Summary
Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans ist ein hervorragendes Modell, Wirt-Pathogen Interaktionen zu zergliedern. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zu infizieren den Wurm mit den Mitgliedern der Gruppe Streptokokken Mitis und Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion gegen H2O2 produziert von dieser Gruppe von Organismen zu bestimmen.
Abstract
Caenorhabditis Elegans (C. Elegans), eine freilebende Nematode, entstanden als ein attraktives Modell für Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen. Die vorgestellte Protokoll verwendet dieses Modell um die Pathogenität von Mitis Gruppe Streptokokken über die Herstellung von H2O2verursacht zu bestimmen. Mitis Gruppe Streptokokken sind eine neue Bedrohung, die vielen menschlichen Krankheiten wie Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone verursachen. Hier beschriebenen entsteht ein Protokoll, um das Überleben dieser Würmer als Reaktion auf H2O2 festzustellen durch diese Gruppe von Krankheitserregern. Mithilfe der gen Skn-1 Codierung für einen Transkriptionsfaktor oxidativen Stress Reaktion, wird es gezeigt, dass dieses Modell wichtig ist für die Identifizierung von Host-Genen, die gegen Streptokokken-Infektion sind. Darüber hinaus wird gezeigt, dass Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion in Gegenwart dieser Erreger mit einem transgenen Reporter Wurm Stamm, in der SKN-1, grün fluoreszierendes Protein (GFP) verschmolzen wird überwacht werden kann. Diese Tests bieten die Möglichkeit, die oxidativen Stress-Reaktion auf H2O2 abgeleitet von einer biologischen Quelle im Gegensatz zu exogen studieren reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) Quellen hinzugefügt.
Introduction
Mitis Gruppe Streptokokken sind menschliche Kommensalen der oropharyngealen Hohlraum1. Diese Organismen können jedoch diese Nische zu entkommen und eine Vielzahl von invasiven Erkrankungen2verursachen. Infektionen durch diese Mikroorganismen gehören Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone2,3,4,5,6. Darüber hinaus entstehen sie als Erreger von Infektionen der Blutbahn in immungeschwächten, neutropenisch und Krebspatienten, die Chemotherapie5,7,8,9 durchlaufen haben .
Die Mechanismen, die zugrunde liegenden Mitis Gruppe Pathogenese ist dunkel, weil einige Virulenzfaktoren identifiziert wurden. Mitis Gruppe ist bekannt, H2O2, zu produzieren, die gezeigt hat, eine wichtige Rolle in oralen mikrobiellen Lebensgemeinschaften10spielen. Mehrere Studien haben vor kurzem eine Rolle für H2O2 als ein Zytotoxin hervorgehoben, die Epithelzelle Tod11,12induziert. S. Lungenentzündung, die zu dieser Gruppe gehört hat gezeigt, dass hohe Konzentrationen von H2O2 zu produzieren, die DNA-Schädigung und Apoptose in alveoläre Zellen13induziert. Mit einer akuten Lungenentzündung Tiermodell, zeigten die gleichen Forscher, dass die Produktion von H2O2 von den Bakterien einen Virulenz Vorteil verschafft. Studien über Pneumokokken Meningitis haben auch gezeigt, dass dieser Erreger abgeleitet H2O2 wirkt synergistisch mit Pneumolysin neuronale Zelle Tod14auslösen. Diese Beobachtungen stellen klar, dass H2O2 produziert von dieser Gruppe von Bakterien für wichtig, dass ihre Pathogenität.
Interessanterweise hat sich auch gezeigt, dass Mitglieder der Mitis S. Mitis und S. Oralis verursachen Tod von den Nematoden C. Elegans über die Herstellung von H2O215,16. Diese freilebenden Nematoden diente als ein einfaches, genetisch gefügig Modell, viele biologische Prozesse zu studieren. Vor kurzem hat der Wurm ein Modell zur Wirt-Pathogen Interaktionen17,18entwickelt. Mehrere Studien haben darüber hinaus die Bedeutung des Studiums oxidativen Stress mit diesem Organismus19,20,21hervorgehoben. Seine kurzen Lebenszyklus, Knockdown Gene des Interesses von RNAi und Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-fused Reporter, Genexpression zu überwachen sind einige der Attribute, die eine attraktives Modellsystem machen. Noch wichtiger ist, sind die Wege, die Regulierung von oxidativem Stress und angeborene Immunität in der Wurm mit Säugetieren20,22hoch konserviert.
