Summary
Le nématode Caenorhabditis elegans est un excellent modèle pour disséquer les interactions hôte-pathogène. Décrit ici est un protocole visant à infecter le ver avec des membres des mitis streptocoques et déterminer l’activation de la réponse au stress oxydatif contre H2O2 produites par ce groupe d’organismes.
Abstract
Caenorhabditis elegans (c. elegans), un nématode libre, est devenue un modèle attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Le protocole présenté utilise ce modèle pour déterminer le caractère pathogène causé par le streptocoque du groupe mitis via la production de H2O2. Les streptocoques de groupe mitis sont une menace émergente qui provoquent de nombreuses maladies humaines telles que bactériémie, endocardite et orbitaire. Décrit ici est un protocole pour déterminer la survie de ces vers en réponse à H2O2 produit par ce groupe d’agents pathogènes. Utilisant le skn-1 gène codant pour un facteur de transcription de réponse de stress oxydatif, on montre que ce modèle est important pour l’identification des gènes hôtes essentiels contre une infection à streptocoque. En outre, il est démontré que l’activation de la réponse au stress oxydatif peut être surveillée en présence de ces agents pathogènes en utilisant une souche de ver journaliste transgéniques, dans lequel SKN-1 est fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP). Ces tests fournissent l’occasion d’étudier la réponse au stress oxydatif H2O2 résultant d’une source biologique par opposition à un exogène ajouté réactives de l’oxygène (dro) sources.
Introduction
Streptocoques du groupe Mitis sont commensaux humaine de la cavité oropharyngée1. Toutefois, ces organismes peuvent échapper à ce créneau et causer une variété de maladies invasives2. Les infections provoquées par ces micro-organismes incluent une bactériémie, endocardite et orbitaire2,3,4,5,6. En outre, ils font leur apparition des agents comme responsables de bactériémies à neutropéniques immunodéprimés et cancéreux qui ont subi une chimiothérapie5,7,8,9 .
Les mécanismes sous-jacents pathogenèse de groupe mitis est obscur, parce que quelques-uns des facteurs de virulence ont été identifiés. Le groupe de la mitis est connu pour produire H2O2, qui a montré à jouer un rôle important dans les communautés microbiennes orale10. Plus récemment, plusieurs études ont mis en évidence un rôle pour H2O2 comme une cytotoxine qui induit des cellules épithéliales mort11,12. Pneumonie de S., qui appartient à ce groupe, a été démontré pour produire des niveaux élevés de H2O2 qui induit des lésions de l’ADN et l’apoptose dans les cellules alvéolaires13. À l’aide d’un modèle animal de pneumonie aiguë, les mêmes chercheurs ont démontré que la production de H2O2 par les bactéries confère un avantage de virulence. Études sur la méningite à pneumocoques ont également montré que dérivé de pathogène H2O2 agit en synergie avec pneumolysin pour déclencher des cellules neuronales mort14. Ces observations établissent clairement que l’H2O2 produites par ce groupe de bactéries est important pour leur pouvoir pathogène.
Fait intéressant, il a également été démontré que les membres de la mitis du groupe S. mitis et s. oralis entraînent la mort de la nématode c. elegans , via la production de H2O215,16. Ce nématode libre a été utilisé comme un modèle simple, génétiquement tractable pour étudier de nombreux processus biologiques. Plus récemment, le ver est devenue un modèle pour l’étude de17,des interactions hôte-pathogène18. En outre, plusieurs études ont souligné l’importance d’étudier le stress oxydatif, à l’aide de cet organisme19,20,21. Son cycle de vie court, la capacité de knockdown gènes présentant un intérêt par Arni et l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP)-fusible reporters pour contrôler l’expression des gènes sont quelques-uns des attributs qui en font un système modèle attrayant. Plus important encore, les voies qui régulent le stress oxydatif et l’immunité innée dans la vis sans fin sont hautement conservées avec mammifères20,22.
