langs twee glazen dia's. Dit bepaalt de dikte van de agarose pads. Plaats een schoon glasplaatje tussen de twee getapete dia's.
- Plaats 100 µL van gesmolten agarose in het midden van de schone dia. Onmiddellijk plaats een andere schone glas op de top van de gesmolten agarose en druk voorzichtig naar beneden om een pad. Laat de agarose stollen en vervolgens het verwijderen van de bovenste dia. De agarose pad is klaar voor gebruik.
9. waarneming van SKN-1 lokalisatie in reactie op Streptococcus infecties
Opmerking: De stappen in deze test zijn afgebeeld in Figuur 2. Lokalisatie van SKN-1 werd bepaald met behulp van de stam van de transgene worm SKN-1B/C::GFP. Om aan te tonen van de lokalisatie van SKN-1 als gevolg van de productie van H2O2 door de mitis-groep, wild-type (WT), ΔspxB, en de aanvulling stam ΔspxB; spxB + van S. gordonii werden gebruikt. Bovendien, de transgene verslaggever stam SKN-1B/C::GFP en RNAi storing techniek werden gebruikt om aan te tonen dat onderdelen van de p38 MAPK traject de lokalisatie van SKN-1 regelen.
- Vooraf warm 35 x 10 mm THY platen tot 37 ° C. Voeg 80 µL van overnachting geteelde culturen van de gewenste stammen van de streptococcus en de bacteriën volledig verspreid over de oppervlakte van de agar met behulp van een steriele strooier. Incubeer de platen bij 37 ° C in een kaars pot 's nachts (~ 18 h). Als een besturingselement, zaad drie 35 x 10 mm NGM platen met 80 µL van overnachting geteelde culturen van E. coli OP50. Incubeer deze platen bij 37 ° C gedurende ~ 18 h.
- De volgende dag, verwijderen van platen uit de kaars pot en laat de platen afkoelen tot RT voor 10-15 min. Wash L4 larven met behulp van de M9W van NGM en NGM RNAi voeding platen. Het verzamelen van de wormen in 15 mL conische buisjes.
- Draai de buizen bij 450 x g gedurende 1 min. Decant het supernatant en voeg 10 mL van de M9W.
- Herhaal stap 9.3 drie keer.
- Resuspendeer de wormen in ~ 250 µL van M9W en plaats drie 5 µL druppels van de schorsing van de worm op een schone petrischaal deksel en de raming van het aantal wormen per µL met behulp van een Microscoop ontleden.
- ~ 100 L4 larven toevoegen aan elk THY streptococcus zaadjes en NGM E. coli agarvoedingsbodem platen. Gebruik drie platen per spanning van bacteriën. Incubeer de platen gedurende 2 tot 3 uur bij 25 ° C.
- Daarna de platen uit de incubator verwijderen, was ze met M9W en verzamelen de wormen in 15 mL conische buisjes.
- Wassen van de wormen 3 x zoals beschreven in stappen 9.3.
- Allermeest naar de M9W verwijderen door aspiratie en voeg 500 µL van M9W met 2 mM natrium azide of 2 mM tetramisole hydrochloride aan de worm-pellet. Dit zal anesthetize de wormen, ervoor te zorgen dat geen beweging doet zich voor wanneer het beeld onder de Microscoop.
Let op: Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij het verwerken van natriumazide. Bereid de oplossing azide onder een chemische motorkap. - Incubeer de worm pellets op RT gedurende 15 minuten. Vervolgens ter plaatse 15 µL van de schorsing van de worm op een bereid agarose pad. Plaats een dekglaasje no. 1.5 aan zachtjes over de agarose pad met de narcose wormen.
- Met behulp van een fluorescente microscoop, visualiseer de lokalisatie van SKN-1 met behulp van FITC en DAPI filters. Afbeelding wormen op 10 x en 20 x vergrotingen.
- De wormen die is gebaseerd op het niveau van de lokalisatie van SKN-1 scoren. Geen nucleaire localisatie, de lokalisatie van SKN-1B/C::GFP in de voorste of achterste van de worm, en de nucleaire localisatie van SKN-1B/C::GFP in alle intestinale cellen worden gecategoriseerd als laag, medium en hoge niveaus van lokalisatie, respectievelijk.