In diesem Protokoll wird gezeigt wie C. Elegans zu verwenden, um die Pathogenität, verursacht durch Streptokokken abgeleitet H2O2aufzuklären. Ein modifizierte überleben Assay gezeigt, und Mitglieder des Arbeitskreises Mitis sind in der Lage, schnell die Würmer zu töten über die Produktion von H2O2. Mit Mitgliedern des Arbeitskreises Mitis, eine nachhaltige biologische Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), im Gegensatz zu chemischen Quellen erfolgt, die oxidativen Stress in den Würmern zu induzieren. Darüber hinaus können die Bakterien besiedeln die Würmer schnell, wodurch für H2O2 direkt ausgerichtet werden, um die Darmzellen (im Vergleich zu anderen Quellen, die mehrere Hindernisse zu überqueren). Der Test wird überprüft, entweder (1) durch Bestimmung das Überleben der Mutante Skn-1 oder 2) durch Skn-1 mit RNAi in Worms im Verhältnis zu der N2 Wildtyp und Vektor-Steuerelement behandelt Würmer umzuwerfen. SKN-1 ist eine wichtige Transkriptionsfaktor, die die oxidativen Stress-Reaktion in C. Elegans23,24,25regelt. Zusätzlich zu überleben-Assays ist Wurm verwendet ein Stamm mit dem Ausdruck eines SKN-1 b/C::GFP transgenen Reporters zur Aktivierung der oxidativen Stress Reaktion über die Produktion von H2O2 Überwachung von Mitis-Gruppe.
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Protocol
1. Vorbereitung von deinem Agarplatten (Todd Hewitt Hefeextrakt)
- Fügen Sie für 1 L Medien 30 g Todd Hewitt Pulver, 2 g Hefeextrakt und 20 g Agar, ein 2 L-Erlenmeyerkolben hinzu. Der Inhalt des Kolbens 970 mL entionisiertem Wasser hinzu und bestehen aus einer Stir Bar. Autoklaven der Medien bei einer Temperatur von 121 ° C und Druck von 15 lb/Inch2 für 30 min. Danach legen Sie die Medien auf einem Teller rühren und zur Kühlung mit schonenden rühren lassen.
- Gießen Sie die Medien entsprechend dimensionierte sterile Petrischalen (100 x 15 mm Gerichte für Wachstum und Erhalt von Bakterien, 35 x 10 mm Gerichte für das Töten von Assays) unter eine laminare Strömung. Lassen Sie die Medien für 2 h unter der laminar Haube trocknen. Danach können die Platten für 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
2. Vorbereitung der Nematoden Wachstumsmedium (NGM) und RNAi Fütterung Platten (NGM RNAi)
- Mit einer Aufregung, lösen Sie 2,5 g Pepton und 3 g NaCl in 970 mL entionisiertem Wasser in einen 2 L-Erlenmeyer-Kolben auf. Das Medium 20 g Agar-Agar hinzufügen. Autoklaven der Medien bei einer Temperatur von 121 ° C und Druck von 15 lb/Inch2 für 30 min. Stellen Medien auf einem Teller rühren und zur Kühlung mit schonenden rühren lassen.
- Fügen Sie die folgenden Lösungen an die Medien für die Vorbereitung der NGM Platten: 25 mL 1 M-Kalium-Phosphat-Puffer (pH-Wert = 6,0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL in 95 % igem Ethanol) Cholesterin , 1 mL (10 % V/w im Äthanol) Nystatin und 1 mL von 25 mg/mL Streptomycin.
- Fügen Sie die folgenden Lösungen an die Medien für die Vorbereitung der NGM RNAi Fütterung Platten: 25 mL 1 M-Kalium-Phosphat-Puffer (pH-Wert = 6,0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL in 95 % igem Ethanol) Cholesterin , 1 mL (10 % V/w im Äthanol) Nystatin, 1 mL 50 mg/mL Carbenicillin und 1 mL IM IPTG.
- Gießen Sie die Medien in 60 x 15 mm sterile Petrischalen unter Laminar-Flow. Lassen Sie die Medien für 2 h unter der laminar Haube trocknen. Anschließend können Platten für 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
3. Wartung von C. elegans
- Samen der NGM-Platten von spotting 50 µL über Nacht gewachsen E. Coli OP50 in der Mitte der Platten. Die E. Coli -Kultur ist in Luria-Bertani (LB) Medien zuvor vorbereitet und für mehrere Monate bei 4 ° C gelagert. Deckplatten Sie die ab und lassen sie trocknen für 24 h unter laminar Haube und danach die Platten in Styropor Behälter aufbewahren.
- Unter dem sezierenden Mikroskop, 10 bis 12 trächtigen Erwachsene mit einem sterilen Wurm Pick Abholung und transfer der Würmer zu einem E. Coli OP50 ausgesät NGM Platte. Inkubieren Sie die Platten bei 20 ° C über Nacht.
- Am nächsten Tag nehmen Sie die Erwachsenen mit einem sterilen Wurm Pick und die Embryonen, L4-Larven bei 20 ° C (~2.5 Tage) zu entwickeln.