Dans le présent protocole, on démontre comment utiliser le c. elegans pour élucider le pouvoir pathogène causé par le streptocoque dérivés H2O2. Un test de survie mis à jour l’apparaît, tandis que les membres du groupe mitis sont capables de tuer les vers rapidement via la production de H2O2. À l’aide des membres du groupe mitis, une source biologique durable des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est fourni, par opposition aux sources chimiques qui provoquent le stress oxydatif dans les vers. En outre, les bactéries sont capables de coloniser les vers rapidement, ce qui permet pour H2O2 à cibler directement les cellules intestinales (par rapport à d’autres sources qui ont à franchir plusieurs obstacles). L’essai est validé soit 1) par détermination de la survie de la souche mutante skn-1 ou 2) en abattant de skn-1 à l’aide d’Arni en vers par rapport à la N2 sauvage et vector control traité vers. SKN-1 est un facteur de transcription importante qui régule la réponse de stress oxydatif chez c. elegans23,24,25. En plus des essais de survie, une souche ver exprimant un journaliste transgénique SKN-1 b/C::GFP est utilisée pour contrôler l’activation de la stress oxydatif réponse via la production de H2O2 par le groupe de la mitis.
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Protocol
1. préparation de tes plaques de gélose (extrait de levure de Todd-Hewitt)
- Pour 1 L de médias, ajouter 30 g de poudre de Todd-Hewitt, 2 g d’extrait de levure et 20 g d’agar dans un Erlenmeyer de 2 L. Ajoute le contenu de la fiole de 970 mL d’eau désionisée et comprend un bar de remuer. Autoclave les médias à une température de 121 ° C et une pression de 15 lb/po2 pendant 30 min. Par la suite, mettre les médias sur une plaque de remuer et le laisser pour refroidir en agitant doucement.
- Versez les médias dans des plats de pétri stérile fluxsol (plats de 100 x 15 mm pour la croissance et le maintien des bactéries, mets 35 x 10 mm pour le meurtre de dosages) sous une hotte à flux laminaire. Autoriser les médias à sécher pendant 2 h sous la hotte laminaire. Par la suite, les plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 mois.
2. préparation du milieu de croissance nématode (NGM) et Arni alimentation plaques (Arni NGM)
- À l’aide d’une barre de remuer, dissoudre 2,5 g de peptone et 3 g de NaCl dans 970 mL d’eau désionisée dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L. Ajouter 20 g de gélose aux médias. Autoclave les médias à une température de 121 ° C et une pression de 15 lb/po2 pour 30 min. mettre les médias sur une plaque de remuer et laisser pour le refroidissement en remuant doucement.
- Ajouter les solutions suivantes aux médias pour la préparation des plaques NGM : 25 mL de tampon de phosphate de potassium 1 M (pH = 6,0), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans l’éthanol à 95 %) , 1 mL de nystatine (10 % v/w dans l’éthanol) et 1 mL de 25 mg/mL de streptomycine.
- Ajouter les solutions suivantes aux médias pour la préparation de l’ARNi NGM alimentation des plaques : 25 mL de tampon de phosphate de potassium 1 M (pH = 6,0), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans l’éthanol à 95 %) , 1 mL de nystatine (10 % v/w dans l’éthanol), 1 mL de carbénicilline 50 mg/mL et 1 mL de IM IPTG.
- Versez les médias dans 60 x 15 mm plats de pétri stérile sous hotte à flux laminaire. Autoriser les médias à sécher pendant 2 h sous la hotte laminaire. Par la suite, les plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 mois.
3. entretien de c. elegans
- Semences les plaques NGM de détachage 50 µL de nuit cultivées OP50 d’e. coli dans le centre des plaques. La culture d’e. coli est préparée auparavant en milieu Luria-Bertani (LB) et stockée à 4 ° C pendant plusieurs mois. Recouvrir les plaques et les laisser sécher pendant 24 heures sous une hotte laminaire et ensuite stocker les plaques en polystyrène contenant.
- Sous un microscope à dissection, relever 10 à 12 adultes gravides à l’aide d’une pique de ver stérile et transférer les vers à un e. coli OP50 ensemencées plaque NGM. Incuber les plaques à 20 ° C jusqu’au lendemain.
- Le lendemain, retirer les adultes à l’aide d’une pique de ver stérile et laisser les embryons à développer pour les larves de L4 à 20 ° C (~2.5 jours).