- Na het scoren van de fluorescerende microfoto, de statistische verschillen door chi-kwadraat en Fisher's exacte tests met behulp van statistische software te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leden van de mitis groep S. mitis, S. oralis, en S. gordonii snel gedood de wormen, in tegenstelling tot niet-pathogene E. coli , S. mutansen S. salivarius, OP50 (Figuur 3A). De mediane overleving voor S. mitis, S. oralis, en S. gordonii was 300 minuten, 300 min en 345 min, respectievelijk. Om te bepalen als het doden was gemedieerd door H2O2, werd katalase aangevuld met THY agar. Het doden van de wormen werd afgeschaft in de aanwezigheid van katalase (Figuur 3B). Om te bevestigen of streptokokken afgeleide H2O2 doden van de wormen, overleving op de ΔspxB gemuteerde stam, WT stam, en aanvulling stam ΔspxB; spxB + van S. gordonii gemedieerde werd geanalyseerd. Dood van de wormen niet werd waargenomen op het gemuteerde stam van de ΔspxB in vergelijking met de wild-type en aanvulling van de stammen (Figuur 3C). Deze gegevens duiden erop dat de H2O-2 , geproduceerd door de groep mitis doden van de wormen bemiddelt. Wij ook waargenomen soortgelijke doden kinetiek wanneer de wormen waren blootgesteld aan klinische isolaten van de mitis groep streptokokken verkregen uit het bloed van kankerpatiënten (Figuur 3D). Op basis van de gegevens, de pathogeniteit veroorzaakt door H2O2 geproduceerd door de mitis groep streptokokken evalueerden.
Om te identificeren host genen die essentieel zijn tegen streptokokken infecties, skn-1 werd neergehaald, dat codeert voor de oxidatieve stress reactie transcriptiefactor in C. elegans. Voortbestaan ten opzichte van de vector controle behandeld wormen werd vervolgens vergeleken. Een significante afname in het voortbestaan van de vechtpartij wormen van skn-1 werd waargenomen in vergelijking met de vector controle behandeld wormen (Figuur 4A). Deze gegevens werd verder gevalideerd met behulp van een gemuteerde stam van skn-1 en zijn voortbestaan werd vergeleken met die van de N2 wild-type wormen. Zien we een soortgelijke doden fenotype als de mutant skn-1 , zoals gezien met het knockdown skn-1 , waaruit blijkt dat het voortbestaan van de wormen op de mitis-groep (Figuur 4B) worden beïnvloed door SKN-1.
Vervolgens werd vastgesteld of de H2O2 geproduceerd door de Fractie van de mitis veroorzaakt lokalisatie van SKN-1B/C::GFP in de wormen. Lokalisatie van SKN-1B/C::GFP werd waargenomen in wormen blootgesteld aan de wild-type en vlekken van de aanvulling en niet als antwoord op de gemuteerde stam van despxB van Δ van S. gordonii (Figuur 5A, B). Bovendien, om te bepalen van de activering van SKN-1, onderdelen van het leertraject p38 MAPK werden neergeslagen. Verminderde lokalisatie van SKN-1B/C::GFP in nsy-1, sek-1, pmk-1, en skn-1 vechtpartij wormen ten opzichte van de vector controle behandeld wormen werd waargenomen. De gegevens suggereert de p38 die MAPK vereist voor de activering van SKN-1 reactie op H2O2 geproduceerd door de mitis-groep (Figuur 5C, D is).
Figuur 1 : Stroomdiagram beeltenis van de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van de overleving testen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Stroomdiagram beeltenis van de stappen in de lokalisatie van SKN-1 tijdens infectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : H2O2-gemedieerde doden van C. elegans door mitis groep streptokokken. Kaplan-Meier overleving curven van L4 larven blootgesteld aan (A) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans, en E. coli OP50. (B) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans, en E. coli OP50 op uw platen in aanwezigheid van 1.000 U van katalase. (C) S. gordonii WT, ΔspxB mutant en ΔspxB; spxB + aanvulling stammen op N2 L4 larven. (D) S. oralis (VGS #3), S. oralis (VGS #4), S. mitis (VGS #10), S. mitis (VGS #13) en E. coli OP50. De gegevens representatief zijn voor experimenten herhaald twee of meer keer, met n = 60 wormen voor elke voorwaarde. Kaplan-Meier rangschikking loganalyse werd gebruikt om overleving curven vergelijken en de mediane overleving te berekenen. P-waarden < 0.05 werden beschouwd als statistisch significant. Dit cijfer is gewijzigd en aangepast met toestemming15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : SKN-1 is vereist voor het voortbestaan van de wormen op S. gordonii. (A) voortbestaan van vectorbestrijding behandeld en skn-1 Vechtpartij wormen blootgesteld aan S. gordonii. (B) overleven van N2 en skn-1(zu67) mutant wormen gevoed op S. gordonii. De gegevens representatief zijn voor experimenten herhaald twee of