4. Vorbereitung der synchronen Bevölkerung im Alter von Worms
-
Waschen Sie trächtigen Erwachsene zwei bis vier NGM-Platten mit M9W und sammeln sie in einem 15 mL konische Röhrchen.
- M9W vorbereiten: 3 g NaCl, Na2HPO46 g und 3 g KH2PO4 kombinieren und in einem Endvolumen von 1 L entionisiertem Wasser auflösen. Autoklaven die Lösung und 1 mL 1 M MgSO4.
- Drehen Sie das Rohr auf 450 X g für 1 min, dann Dekantieren Sie überstand dabei sicherzustellen, dass der Wurm Pellet intakt bleibt.
- Fügen Sie 400 µL 8,25 % Natriumhypochlorit (Haushalt Chlorid) und 100 µL 5 N NaOH, der Wurm Lyse Lösung vorzubereiten. Das Wurm-Pellet die Lyse-Lösung hinzu und mischen Sie den Inhalt durch das Rohr zu streichen, bis 70 % der Erwachsenen Würmer lysiert werden. Der Inhalt des Röhrchens unter dem sezierenden Mikroskop um sicherzustellen, dass es keine overbleaching der Eier in regelmäßigen Abständen zu beobachten.
- Verdünnen Sie die Bleichmittel-Mischung durch Zugabe von 10 mL M9W auf den Inhalt des konischen Rohres.
- Drehen Sie das Rohr auf 450 X g für 1 min. Dekantieren überstand, dann fügen Sie 10 mL M9W.
- Wiederholen Sie Schritt 4.5 zwei weitere Male.
- Das daraus resultierende Ei Pellet in 3-5 mL M9W aufzuwirbeln. Legen Sie das Rohr auf ein Rohr-Rotator. Lassen Sie die Röhrchen mit einer Geschwindigkeit von 18 u/min bei Raumtemperatur (RT) über Nacht drehen.
- Drehen Sie am nächsten Tag, das Rohr auf 450 X g für 1 min um die L1-Larven pellet. Entfernen Sie die meisten M9W durch Absaugen, ~ 250 µL Flüssigkeit im Rohr zu hinterlassen. Die L1-Larven Aufschwemmen und Platz drei 5 µL sinkt der Wurm Suspension auf einer Petrischale Deckel, dann die Schätzung der Anzahl der Würmer pro Mikroliter sezierenden Mikroskop.
5. Induktion von RNAi in Worms
- Mit einer sterilen Schleife oder abholen, Streifen, die gewünschte Stämme von RNAi-haltigen E. Coli aus gefrorenen Beständen (Ahringer und Vidal-Bibliotheken) auf 100 x 15 mm LB-Agar-Platten mit 50 µg/mL Carbenicillin und 15 µg/mL Tetracyclin. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h.
- Wählen Sie und impfen Sie eine isolierte Kolonie aus dem gewünschten RNAi-Stamm in sterilen 15 mL konische Röhrchen mit 2 mL LB ergänzt mit 50 µg/mL Carbenicillin zu. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C 16 h in einem Orbitalschüttler bei 150 u/min.
- Am nächsten Tag verteilt 150 µL über Nacht gewachsenen Kultur auf 65 mm x 15 mm NGM RNAi Fütterung Teller mit einem sterilen Spreader. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h.
- Platten Sie die auf RT nach Inkubation bei 37 ° c abkühlen Fügen Sie eine entsprechende Volumen der M9W mit ~ 200 L1-Larven (synchrone Bevölkerung im Alter von Würmern Schritte entnommen), die E. Coli NGM RNAi Fütterung Platten ausgesät. Inkubieren Sie die Platten bei 20 ° C, bis die Larven der L4-Stadium (~2.5 Tage) erreichen.
6. Vorbereitung des Mitis Gruppe Streptokokken-Infektion
- Streifen, gewünschte Streptokokken-Stämme auf die 100 mm x 15 mm dein Agar (wenn Platten bei 4 ° C gelagert wurden, Vorwärmen der Platten auf 37 ° C vor dem Streifen der jeweiligen Stämme), inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C über Nacht (~ 18 h) in eine Kerze Glas bietet eine mikroaerophil En Umfeld für das Wachstum der Streptokokken (die gestreiften Platten können für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden).
- Verwenden Sie zur klinischen Isolaten von Streptokokken zu propagieren, tryptic Soy Blutagar. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in einem Kerze Glas über Nacht (~ 18 h).
- Am nächsten Tag die Platten aus dem Glas Kerze ausbauen und isolierte Kolonien mit einer sterilen Schleife wählen. 15 mL sterile konischen Röhrchen mit 2 mL deine Brühe zu impfen. Um zu klinischen Isolaten von Streptokokken zu propagieren, ergänzen die THY Brühe mit 5 % V/V Schafe Blut. Schließen Sie die Deckel fest und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C unter statischen Bedingungen.