4. préparation de Population synchrone en âge de Worms
-
Laver les adultes gravides de deux à quatre plaques NGM utilisant M9W et à leur rassemblement dans un tube conique de 15 mL.
- Pour préparer le M9W : mélanger 3 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4et 3 g de KH2PO4 et à dissoudre dans un volume final de 1 litre d’eau désionisée. Autoclave la solution et ajouter 1 mL de 1 M MgSO4.
- Faites tourner le tube à 450 x g pendant 1 min, puis décanter le liquide surnageant tout en veillant à ce que le culot de ver reste intact.
- Ajouter 400 µL de 8,25 % d’hypochlorite de sodium (eau de Javel domestique) et 100 µL de 5 N NaOH pour préparer la solution de lyse ver. Ajouter la solution de lyse au culot ver et mélanger le contenu en effleurant le tube jusqu'à ce que 70 % vers adultes sont lysées. Périodiquement, observer le contenu du tube sous un microscope à dissection pour assurer il n’y a aucun surlessivage des oeufs.
- Diluer le mélange d’eau de Javel en ajoutant 10 mL de M9W au contenu du tube conique.
- Faites tourner le tube à 450 x g pendant 1 min. décanter surnageant, puis ajouter 10 mL de M9W.
- Répétez l’étape 4.5 deux fois plus.
- Resuspendre le culot de œuf qui en résulte dans 3 à 5 mL de M9W. Placer le tube sur un rotateur de tube. Laisser les tubes à tourner à une vitesse de 18 t/mn à température ambiante (RT) du jour au lendemain.
- Le lendemain, faites tourner le tube à 450 x g pendant 1 min granuler les larves L1. Supprimer la plupart des M9W par aspiration, laissant derrière eux de ~ 250 µL de liquide dans le tube. Remettre en suspension les larves L1 et gouttes de lieu trois 5 µL de la suspension de ver sur un couvercle de boîte de pétri, puis l’estimation du nombre de vers par µL à l’aide d’un microscope à dissection.
5. l’induction de l’ARNi dans Worms
- En utilisant une solution stérile de boucle ou pick, strie sur les souches désirés d’Arni contenant e. coli provenant des stocks congelés (bibliothèques Ahringer et Vidal) sur des plaques d’agar 100 x 15 mm LB contenant 50 µg/mL carbénicilline et 15 µg/mL de tétracycline. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.
- Choisissez et ensemencer une colonie isolée de la souche de RNAi désirée tubes coniques stérile de 15 mL, 2 ml de LB additionné de 50 carbénicilline µg/mL. Incuber les tubes à 37 ° C pendant 16 h dans un agitateur orbital à 150 tr/min.
- Le lendemain, étaler 150 µL de nuit cultivée culture sur plaques alimentation de 65 mm x 15 mm NGM Arni à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.
- Laisser les plaques refroidir jusqu'à RT après incubation à 37 ° C. Ajouter un volume approprié de M9W contenant des larves L1 ~ 200 (obtenus auprès de la population en âge de synchrone des étapes vers) pour les e. coli graines NGM Arni plaques d’alimentation. Incuber les plaques à 20 ° C jusqu'à ce que les larves atteignent le stade de L4 (~2.5 jours).
6. préparation des streptocoques du groupe Mitis pour Infection
- -Ensemencer sur désiré souches de streptocoques sur le 100 mm x 15 mm ton agar (si les plaques étaient stockés à 4 ° C, préchauffer les plaques à 37 ° C avant les souches respectives des stries), puis incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit (~ 18 h) dans un pot de bougie fournissant un microaérophiles fr vironment pour la croissance des streptocoques (les géloses ensemencées peuvent être stockés pendant une semaine à 4 ° C).
- Pour repropager les isolats cliniques de streptocoques, utilisez gélose trypticase soja au sang. Incuber les plaques à 37 ° C dans un pot de bougie toute la nuit (~ 18 h).
- Le lendemain, enlever les plaques à partir du pot de bougie et prélever des colonies isolées à l’aide d’une anse stérile. Ensemencer le stériles tubes coniques 15 mL 2 mL de ton bouillon. Pour propager des isolats cliniques des streptocoques, compléter le THY bouillon avec 5 % v/v de sang de mouton. Fermer les bouchons étanches et incuber les tubes à 37 ° C dans des conditions statiques.
