Summary
Il nematode Caenorhabditis elegans è un eccellente modello per sezionare interazioni ospite-patogeno. Un protocollo per infettare il worm con membri degli streptococchi gruppo mitis e determinare l'attivazione della risposta di sforzo ossidativo contro H2O2 prodotto da questo gruppo di organismi è descritto qui.
Abstract
Caenorhabditis elegans (c. elegans), un nematode dissipato, è emerso come un modello interessante per studiare le interazioni ospite-patogeno. Il protocollo presentato utilizza questo modello per determinare la patogenicità causata da streptococchi gruppo mitis attraverso la produzione di H2O2. Gli streptococchi di gruppo mitis sono una minaccia emergente che causano molte malattie umane quali batteriemia, endocardite e cellulite orbitale. Descritto qui è un protocollo per determinare la sopravvivenza di questi vermi in risposta a H2O2 prodotto da questo gruppo di agenti patogeni. Usando il skn-1 del gene che codifica per un fattore di trascrizione di risposta di stress ossidativo, esso è indicato che questo modello è importante per l'identificazione di geni ospitanti che sono essenziali contro l'infezione streptococcica. Inoltre è dimostrato che l'attivazione della risposta allo stress ossidativo può essere monitorato in presenza di questi patogeni utilizzando un ceppo di vite senza fine di reporter transgenici, in cui viene fuso SKN-1 proteina fluorescente verde (GFP). Queste analisi forniscono la possibilità di studiare la risposta allo stress ossidativo di H2O2 derivato da una fonte biologica rispetto a esogenicamente aggiunto fonti (ROS) di specie reattive dell'ossigeno.
Introduction
Gli streptococchi del gruppo mitis sono commensals umano della cavità orofaringea1. Tuttavia, questi organismi possono sfuggire questa nicchia e causano una serie di malattie invasive2. Le infezioni causate da questi microrganismi sono batteriemia, endocardite e cellulite orbitale2,3,4,5,6. Inoltre, essi stanno emergendo come causativi agenti di infezioni del torrente sanguigno in immunocompromessi, neutropenic e malati di cancro sottoposti a chemioterapia5,7,8,9 .
I meccanismi di patogenesi di gruppo fondo mitis è oscuro, perché sono stati identificati alcuni fattori di virulenza. Il gruppo di mitis è noto per la produzione di H2O2, che ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella comunità microbica orale10. Più recentemente, diversi studi hanno evidenziato un ruolo per H2O2 come una citotossina che induce la morte delle cellule epiteliali11,12. Polmonite S., che appartiene a questo gruppo, ha dimostrato di produrre alti livelli di H2O2 che induce il danno del DNA e l'apoptosi in cellule alveolari13. Utilizzando un modello animale di polmonite acuta, gli stessi ricercatori hanno dimostrato che la produzione di H2O2 dai batteri conferisce un vantaggio di virulenza. Studi su meningite pneumococcal hanno inoltre dimostrato che patogeno-derivati H2O2 agisce in sinergia con pneumolysin per innescare un neurone delle cellule morte14. Queste osservazioni stabiliscono chiaramente che H2O2 prodotto da questo gruppo di batteri è importante per loro patogenicità.
È interessante notare che, esso ha anche dimostrato che gruppo del mitis mitis dello s. e s. oralis causare la morte della del nematode c. elegans attraverso la produzione di H2O215,16. Questo nematode dissipato è stato utilizzato come un modello semplice, geneticamente trattabile per studiare molti processi biologici. Più recentemente, il worm è emerso come un modello per lo studio di interazioni ospite-patogeno17,18. Inoltre, diversi studi hanno evidenziato l'importanza dello studio dello stress ossidativo tramite questo organismo19,20,21. Suo ciclo di vita breve, la capacità di atterramento geni di interesse di RNAi e l'uso della proteina fluorescente verde (GFP)-reporter fuso per monitorare l'espressione genica sono alcuni degli attributi che lo rendono un sistema modello attraente. Ancora più importante, le vie che regolano lo stress ossidativo e l'immunità innata nel verme sono altamente conservate con mammiferi20,22.
In questo protocollo, è dimostrato come utilizzare c. elegans per delucidare la patogenicità causata da streptococco-derivati H2O2. Un'analisi di sopravvivenza modificate è mostrata, e membri del gruppo mitis sono in grado di uccidere i vermi rapidamente tramite la produzione di H2O2. Utilizzando i membri del gruppo di mitis, una costante fonte biologica di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è prevista, al contrario di fonti chimiche che inducono lo sforzo ossidativo nei vermi. Inoltre, i batteri sono in grado di colonizzare rapidamente, i vermi che permette per H2O2 essere direttamente indirizzati alle cellule intestinali (rispetto ad altre fonti che devono attraversare diverse barriere). Il dosaggio è convalidato o 1) per determinare la sopravvivenza del ceppo mutante skn-1 o 2) battendo giù skn-1 mediante RNAi in worms rispetto la N2 selvaggio-tipo e vettoriale controllo trattato worms. SKN-1 è un fattore di trascrizione importante che regola la risposta allo stress ossidativo in c. elegans23,24,25. Oltre alle analisi di sopravvivenza, un ceppo di vite senza fine che esprimono un reporter transgenico SKN-1B/C::GFP viene utilizzato per monitorare l'attivazione della stress ossidativo risposta tramite la produzione di H2O2 dal gruppo mitis.