(7) überleben Assays
Hinweis: Die Schritte in diesem Test sind in Abbildung 1dargestellt. Um nachzuweisen, dass die H2O2 durch die Mitis abgeleitet Gruppe ist verantwortlich für die Tötung des Wurms, die Medien mit Katalase oder Mutante ΔSpxB ergänzen und Ergänzung Stamm ΔSpxB; SpxB + S. Gordonii können verwendet werden. SpxB kodiert für eine Pyruvat-Oxidase, die für die Produktion von H2O2 im Gruppenrahmen Mitis verantwortlich ist.
- 35 mm x 10 mm Vorwärmen deine Platten auf 37 ° C. Fügen Sie 80 µL über Nacht gewachsenen Kulturen der gewünschten Sorten der Streptokokken und die Bakterien vollständig über die Agar-Oberfläche mit einem sterilen Spreader verteilt. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in einem Kerze Glas über Nacht (~ 18 h). Als Kontrolle Samen zwei 35 mm x 10 mm NGM Platten mit 80 µL über Nacht gewachsenen Kulturen von E. Coli OP50. Über Nacht inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C.
- Um zu bestätigen, dass H2O2 produziert von Mitis Gruppe verantwortlich für die Tötung der Würmer ist, fügen Sie 50 µL mit 1.000 Einheiten der Katalase c auf der THY Platte. Die Katalase-Lösung mit einem sterilen Spreader verteilt und die Platten zum Trocknen in die laminare Strömung für 30 min. Samen die Platten danach mit den jeweiligen Streptokokken-Stämme wie unter Punkt 7.1 beschrieben.
- Am nächsten Tag entfernen Sie die Platten aus dem Glas Kerze und wählen Sie die Platten auf RT für 10-15 min. mit einem sterilen Wurm abkühlen, Transfer 30 L4-Larven von der NGM oder NGM RNAi Fütterung Platten zu den Streptokokken ausgesät deine Platten. Verwendung zwei ausgesät deine Platten mit insgesamt 60 Würmer pro Stamm der Streptokokken. Inkubieren Sie die Platten bei 25 ° C.
- Mit einem sezierenden Mikroskop, die Anzahl der lebenden und Toten L4-Larven auf jeder Platte an mehreren Zeitpunkten. Zunächst Punkten Sie die Würmer als tot oder Leben Sie alle 30 Minuten. Danach, wenn Würmer schnell anfangen zu sterben, Punkten sie in 15 Minuten Intervallen. Verwenden Sie die sterile Wurm-Pick, um sanft prod die Würmer und festzustellen, ob sie tot oder lebendig sind. Ein Wurm ist tot betrachtet, wenn keine Bewegung als Reaktion auf das drängen.
- Der Test dauert ca. 5-6 h in Anspruch. Wiederhole das Experiment zwei weitere Male. Nach Abschluss des Tests bündeln Sie die Daten aus den beiden Platten. Geben Sie die Daten der einzelnen Gruppen, vergleichen Sie die Überleben Kurven und durchführen Sie Kaplan-Meier Analyse mittels statistischen Software.
8. Vorbereitung der Agarose-Pads für die Mikroskopie
- Lösen Sie 2 % w/V der Agarose in entionisiertem Wasser durch Erhitzen der Lösung in der Mikrowelle auf. Ein Volumen von 5 mL der Lösung ausreicht, um die 20 Folien vorzubereiten.
- Kleben Sie Lab-Band längs zwei Objektträger. Dies bestimmt die Dicke der Agarose-Pads. Legen Sie eine sauberes Glas Folie zwischen den zwei verschweißten Folien.
- Platz 100 µL der geschmolzenen Agarose auf der Mitte der Folie sauber. Legen Sie sofort ein anderes sauberes Glas auf die flüssige Agarose und drücken Sie sanft nach unten, um ein Pad zu machen. Lassen Sie die Agarose zu festigen und anschließend die obere Folie entfernen. Die Agarose-Pad ist einsatzbereit.
9. Beobachtung der SKN-1 Lokalisierung in Reaktion auf eine Streptokokken -Infektion
Hinweis: Die Schritte in diesem Test sind in Abbildung 2dargestellt. Lokalisierung von SKN-1 wurde unter Verwendung der SKN-1 b/C::GFP transgenen Wurm Belastung bestimmt. Lokalisierung von SKN-1 durch die Produktion von H2O2 Mitis Fraktion, Wildtyp (WT), ΔSpxB, und die Ergänzung Stamm ΔspxB; SpxB + S. Gordonii demonstrieren dienten. Darüber hinaus wurden die transgenen Reporter Belastung SKN-1 b/C::GFP und RNAi Störungen Technik zu demonstrieren, dass Komponenten des p38 MAPK-Signalwegs die Lokalisierung der SKN-1 regulieren verwendet.