7. des analyses de survie
Remarque : Les étapes de ce test sont représentés dans la Figure 1. Pour démontrer que l’H2O2 dérivé de la mitis groupe est responsable du meurtre du ver, de compléter les médias avec la catalase ou la souche mutante ΔspxB et de complément souche ΔspxB ; spxB + de S. gordonii peut être utilisé. SpxB code pour une oxydase de pyruvate, qui est responsable de la production de H2O2 dans le groupe de la mitis.
- 35 x 10 mm pour les préchauffer tes plaques à 37 ° C. Ajouter 80 µL de nuit cultures cultivées des souches de streptocoques désirés et transmettre la bactérie complètement à travers la surface de la gélose à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber les plaques à 37 ° C dans un pot de bougie toute la nuit (~ 18 h). Comme contrôle, graine deux 35 mm x 10 mm NGM plaques 80 µl de nuit cultures cultivées d’e. coli OP50. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
- Pour confirmer que la H2O2 produites par le groupe de la mitis est responsable de la mise à mort vers, ajouter 50 µL contenant 1 000 unités de catalase c sur la ta plaque. Répandre la solution de catalase, à l’aide d’un épandeur stérile et laisser les plaques sécher dans l’écoulement laminaire pour 30 min. semences les plaques par la suite avec les souches de streptococcus respectifs comme indiqué au point 7.1.
- Le lendemain, retirer les plaques du pot bougie et permettent de choisir les plaques refroidir à RT pendant 10-15 min. à l’aide d’un ver stérile, transfert 30 larves de L4 de la NGM ou RNAi NGM alimentation des plaques le streptocoque graines tes plaques. Utilisez les deux graines tes plaques avec un total de 60 vers par la souche de streptocoques. Incuber les boîtes à 25 ° C.
- À l’aide d’un microscope à dissection, compter le nombre de morts et vivants larves de L4 sur chaque plaque à plusieurs points. Au départ, marquer les vers comme morte ou vivre chaque 30 min. Par la suite, lorsque les vers commencent rapidement à mourir, leur score à intervalles de 15 min. Utiliser le prélèvement stérile ver doucement prod les vers et déterminer s’ils sont morts ou vivants. Un ver est considérée comme morte s’il n’y a aucun mouvement en réponse à l’insistance.
- L’analyse prendra 5-6 h pour terminer. Répétez l’expérience deux fois plus. À l’issue du test, mettre en commun les données provenant des deux plaques. Entrez les données de chaque groupe, comparer les courbes de survie et effectuer l’analyse de survie de Kaplan-Meier à l’aide d’un logiciel de statistique.
8. préparation des coussinets de gel d’Agarose pour la microscopie
- Dissoudre 2 % p/v d’agarose dans l’eau désionisée en chauffant la solution dans un four à micro-ondes. Un volume de 5 mL de solution est suffisant pour préparer 20 diapositives.
- Bande de laboratoire tenir sur la longueur le long de deux lames de verre. Ceci déterminera l’épaisseur des plaquettes d’agarose. Placez une lame de verre propre entre les deux diapositives collées.
- Place 100 µL d’agarose fondu sur le centre de la lame propre. Placer immédiatement un autre verre propre sur le dessus de l’agarose fondu et appuyer doucement pour faire un coussin. Permettre l’agarose à solidifier et à retirer par la suite la glissière supérieure. Le coussin de gel d’agarose est prêt à l’emploi.
9. l’observation de la localisation de SKN-1 en réponse à l’Infection à streptocoque
Remarque : Les étapes de ce test sont représentés dans la Figure 2. Localisation de SKN-1 a été déterminée à l’aide de la souche de ver transgéniques SKN-1 b/C::GFP. Pour démontrer la localisation de SKN-1 en raison de la production de H2O2 par le groupe de la mitis, sauvage (WT), ΔspxB et le complément souche ΔspxB ; spxB + de S. gordonii ont été utilisés. Par ailleurs, le journaliste transgéniques souche SKN-1 b/C::GFP et la technique d’interférence d’Arni ont servi à démontrer que les composantes de la voie MAPK p38 réglementent la localisation de SKN-1.