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Protocol
1. preparazione dei tuoi piatti di Agar (Estratto di lievito Todd-Hewitt)
- Per 1 L di media, aggiungere 30 g di polvere di Todd-Hewitt, 2 g di Estratto di lievito e 20 g di agar per un matraccio di Erlenmeyer 2L. Aggiungere il contenuto del matraccio 970 mL di acqua deionizzata e includere una barra per l'agitazione. Sterilizzare in autoclave i media ad una temperatura di 121 ° C e pressione di 15 libbre/pollice2 per 30 min. Successivamente, impostare il media su una zolla di mescolare e raffreddare con agitazione delicata.
- Versare i media dimensioni appropriate Petri sterili (piatti 100 x 15 mm per la crescita e il mantenimento dei batteri, piatti 35 x 10 mm per l'uccisione di saggi) sotto un flusso laminare. Lasciare che i supporti ad asciugare per 2 ore sotto la cappa laminare. Da allora in poi, le piastre possono essere memorizzate a 4 ° C per 1 mese.
2. preparazione del terreno di coltura del Nematode (NGM) e piastre (NGM RNAi) di alimentazione di RNAi
- Utilizzando un ancoretta, sciogliere 2,5 g di peptone e 3 g di NaCl in 970 mL di acqua deionizzata in un matraccio di Erlenmeyer 2L. Aggiungere 20 g di agar ai media. Autoclave i media ad una temperatura di 121 ° C e pressione di 15 libbre/pollice2 per 30 min. impostare il media su una zolla di mescolare e raffreddare con agitazione delicata.
- Aggiungere le seguenti soluzioni per i media per la preparazione di piatti NGM: 25 mL di tampone di fosfato di potassio 1 M (pH = 6.0), 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di colesterolo (5 mg/mL di etanolo al 95%) , 1 mL di nistatina (10% v/w in etanolo) e 1 mL di 25 mg/mL di streptomicina.
- Aggiungere le seguenti soluzioni per i media per la preparazione di NGM RNAi alimentazione piastre: 25 mL di tampone di fosfato di potassio 1 M (pH = 6.0), 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di colesterolo (5 mg/mL di etanolo al 95%) , 1 mL di nistatina (10% v/w in etanolo), 1 mL di carbenicilline 50 mg/mL e 1 mL di IM IPTG.
- Versare i media in 60 x 15 mm Petri sterili sotto flusso laminare. Lasciare che i supporti ad asciugare per 2 ore sotto la cappa laminare. Successivamente, piastre possono essere memorizzati a 4 ° C per 1 mese.
3. manutenzione di c. elegans
- Seme le piastre NGM spotting 50 µ l di pernottamento cresciuto OP50 Escherichia coli nel centro delle piastre. La cultura di e. coli è preparata in precedenza nei media di Luria-Bertani (LB) e conservata a 4 ° C per diversi mesi. Coprire le piastre e lasciarli asciugare per 24 ore sotto una cappa laminare e da allora in poi conservare le piastre in contenitore in polistirolo.
- Sotto un microscopio per dissezione, pick up 10 a 12 adulti gravid usando un plettro di verme sterile e trasferire i vermi a un e. coli OP50 seminato piastra NGM. Incubare le piastre a 20 ° C durante la notte.
- Il giorno successivo, rimuovere gli adulti usando un plettro di verme sterile e consentire gli embrioni di sviluppare per le larve L4 a 20 ° C (~2.5 giorni).
4. preparazione della popolazione in età sincrono di vermi
-
Lavare gravid adulti da due a quattro piastre NGM utilizzando M9W e raccoglierli in una provetta conica da 15 mL.
- Per preparare M9W: combinare 3 g di NaCl, 6 g di Na2HPO4e 3 g di KH2PO4 e sciogliere in un volume finale di 1 L di acqua deionizzata. Autoclave la soluzione e aggiungere 1 mL di 1 M MgSO4.
- Girare il tubo a 450 x g per 1 min, quindi decantare il supernatante, garantendo nel contempo che il pellet di verme rimane intatto.
- Aggiungere 400 µ l di 8,25% ipoclorito di sodio (candeggina) e 100 µ l di 5 N NaOH per preparare la soluzione di lisi del verme. Aggiungere la soluzione di lisi al pellet di vite senza fine e mescolare il contenuto, spostando il tubo fino a 70% dei vermi adulti vengono lisate. Osservare periodicamente il contenuto del tubo sotto un microscopio per dissezione per garantire non c'è nessun overbleaching delle uova.
- Diluire il mix di candeggina aggiungendo 10 mL di M9W al contenuto del tubo conico.