meer keer, met n = 60 wormen voor elke voorwaarde. Kaplan-Meier rangschikking loganalyse werd gebruikt om overleving curven vergelijken en de mediane overleving te berekenen. P-waarden < 0.05 werden beschouwd als statistisch significant. Dit cijfer is gewijzigd en aangepast met toestemming15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Streptokokken H2O2 gemedieerde activering van SKN-1 is afhankelijk van het traject p38 MAPK. (A) representatieve beelden van de lokalisatie van SKN-1B/C::GFP in wormen blootgesteld aan de WT, ΔspxB mutant en ΔspxB; spxB + aanvulling stammen van S. gordonii. Close-ups worden weergegeven in de hoeken van de bovenste rechterhand van elke afbeelding. Schaal bar = 100 µm. (B) de mate van nucleaire localisatie van SKN-1B/C::GFP en percentage van wormen in elke categorie gevoed WT, ΔspxB mutant, en ΔspxB; spxB + aanvulling stammen van S. gordonii. Aanzienlijk werden lage niveaus van nucleaire localisatie van SKN-1B/C::GFP waargenomen in de ΔspxB mutant (p < 0.0001) in vergelijking met de WT en ΔspxB; spxB + aanvulling stammen van S. gordonii. (C) representatieve beelden van de lokalisatie van SKN-1B/C::GFP in nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 knockdown en vectorbestrijding behandeld wormen op S. gordonii. Close-ups worden weergegeven in de hoeken van de bovenste rechterhand van elke afbeelding. Schaal bar = 100 µm. (D) de mate van SKN-1B/C::GFP nucleaire localisatie en percentage van wormen in elke categorie gevoed op nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 knockdown en vectorbestrijding behandeld wormen op S. gordonii. Aanzienlijk werden lage niveaus van nucleaire localisatie van SKN-1B/C::GFP waargenomen in de nsy-1 (p < 0,01), sek-1 (p < 0.001), pmk-1 (p < 0.0001),en skn-1 knockdown (p < 0.0001) ten opzichte van de vector controle behandeld wormen op S. gordonii. Meer dan 100 wormen blootgesteld aan elke stam zijn beeld, en het experiment werd herhaald drie keer. Dit cijfer is gewijzigd en aangepast met toestemming15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor andere pathogene bacteriën zoals Enterococcus faecium, die ook H2O2 onder anaërobe geteeld produceert of microaerophilic voorwaarden26. Typisch, voor meest pathogene organismen duurt het enkele dagen tot weken te voltooien van de tests van de overleving. Echter, als gevolg van de robuuste productie van H2O2 door leden van de groep mitis, deze tests kunnen worden voltooid binnen 5-6 uur onder de beschreven omstandigheden. Hierdoor de mogelijkheid om het scherm verschillende gene kandidaten die betrokken zijn bij de immuniteit van de gastheer en de oxidatieve stressrespons gedurende een korte periode.
In dit protocol is H2O2 geproduceerd door de bacteriën in direct contact met de intestinale cellen van de worm, in tegenstelling tot andere exogene ROS bronnen die verschillende belemmeringen moet oversteken. Dit zorgt ervoor dat de H2O2 wordt geleverd aan de intestinale cellen; Vandaar, een robuustere reactie van de doden wordt waargenomen in de worm. Met behulp van fluorescently geëtiketteerde bacteriën, werd vastgesteld dat de wormen voor ziekteverwekkers voor 30 min. voor volledige kolonisatie van het darmkanaal15moeten worden blootgesteld. Het wordt geadviseerd om te gebruiken minder dan 1 week oud streak platen van streptokokken stammen om hun levensvatbaarheid en het vermogen om te produceren H2O2. Bovendien moeten de streptokokken soorten worden gekweekt onder microaerophilic omstandigheden voor optimale productie van H2O2. L4 larven of 1 dag oud volwassenen kunnen worden gebruikt voor deze test. Het is van cruciaal belang dat alle wormen gebruikt in een experiment dezelfde leeftijd en geslacht zijn. Jongere wormen hebben de neiging om te sterven meer langzaam in vergelijking met oudere hermafrodieten. L4 dieren zijn gemakkelijker onderscheiden omdat hun ontwikkeling vulva is zichtbaar op mid lichaam als een duidelijke patch die met de rest van het lichaam contrasteert. Het is ook belangrijk dat geen OP50 E. coli zijn overgedragen aan de streptococcus ontpit platen. Besmetting van het doden van de platen met E. coli kan leiden tot de verzwakking of de intrekking van het doden van de wormen. Om besmetting te voorkomen, is het noodzakelijk te halen wormen uit de buurt van het gazon E. coli . Wanneer scoren de overleving testen, is het raadzaam om te observeren de faryngaal pompen, foerageren gedrag van het hoofd, en lichaamsbeweging. Om ervoor te zorgen dat de worm dood is, is het aanbevolen om zachtjes de neus, de kant van het lichaam, of staart prod en observeren van elke beweging.