- 35 x 10 mm pour les préchauffer tes plaques à 37 ° C. Ajouter 80 µL de nuit cultures cultivées des souches de streptocoques désirés et transmettre la bactérie complètement à travers la surface de la gélose à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber les plaques à 37 ° C dans un pot de bougie toute la nuit (~ 18 h). Comme contrôle, graines trois 35 x 10 mm NGM plaques 80 µl de nuit cultures cultivées d’e. coli OP50. Ces incuber à 37 ° C pendant environ 18 h.
- Le lendemain, enlever les plaques à partir du pot de bougie et laisser les plaques refroidir à RT pendant 10-15 min. L4 lavage larves à l’aide de M9W de NGM et Arni NGM alimentation. Recueillir les vers dans les tubes coniques 15 mL.
- Faites tourner les tubes à 450 x g pendant 1 min. décanter le liquide surnageant et ajouter 10 mL de M9W.
- Répétez l’étape 9.3 trois fois plus.
- Remettre en suspension les vers en ~ 250 µL de M9W et place gouttes trois 5 µL de la suspension de ver sur un couvercle de boîte de pétri propre et estimer le nombre de vers par µL à l’aide d’un microscope à dissection.
- Ajouter 100 ~ L4 larves à chacun ton streptococcus épépiné et plaques NGM e. coli graines. Utiliser trois plaques par la souche de la bactérie. Incuber les boîtes pendant 2 à 3 h à 25 ° C.
- Par la suite, enlever les plaques de l’incubateur, lavez-les avec M9W et recueillir les vers dans les tubes coniques 15 mL.
- Laver les vers 3 x tel que décrit dans les étapes 9.3.
- Enlever la plupart de la M9W par aspiration et ajouter 500 µL de M9W contenant 2 mM sodium azide ou 2 mM tétramisole chlorhydrate au culot ver. Cela va anesthésier les vers, en veillant à ce qu’aucun mouvement ne lorsqu’imagée sous le microscope.
Mise en garde : Utiliser l’équipement de protection individuelle (EPI) lors de la manipulation de l’azide de sodium. Préparer la solution d’azoture sous une hotte chimique. - Incuber les pellets ver à ta pendant 15 min. Ensuite, repérez les 15 µL de la suspension de ver sur un bloc de prêts d’agarose. Placez délicatement un lamelle couvre-objet no 1.5 sur le pad d’agarose contenant les vers anesthésiés.
- À l’aide d’un microscope à fluorescence, visualiser la localisation de l’utilisation de SKN-1 filtre FITC et DAPI. Image vers à 10 x et 20 x grossissements.
- Marquer les vers selon le niveau de la localisation de SKN-1. Aucune localisation nucléaire, localisation de SKN-1 b/C::GFP dans l’antérieur ou postérieur du ver et localisation nucléaire de SKN-1 b/C::GFP dans toutes les cellules intestinales ne sont classés comme faible, moyen et des niveaux élevés de localisation, respectivement.
- Après avoir marqué la microscopie fluorescente, déterminer les différences statistiques par chi-squared et tests exacts de Fisher, à l’aide d’un logiciel de statistique.
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Representative Results
De la mitis, les membres du groupe S. mitis, S. oralis et S. gordonii rapidement tué les vers, par opposition à S. mutans, S. salivarius et non pathogène e. coli OP50 (Figure 3A). La médiane de survie pour S. mitis, S. oralis et S. gordonii était de 300 min 300 min et 345 min, respectivement. Pour déterminer si le meurtre a été véhiculé par H2O2, catalase a été complétée à ton agar. La mise à mort vers a été abolie en présence de catalase (Figure 3B). Pour confirmer si le streptocoque dérivée H2O2 médiée meurtre de worms, la survie sur la souche mutante de la ΔspxB la souche WT et complément souche ΔspxB ; spxB + de S. gordonii a été analysée. Mort vers n’a pas été observée sur la souche mutante de ΔspxB , par rapport à la souche sauvage et compléter les souches (Figure 3C). Ces données suggèrent que l’H2O2 produites par le groupe mitis intervient dans la mise à mort vers. Nous avons également observé cinétique de meurtre similaire lorsque les vers ont été exposés à des isolats cliniques des mitis streptocoques provenant du sang de patients atteints de cancer (Figure 3D). Selon les données, la pathogénicité causée par H2O2 produites par les streptocoques de groupe mitis a été évaluée.