- 35 mm x 10 mm Vorwärmen deine Platten auf 37 ° C. Fügen Sie 80 µL über Nacht gewachsenen Kulturen die gewünschte Stämme von Streptococcus und Bakterien vollständig über die Agar-Oberfläche mit einem sterilen Spreader verteilt. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in einem Kerze Glas über Nacht (~ 18 h). Als Kontrolle Samen drei 35 mm x 10 mm NGM Platten mit 80 µL über Nacht gewachsenen Kulturen von E. Coli OP50. Inkubieren Sie diese Platten bei 37 ° C für ~ 18 h.
- Am nächsten Tag aus dem Kerze Glas ausbauen Sie Platten und ermöglichen Sie die auf RT für 10-15 min. Waschen L4-Larven mit M9W von NGM abkühlen und NGM RNAi Fütterung Platten. Sammeln Sie die Würmer in 15 mL konische Röhrchen.
- Drehen Sie die Rohre bei 450 X g für 1 min. Dekantieren des Überstandes und 10 mL M9W.
- Wiederholen Sie Schritt 9.3 noch dreimal.
- Die Würmer in ~ 250 µL M9W Aufschwemmen und Platz drei 5 µL Tropfen Wurm-Suspension auf einer sauberen Petrischale Deckel und schätzen die Zahl der Würmer pro Mikroliter sezierenden Mikroskop.
- Jeder deiner Streptokokken ausgesät und NGM E. Coli ausgesät Platten fügen Sie hinzu ~ 100 L4-Larven. Verwenden Sie drei Platten pro Bakterienstamm. Inkubieren Sie die Platten für 2 bis 3 h bei 25 ° c
- Danach entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator, waschen Sie sie mit M9W und sammeln Sie die Würmer in 15 mL konische Röhrchen.
- Waschen Sie die Würmer 3 X im beschriebenen Schritte 9.3.
- Das Wurm-Pellet fügen Sie 500 µL M9W mit 2 mM Natrium-Azid oder 2 mM Tetramisole Hydrochlorid hinzu und entfernen Sie die meisten der M9W durch Absaugen. Dies wird die Würmer, um sicherzustellen, dass keine Bewegung tritt auf, wenn unter dem Mikroskop abgebildet zu betäuben.
Vorsicht: Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), beim Umgang mit Natriumazid. Bereiten Sie die Azid-Lösung unter einer chemischen Kapuze. - Inkubieren Sie die Wurm-Pellets für 15 min bei RT. Dann vor Ort 15 µL der Wurm Suspension auf einem vorbereiteten Agarose-Pad. Sanft lege einem Deckgläschen Nr. 1.5 über die Agarose-Pad mit den narkotisierten Würmer.
- Mit einem fluoreszierenden Mikroskop, visualisieren Sie die Lokalisierung der SKN-1 Verwendung FITC und DAPI-Filter. Bild-Würmer bei 10 X und 20 X Vergrößerungen.
- Punkten Sie die Würmer, die basierend auf der Ebene der Lokalisierung des SKN-1. Keine nukleare Lokalisierung, Lokalisation der SKN-1 b/C::GFP in der vorderen oder hinteren des Wurms und nukleare Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP in allen Darmzellen werden als niedrig, Mittel und hohes Maß an Lokalisierung, kategorisiert.
- Bestimmen Sie nach der Wertung der fluoreszierenden Mikrographen die statistischen Unterschiede von Chi-Quadrat und Fishers exakten Tests mit Statistiksoftware.
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Representative Results
Mitglieder der der Mitis Gruppe S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii schnell getötet, die Würmer, im Gegensatz zu S. Mutans, S. Salivarius und nicht-pathogenen E. Coli OP50(Abbildung 3). Die mediane Überlebenszeit für S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii betrug 300 min., 300 min. bzw. 345 min.. Um festzustellen, ob die Tötung durch H2O2vermittelt wurde, war Katalase, dein Agar ergänzt. Die Tötung der Würmer wurde im Beisein von Katalase (Abbildung 3B) abgeschafft. Zur weiteren Bestätigung, ob Streptokokken abgeleitete H2O2 töten die Würmer, Überleben auf der ΔSpxB Mutante, WT Dehnung und Ergänzung Stamm ΔSpxB; SpxB + S. Gordonii vermittelt wurde analysiert. Tod der Würmer wurde nicht beobachtet, auf den ΔSpxB Mutante im Vergleich zu dem Wildtyp und Stämme (Abb. 3C) zu ergänzen. Diese Daten deuten darauf hin, dass die H2O2 produziert von Mitis Gruppe töten die Würmer vermittelt. Wir beobachteten auch ähnliche Tötung Kinetik bei klinischen Isolaten von der Mitis Gruppe Streptokokken aus dem Blut von Krebspatienten (Abbildung 3D) erhalten die Würmer ausgesetzt waren. Basierend auf den Daten, wurden die Pathogenität von H2O2 produziert von Mitis Gruppe Streptokokken verursacht.