RNAi voeding en de overleving van de wormen op de mitis-groep werd gecombineerd om kandidaten die bij de verdediging tegen H2O2 betrokken zijnvast te stellen. Met behulp van de gen- skn-1 dat voor een transcriptiefactor oxidatieve stress reactie, haar eis codeert voor overleving van de worm in reactie op H2O2 is hier gedemonstreerd. Deze bepaling kan dus worden aangepast aan scherm voor meerdere genen en identificeren van potentiële kandidaten die nodig zijn voor oxidatieve stressrespons en immuniteit. RNAi voederen van de wormen wordt bereikt door toevoeging van leeftijd gesynchroniseerd L1 larven naar de RNAi uiting van E. coli gazons. Tijdens de worm protocol voor gegevenssynchronisatie is het essentieel om te controleren van lysis van de nagelriemen van de worm in het bijzijn van bleekmiddel en natriumhydroxide. De schubbenlaag van volwassenen en de larven zullen voortdurend oplossen, terwijl de embryo's zijn gedeeltelijk beschermd door de dikke van de "eggshell". Langdurige incubatie in aanwezigheid van de bloeden natriumhydroxide-mix kan echter de embryo's om te sterven. Daarom is het belangrijk om te observeren van de buis met de wormen onder een Microscoop ontleden periodiek tijdens bleken. Een andere stap te overwegen in het protocol voor gegevenssynchronisatie is het onderhoud van gearresteerde L1 larven. De gearresteerde larven kunnen worden gehandhaafd op de buis rotator voor 5 dagen bij kamertemperatuur. Het wordt aanbevolen om de larven te gebruiken voor het voederen van RNAi binnen 1 tot 2 dagen na het uitkomen. Langdurig onderhoud in M9W kan leiden tot de vorming van de duur fase.
Ten slotte werd een transgene worm uiten SKN-1 gesmolten tot GFP gebruikt om activering van de oxidatieve stressrespons in aanwezigheid van de groep mitis controleren. Door RNAi wordt aangetoond dat de onderdelen van de p38 MAPK vereist voor de lokalisatie van SKN-1B/C::GFP aan de kernen van de intestinale cellen zijn. Het is belangrijk de L3 of L4 stadia van deze spanning gebruiken om te observeren lokalisatie van SKN-1B/C::GFP, lokalisatie van SKN-1 heeft de neiging te verminderen in het volwassen stadium. Om te beter observeren de lokalisatie van SKN-1B/C::GFP, is het raadzaam de verkregen beelden met behulp van de filterinstellingen FITC en DAPI overlappen. Autofluorescence gegenereerd door de lipofuscins om een contrast van waarneming van SKN-1 lokalisatie in de worm. Echter, het heeft ook aangetoond dat het signaal van zwak uitgedrukt GFP verslaggevers wordt gemaskeerd door autofluorescence uitgestoten door verschillende bronnen in de darm van de worm. Autofluorescence is aangetoond toe met de leeftijd en is het hoogst in de darm en baarmoeder van de C. elegans27. Om dit probleem te verhelpen, gebruikt een recente studie een triple-band GFP filter setup om te controleren de lokalisatie van SKN-1B/C::GFP in C. elegans28. Deze opstelling scheidt het GFP-signaal van de autofluoresence, de GFP en autofluoresence weergeven in de groene en gele kanalen, respectievelijk.
C. elegans wordt gebruikt in dit protocol te bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties en nagaan hoe de H2O2 geproduceerd door de groep mitis pathogeniteit veroorzaakt. Nog belangrijker, met behulp van dit model, kunnen de effecten van H2O2 op endoplasmic reticulaire stress, mitochondriale schade, mitophagy, autophagy en oxidatieve stress worden bestudeerd. Bovendien, mechanismen die H2O2 als een virulentiefactor fungeert te ontlokken immuunrespons door het verstoren van de kernprocessen van de cel kunnen worden geïdentificeerd. Vandaar wordt dit wormvirus erkend als een krachtige modelsysteem voor het ontdekken van nieuwe inzichten in gastheer-pathogeen interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (de Universiteit van Texas, School voor tandheelkunde), Dr. Richard Lamont (Universiteit van Louisville, de School voor tandheelkunde), en Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) voor het verstrekken van laboratorium- en klinische stammen van de mitis groep streptokokken. Wij danken ook Dr. Keith Blackwell (departement van genetica, Harvard Medical School) voor de stammen van C. elegans . Tot slot, wij danken Dr. Danielle Garsin en haar lab (de Universiteit van Texas, McGovern Medical School) voor het verstrekken van reagentia en worm stammen het onderzoek uit te voeren. Sommige stammen van worm werden verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