Pour identifier les gènes hôtes essentiels contre les infections à streptocoques, skn-1 a été renversé, qui code pour le facteur de transcription de réponse de stress oxydatif dans c. elegans. Puis, par rapport au vecteur contrôle traitée vers la survie a été comparée. Une diminution significative de la survie vers knockdown skn-1 a été observée par rapport à la vector control traité worms (Figure 4A). Ces données a été encore validées à l’aide d’une souche mutante de skn-1 , et sa survie a été comparée à celle vers N2 sauvage. Nous avons observé un phénotype similaire de meurtre comme le mutant skn-1 , comme on le voit avec le knockdown skn-1 , ce qui démontre que SKN-1 influence la survie vers sur le groupe mitis (Figure 4B).
Ensuite, il a été déterminé si l’H2O2 produite par le groupe de la mitis causé localisation de SKN-1 b/C::GFP dans les vers. Localisation de SKN-1 b/C::GFP a été observée chez les vers exposés au type sauvage et taches de complément et non en réponse à la souche mutante despxB Δ s. gordonii (Figure 5A, B). En outre, pour déterminer l’activation de SKN-1, les composants de la voie de p38 MAPK sont fauchés. Localisation réduite de SKN-1 b/C::GFP à worms knockdown nsy-1, sek-1, PCM-1 et skn-1 par rapport au vecteur contrôle traité vers a été observée. Les données indiquent le p38 que MAPK est nécessaire pour l’activation de SKN-1 en réponse à H2O2 produites par le groupe de la mitis (Figure 5C, D).
Figure 1 : Diagramme illustrant les étapes de préparation des essais survie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Diagramme illustrant les étapes de localisation de SKN-1 au cours de l’infection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : H2O2-mediated tuant de c. elegans de streptocoques du groupe mitis. Courbes de survie de Kaplan-Meier de L4 larves exposées à (A) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans et e. coli OP50. (B) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans et e. coli OP50 sur tes plaques en présence de 1 000 U de la catalase. (C) S. gordonii WT, mutantspxB Δ et ΔspxB ; spxB + complément les souches sur des larves de N2 L4. (D) S. oralis (VGS #3), S. oralis (VGS #4), S. mitis (VGS n ° 10), S. mitis (VGS #13) et e. coli OP50. Les données sont représentatives des expériences répétées deux ou plusieurs fois, avec n = 60 worms pour chaque condition. Rang analyse de Kaplan-Meier journal a été utilisé pour comparer les courbes de survie afin de calculer la médiane de survie. Les valeurs de P < 0,05 étaient considérés comme statistiquement significatifs. Ce chiffre a été modifié et adapté avec la permission de15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : SKN-1 est nécessaire pour la survie vers sur S. gordonii. (A) survie de lutte antivectorielle traités et skn-1 vers knockdown exposés à S. gordonii. (B) la survie de la N2 et les mutants vers skn-1(zu67) se nourrissent S. gordonii. Les données sont représentatives des expériences répétées deux ou plusieurs fois, avec n = 60 worms pour chaque condition. Rang analyse de Kaplan-Meier journal a été utilisé pour comparer les courbes de survie afin de calculer la médiane de survie. Les valeurs de P < 0,05 étaient considérés comme statistiquement significatifs. Ce chiffre a été modifié et adapté avec la permission de15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Streptocoque H2O2 médiée par activation de SKN-1 dépend de la voie de p38 MAPK. (A) des images représentatives de la localisation de SKN-1 b/C::GFP à worms, exposés à la WT, mutantspxB Δ et ΔspxB ; spxB + complément des souches de S. gordonii. Gros plans sont indiquées dans les coins supérieur droit de chaque image. Echelle = 100 µm. (B), le degré de localisation nucléaire de SKN-1 b/C::GFP et