Um Host Gene zu identifizieren, die gegen Streptokokken-Infektionen sind, Skn-1 wurde abgerissen, die kodiert für oxidativen Stress-Reaktion-Transkriptionsfaktor in C. Elegans. Dann war überleben bezogen auf die Vektor-Kontrolle behandelt-Würmer verglichen. Eine signifikante Abnahme der das Überleben der Skn-1 Knockdown Würmer wurde beobachtet, im Vergleich zu den Vektor-Steuerelement behandelt Würmer (Abb. 4A). Diese Daten weiter validiert wurde, mit einer Mutante Skn-1 , und ihr Überleben war im Vergleich dazu der N2 Wildtyp Würmer. Wir beobachteten einen ähnliche Tötung Phänotyp als Skn-1 Mutant, wie gesehen mit dem Zuschlag Skn-1 zeigen, dass SKN-1 das Überleben der Würmer auf die Mitis-Gruppe (Abbildung 4B beeinflusst).
Als nächstes wurde ermittelt, ob der H2O2 von der Lokalisierung der SKN-1 b/C::GFP in den Würmern verursacht Mitis-Gruppe produziert. Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP verzeichneten Würmer der Wildtyp und Ergänzung Flecken und nicht als Reaktion auf die Δ-SpxB -Mutante von S. Gordonii (Abbildung 5A, B) ausgesetzt. Darüber hinaus wurden um die Aktivierung der SKN-1 zu ermitteln, Komponenten der p38 MAPK Weg abgerissen. Reduzierte Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP in Nsy-1, Sek-1, Pmk-1 und Skn-1 Knockdown Würmer bezogen auf die Vektor-Kontrolle behandelt-Würmer wurde beobachtet. Die Daten deuten darauf hin das p38 MAPK ist notwendig für die Aktivierung der SKN-1 als Reaktion auf H2O2 produziert von Mitis-Gruppe (Abbildung 5C, D).
Abbildung 1 : Flussdiagramm zeigt die Schritte zur Vorbereitung der Überlebens-Assays. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Flussdiagramm zeigt die Arbeitsschritte zur Lokalisierung von SKN-1 während der Infektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : H2O2-vermittelte Tötung von C. Elegans von Mitis Gruppe Streptokokken. Kaplan-Meier Überleben Kurven der L4-Larven (A) S. Gordonii, S. Oralis, S. Mitis, S. Salivarius, S. Mutans und E. Coli OP50 ausgesetzt. (B) S. Gordonii, S. Oralis, S. Mitis, S. Salivarius, S. Mutans und E. Coli OP50 auf deinem Teller in Anwesenheit von 1.000 U der Katalase. (C) S. Gordonii WT, ΔSpxB Mutant und ΔSpxB; SpxB + ergänzen Stämme auf N2 L4-Larven. (D) S. Oralis (VGS #3), S. Oralis (VGS #4), S. Mitis (VGS #10), S. Mitis (VGS #13) und E. Coli OP50. Die Daten sind repräsentativ für Experimente wiederholt zwei oder mehrere Male mit n = 60 Würmer für jede Bedingung. Kaplan-Meier-Log-Rank-Analyse wurde verwendet, um Überleben Kurven zu vergleichen und die mediane Überlebenszeit zu berechnen. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant zu sein. Diese Zahl wurde modifiziert und adaptiert mit Erlaubnis15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : SKN-1 ist notwendig für das Überleben der Würmer auf S. Gordonii. (A) Überleben von Vektor-Kontrolle behandelt und Skn-1 Knockdown Würmer S. Gordoniiausgesetzt. (B) Überleben von N2 und Skn-1(zu67) mutierten Würmer auf S. Gordoniigefüttert. Die Daten sind repräsentativ für Experimente wiederholt zwei oder mehrere Male mit n = 60 Würmer für jede Bedingung. Kaplan-Meier-Log-Rank-Analyse wurde verwendet, um Überleben Kurven zu vergleichen und die mediane Überlebenszeit zu berechnen. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant zu sein. Diese Zahl wurde modifiziert und adaptiert mit Erlaubnis15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Streptokokken H2O2 vermittelte Aktivierung der SKN-1 ist abhängig von der p38 MAPK Weg. (A) repräsentative Bilder der Lokalisierung der SKN-1 b/C::GFP in Worms die WT, ΔSpxB Mutant und ΔSpxB; SpxB + Ergänzung Stämme von S. Gordoniiausgesetzt. Nahaufnahmen sind in den oberen rechten Ecken jedes Bildes gezeigt. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) der Grad der nuklearen Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP und Prozentsatz der Endlosschrauben in jeder Kategorie auf WT, ΔSpxB Mutant und ΔSpxB; SpxB + Ergänzung Stämme von S. Gordoniigefüttert. Deutlich wurden geringe Mengen an nuklearen Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP in den ΔSpxB Mutanten (p < 0,0001) im Vergleich zu den WT und ΔSpxB; SpxB + Ergänzung Stämme von S. Gordoniibeobachtet. (C) repräsentative Bilder der Lokalisierung der SKN-1 b/C::GFP in Nsy-1 Sek-1, Pmk 1, Skn-1 Zuschlag und Vektor-Kontrolle behandelt Würmer auf S. Gordonii. Nahaufnahmen sind in den oberen rechten Ecken jedes Bildes gezeigt. Maßstabsleiste = 100 µm. (D) der Grad der SKN-1 b/C::GFP nuklearen Lokalisierung und Prozentsatz der Endlosschrauben in jeder Kategorie gefüttert Nsy-1, Sek-1, Pmk 1, Skn-1 Zuschlag und Vektor-Kontrolle behandelt Würmer auf S. Gordonii. Deutlich niedrige Konzentrationen von nuklearen Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP verzeichneten Nsy-1 (p < 0,01), Sek-1 (p < 0,001), Pmk-1 (p < 0,0001)und Skn-1 Zuschlag (p < 0,0001) im Vergleich zu den Vektor Kontrolle behandelt Würmer auf S. Gordonii. Mehr als 100 Würmer, jede Belastung ausgesetzt wurden abgebildet, und das Experiment wurde dreimal wiederholt. Diese Zahl wurde modifiziert und adaptiert mit Erlaubnis15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die beschriebenen Methoden können verwendet werden, für andere pathogenen Bakterien wie Enterococcus Faecium, produziert auch H2O2 unter anaeroben angebaut oder mikroaerophil Bedingungen26. In der Regel für die meisten pathogenen Organismen dauert es mehrere Tage bis Wochen dauern die Überlebens-Assays. Jedoch konnte aufgrund der robusten Produktion von H2O2 von den Mitgliedern des Arbeitskreises Mitis, diese Tests innerhalb von 5-6 h unter den beschriebenen Bedingungen abgeschlossen werden. Dadurch ist die Fähigkeit, mehrere gen Kandidaten Wirtsimmunität beteiligt und den oxidativen Stress-Reaktion über einen kurzen Zeitraum Bildschirm.
In diesem Protokoll ist H2O2 produziert von den Bakterien in direktem Kontakt mit der Darmzellen des Wurms im Gegensatz zu anderen exogenen ROS-Quellen, die mehrere Hindernisse überqueren müssen. Dies sorgt dafür, dass die H2O2 an die Darmzellen geliefert wird; Daher ist eine robustere Tötung Reaktion im Wurm beobachtet. Mit Hilfe von Eindringmittel beschrifteten Bakterien, wurde festgestellt, dass die Würmer Krankheitserreger für 30 min für vollständige Besiedlung des Darm-Trakt15ausgesetzt werden müssen. Es wird empfohlen, weniger als 1 Woche alt Streifen Platten von Streptokokken-Stämmen verwenden, um ihre Rentabilität und die Fähigkeit, H2O2produzieren sicherzustellen. Darüber hinaus müssen die Streptokokken-Stämme mikroaerophil Bedingungen für optimale Produktion von H2O angebaut werden2. L4-Larven oder 1 Tag alt Erwachsene können für diesen Test verwendet werden. Es ist wichtig, dass alle Würmer in einem Experiment verwendet das gleiche Alter und Geschlecht sind. Junge Würmer sind in der Regel langsamer im Vergleich zu älteren Hermaphroditen zu sterben. L4 Tiere unterscheiden sich leichter, weil ihre Entwicklung Vulva als klare Patch am mittleren Körper sichtbar ist, die Kontraste mit dem Rest des Körpers. Es ist auch wichtig, dass kein E. Coli OP50 Streptokokken ausgesät Platten übertragen werden. Kontamination des Tötens Platten mit E. Coli kann die Dämpfung oder Aufhebung des Tötens der Würmer verursachen. Um Kontaminationen zu vermeiden, ist es notwendig, die Würmer von der E. Coli -Rasen zu wählen. Wenn die Überlebens-Assays scoring, ist es ratsam, den Rachen Pumpen, Nahrungssuche Verhalten von Kopf und Körperbewegung zu beobachten. Um sicherzustellen, dass der Wurm tot ist, empfiehlt es sich, vorsichtig die Nase, Seite des Körpers, oder der Schweif prod und beobachten jede Bewegung.