pourcentage vers dans chaque catégorie se nourrissent WT, mutantspxB Δ et ΔspxB ; spxB + complément des souches de S. gordonii. Significativement les faibles niveaux de localisation nucléaire de SKN-1 b/C::GFP ont été observés chez le mutant despxB Δ (p < 0,0001) par rapport aux versions WT et ΔspxB ; spxB + complément souches de S. gordonii. (C) des images représentatives de la localisation de SKN-1 b/C::GFP en nsy-1 sek-1, PCM-1, skn-1 knockdown et lutte antivectorielle traitement vers le S. gordonii. Gros plans sont indiquées dans les coins supérieur droit de chaque image. Echelle = 100 µm. (D) le degré de localisation nucléaire SKN-1 b/C::GFP et pourcentage vers dans chaque catégorie se nourrissent de nsy-1, sek-1, PCM-1, knockdown skn-1 et la lutte antivectorielle traités Worms sur S. gordonii. On a observé une faibles niveaux de localisation nucléaire de SKN-1 b/C::GFP nsy-1 (p < 0,01), sek-1 (p < 0,001), PCM-1 (p < 0,0001), précipitationet skn-1 (p < 0,0001) par rapport au vecteur commande traitée vers le S. gordonii. Plus de 100 vers exposés à chaque souche ont été imagées, et l’expérience a été répétée trois fois. Ce chiffre a été modifié et adapté avec la permission de15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les méthodes décrites peuvent être utilisés pour d’autres bactéries pathogènes telles que Enterococcus faecium, qui produit aussi H2O2 cultivés en anaérobie ou26des conditions microaérophiles. En général, pour les plus pathogènes, il faut plusieurs jours à semaines pour réaliser les essais de survie. Toutefois, en raison de la production robuste de H2O2 par les membres du groupe mitis, ces épreuves pourraient être complétées dans les 5-6 h, dans les conditions décrites. Cela garantit la possibilité de présenter plusieurs candidats de gènes impliqués dans l’immunité de l’hôte et la réponse au stress oxydatif pendant une courte période.
Dans ce protocole, H2O2 produite par la bactérie est en contact direct avec les cellules intestinales du ver, par opposition à d’autres sources ROS exogènes que doit franchir plusieurs obstacles. Cela garantit que le H2O2 est livré aux cellules intestinales ; par conséquent, une réponse plus robuste de la mise à mort est observée dans le ver. À l’aide de bactéries fluorescent étiquetés, il a été déterminé que les vers doivent être exposés à des agents pathogènes par 30 min pour la colonisation du tractus intestinal15complete. Il est conseillé d’utiliser moins de 1 semaine vieilles plaques de strie de souches de streptocoques à assurer leur viabilité et leur capacité à produire H2O2. En outre, les souches de streptocoques doivent être cultivés dans des conditions microaérophiles pour une production optimale de H2O2. L4 larves ou adultes âgés de 1 jours peuvent être utilisés pour ce test. Il est essentiel que tous les vers utilisés lors d’une expérience sont du même âge et le sexe. Vers plus jeunes ont tendance à mourir plus lentement par rapport aux anciennes hermaphrodites. L4 animaux est distingue plus facilement car leur vulve en développement est visible au milieu du corps comme une tache claire qui contraste avec le reste du corps. Il est également important qu’aucun OP50 d’e. coli ne sont transférées vers les plaques de streptocoque ensemencée. Contamination du meurtre de plaques à e. coli peut causer l’atténuation ou l’abrogation du meurtre vers. Pour éviter toute contamination, il est nécessaire de choisir vers loin de la pelouse d’e. coli . Quand marquer les essais de survie, il est conseillé d’observer le pharynx de pompage, alimentation de comportement de la tête et le mouvement du corps. Pour faire en sorte que le ver est mort, il est recommandé de doucement prod le nez, à côté du corps, ou de queue et observer tout mouvement.
Arni d’alimentation et de la survie vers sur le groupe de la mitis ont été combinées pour identifier les candidats qui sont impliqués dans la défense contre H2O2. En utilisant le gène skn-1 codant pour un facteur de transcription de la réponse du stress oxydatif, son exigence pour la survie du ver en réponse à H2O2 est démontré ici. Par conséquent, ce test peut être adapté à l’écran pour plusieurs gènes et identification des candidats potentiels pour l’immunité et la réponse au stress oxydatif. Arni nourrir vers est obtenue en ajoutant l’âge synchronisée larves L1 à la RNAi exprimant des pelouses d’e. coli . Pendant le protocole de synchronisation ver, il est essentiel de surveiller la lyse de la cuticule de ver en présence d’eau de Javel et d’hydroxyde de sodium. La cuticule des adultes et des larves vont continuellement se dissoudre, tandis que les embryons sont partiellement protégées par la coquille épaisse. Toutefois, une incubation prolongée en présence de la combinaison de l’hydroxyde de sodium blead peut provoquer les embryons à mourir. Par conséquent, il est important d’observer le tube contenant les vers sous un microscope à dissection périodiquement pendant le blanchiment. Une autre étape à considérer dans le protocole de synchronisation est le maintien de l’arrêté larves L1. Les larves arrêtées peuvent être maintenues sur le rotateur de tube pendant 5 jours à température ambiante. Il est recommandé d’utiliser les larves d’Arni alimentation en 1 à 2 jours après l’éclosion. Maintenance prolongée en M9W peut entraîner la formation de la phase de dauer.
Enfin, un ver transgénique exprimant SKN-1 fusionnée à la GFP a été utilisé pour contrôler l’activation de la réponse au stress oxydatif en présence du groupe mitis. Par Arni, il est démontré que les composants de la p38 MAPK sont requis pour la localisation de SKN-1 b/C::GFP pour les noyaux des cellules intestinales. Il est important d’utiliser les stades L3 ou L4 de cette souche pour observer la localisation des SKN-1 b/C::GFP, comme la localisation de SKN-1 tend à diminuer chez les adultes. Afin de mieux observer la localisation de SKN-1 b/C::GFP, il est conseillé de se chevaucher les images obtenues en utilisant les paramètres de filtre FITC et DAPI. Autofluorescence générés par les lipofuscins aider à fournir de contraste pour l’observation de la localisation de SKN-1 dans le ver. Toutefois, il a également été démontré que le signal des journalistes GFP faiblement exprimées est masqué par autofluorescence émise par diverses sources dans le tube digestif du ver. Autofluorescence a été montré pour augmenter avec l’âge et est plus haut dans l’intestin et l’utérus des elegans de Caenorhabditis27. Pour surmonter ce problème, une récente étude a utilisé une configuration de filtre GFP tri-bande pour surveiller la localisation de SKN-1 b/C::GFP dans c. elegans,28. Cette configuration sépare le signal de la GFP d’autofluoresence, afficher la GFP et autofluoresence dans les canaux verts et jaunes, respectivement.
C. elegans est utilisé dans le présent protocole pour étudier les interactions hôte-pathogène et déterminer comment H2O2 produites par le groupe mitis provoque la pathogénicité. Plus important encore, en utilisant ce modèle, les effets de H2O2 sur endoplasmiques réticulaires stress, lésions mitochondriales, mitophagy, autophagie et stress oxydatif peuvent être étudiées. En outre, les mécanismes par lesquels H2O2 agit comme un facteur de virulence pour susciter des réponses immunitaires en perturbant le processus de base de la cellule peuvent être identifiés. Par conséquent, ce ver est reconnu comme un système modèle puissant pour découvrir de nouvelles connaissances sur les interactions hôte-pathogène.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions m. Bing-Yan Wang, Dr Gena Tribble (The University of Texas, école de médecine dentaire), Dr. Richard Lamont (Université de Louisville, école de médecine dentaire) et le Dr Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) pour la fourniture de laboratoire et des souches cliniques de Les streptocoques de groupe mitis. Nous remercions également m. Keith Blackwell (département de génétique, Harvard Medical School) pour les souches de c. elegans . Enfin, nous remercions le Dr Danielle Garsin et son laboratoire (The University of Texas, faculté de médecine de McGovern) pour la fourniture de réactifs et souches de ver pour mener l’étude. Certaines souches de ver ont été fournis par la CCG, qui est financée par le NIH bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
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