RNAi Fütterung und das Überleben der Würmer auf die Mitis-Gruppe wurde kombiniert, um Kandidaten zu identifizieren, die bei der Verteidigung gegen H2O2beteiligt sind. Mit dem Gen Skn-1 , die für einen Transkriptionsfaktor oxidativen Stress Reaktion, seiner Forderung codiert für das Überleben des Wurms in Reaktion auf H2O2 demonstriert hier. Daher kann dieser Test angepasst werden, um Bildschirm für mehrere Gene und identifizieren potentielle Kandidaten für oxidativen Stress-Reaktion und Immunität erforderlich. RNAi Fütterung der Würmer erfolgt durch Hinzufügen von Alter L1-Larven, die RNAi Ausdruck E. Coli Rasen synchronisiert. Während der Wurm Synchronisierung Protokoll unbedingt lyse der Wurm Nagelhaut in Gegenwart von Chlorid und Natrium Hydroxid zu überwachen. Die Kutikula der Larven und Erwachsene löst sich kontinuierlich, während die Embryonen durch die Dicke Eierschale teilweise geschützt sind. Längere Inkubation in Anwesenheit der Bleda Natriumhydroxid Mix führen jedoch die Embryonen sterben. Daher ist es wichtig, die Röhrchen mit den Würmern unter dem sezierenden Mikroskop in regelmäßigen Abständen während der Bleiche zu beobachten. Ein weiterer Schritt in die Synchronisierung Protokoll zu berücksichtigen ist die Aufrechterhaltung der verhafteten L1-Larven. Die verhafteten Larven können auf den Rohr-Rotator für 5 Tage bei Raumtemperatur gepflegt werden. Es wird empfohlen, die Larven zu verwenden, für die RNAi Fütterung innerhalb 1 bis 2 Tage nach dem Schlupf. Verlängerte Wartung in M9W kann bei der Bildung der Dauer Bühne führen.
Schließlich wurde ein transgener Wurm mit dem Ausdruck SKN-1 mit GFP verschmolzen zur Aktivierung des oxidativen Stress-Reaktion in Gegenwart von Mitis Gruppe überwachen. Durch RNAi nachgewiesen wird, dass die Komponenten der p38 MAPK zur Lokalisierung der SKN-1 b/C::GFP in den Kernen der die Darmzellen benötigen. Es ist wichtig die L3 oder L4 Phasen dieser Sorte verwenden, um Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP, zu beobachten wie Lokalisierung von SKN-1 neigt dazu, im erwachsenen Stadium zu vermindern. Um die Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP besser zu beobachten, ist es ratsam, die erhaltenen Bilder mit den Filter-Einstellungen FITC und DAPI überlappen. Autofluoreszenz erzeugt durch die Lipofuscins dazu beitragen, Kontrast zur Beobachtung der SKN-1 Lokalisierung in der Wurm. Allerdings hat sich auch gezeigt, dass das Signal schwach exprimierten GFP-Reporter durch die Autofluoreszenz emittiert von verschiedenen Quellen im Darm des Wurms maskiert ist. Autofluoreszenz wurde gezeigt, dass mit dem Alter zunehmen und ist am höchsten in den Darm und Gebärmutter der C. Elegans27. Um dieses Problem zu umgehen, verwendet eine kürzlich durchgeführte Studie eine Triband GFP Filter Setup um die Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP in C. Elegans28zu überwachen. Dieses Setup wird Autofluoreszenz, Anzeige der GFP und Autofluoreszenz in die grüne und gelbe Kanäle bzw. das GFP-Signal trennt.
C. Elegans dient in diesem Protokoll zum Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen und festzustellen, wie H2O2 produziert von Mitis Gruppe Pathogenität verursacht. Noch wichtiger ist, können mithilfe dieses Modell die Beeinflussung der H2O2 endoplasmic retikuläre Stress, mitochondriale Schäden, Mitophagy, Autophagie, und oxidativem Stress untersucht werden. Darüber hinaus können Mechanismen mit denen H2O2 als ein Virulenzfaktor Immunantworten zu entlocken fungiert, durch Störung der Kernprozesse der Zelle identifiziert werden. Daher ist dieser Wurm als leistungsstarke Modellsystem für die Entdeckung neuer Einblicke in Wirt-Pathogen Interaktionen anerkannt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (The University of Texas School of Dentistry), Dr. Richard Lamont (University of Louisville, School of Dentistry) und Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) für die Bereitstellung von Labor- und klinische Stämme von Mitis Gruppe Streptokokken. Wir danken Dr. Keith Blackwell (Department of Genetics, Harvard Medical School) für die C. Elegans -Stämme. Zu guter Letzt danken wir Dr. Danielle Garsin und ihr Labor (The University of Texas, McGovern Medical School) für die Bereitstellung von Reagenzien und Wurm-Stämme zur Durchführung der Studie. Einige Stämme der Wurm erbrachten die CGC vom NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
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