- Girare il tubo a 450 x g per 1 min. decantare surnatante, quindi aggiungere 10 mL di M9W.
- Ripetere il passaggio 4.5 altre due volte.
- Risospendere il pellet di uovo risultante in 3-5 mL di M9W. Porre la provetta in un rotatore del tubo. Lasciare le provette ruotare ad una velocità di 18 giri/min a temperatura ambiente (TA) durante la notte.
- Il giorno successivo, girare il tubo a 450 x g per 1 minuto agglomerare le larve L1. Rimuovere la maggior parte di M9W dall'aspirazione, lasciando dietro di sé ~ 250 µ l di liquido nel tubo. Risospendere le larve L1 e posto tre 5 µ l gocce della sospensione vite senza fine in una capsula di Petri coperchio, poi stima il numero di vermi per µ l utilizzando un microscopio per dissezione.
5. l'induzione di RNAi a Worms
- Utilizzando una sterile del ciclo o prendere, striscia fuori i ceppi desiderati di RNAi contenenti Escherichia coli dalle scorte congelate (librerie Ahringer e Vidal) sulle piastre di agar 100 x 15 mm LB contenente 50 carbenicillina µ g/mL e 15 µ g/mL di tetraciclina. Incubare le piastre a 37 ° C per 24 h.
- Pick e inoculare una colonia isolata dal ceppo RNAi desiderata in provette coniche da 15 mL sterile contenente 2 mL di LB completati con carbenicillina di 50 µ g/mL. Incubare le provette a 37 ° C per 16 h in un agitatore orbitale a 150 giri/min.
- Il giorno successivo, sviluppa 150 µ l della coltura durante la notte coltivato sulle piastre d'alimentazione di RNAi NGM 65 x 15 mm utilizzando una spatola sterile. Incubare le piastre a 37 ° C per 24 h.
- Le piastre raffreddare a RT dopo incubazione a 37 ° C. Aggiungere un volume adeguato di M9W contenenti larve L1 ~ 200 (ottenute dalla popolazione sincrono età dei passaggi di vermi) di e. coli seminato NGM RNAi piastre di alimentazione. Incubare le piastre a 20 ° C fino a quando le larve raggiungono la fase di L4 (~2.5 giorni).
6. preparazione degli streptococchi del gruppo Mitis per infezione
- Striscia fuori desiderati ceppi di streptococchi la 100 mm x 15 mm THY agar (se le piastre sono stati conservati a 4 ° C, pre-riscaldare le piastre a 37 ° C prima di striature i rispettivi ceppi), quindi incubare le piastre a 37 ° C durante la notte (~ 18 h) in un barattolo di candela fornendo un en microaerofili vironment per la crescita degli streptococchi (le tavole striate possono essere memorizzate per una settimana a 4 ° C).
- Per propagare gli isolati clinici di streptococchi, utilizzare tryptic soy agar di anima. Incubare le piastre a 37 ° C in un barattolo di candela durante la notte (~ 18 h).
- Il giorno successivo, rimuovere le piastre dal vaso candela e pick colonie isolate con un'ansa sterile. Inoculare sterile provette coniche da 15 mL contenente 2 mL di tuo brodo. Per propagare gli isolati clinici di streptococchi, supplemento THY brodo con 5% v/v di sangue di pecora. Chiudere i tappi stretti e incubare le provette a 37 ° C in condizioni statiche.
7. sopravvivenza saggi
Nota: I passaggi coinvolti in questo saggio sono illustrati nella Figura 1. Per dimostrare che l'H2O2 derivati dal mitis group è responsabile dell'uccisione del worm, integrare i media con catalasi, o il ceppo mutante ΔspxB e del complemento di ceppo ΔspxB; spxB + di S. gordonii può essere utilizzato. SpxB codifica per una piruvato ossidasi, che è responsabile per la produzione di H2O2 nel gruppo mitis.
- Pre-riscaldare 35 x 10 mm THY piastre a 37 ° C. Aggiungere 80 µ l di pernottamento culture coltivate dei desiderata ceppi di streptococchi e diffondere i batteri completamente su tutta la superficie dell'agar utilizzando una spatola sterile. Incubare le piastre a 37 ° C in un barattolo di candela durante la notte (~ 18 h). Come controllo, piastre di NGM seme due 35 x 10 mm con 80 µ l di pernottamento coltivate colture di Escherichia coli OP50. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
- Per confermare che l'H2O2 prodotte dal gruppo mitis è responsabile per l'uccisione dei vermi, aggiungere 50 µ l contenente 1.000 unità di catalasi c su THY piastra. Stendere la soluzione di catalasi utilizzando una spatola sterile e lasciare le lastre a secco nel flusso laminare per 30 min. seme le piastre da allora in poi con i ceppi di streptococco rispettivi come descritto al punto 7.1.
- Il giorno successivo, rimuovere le piastre dal vaso candela e consentire le piastre raffreddare a RT per 10-15 minuti usando un verme sterile pick, trasferimento 30 larve L4 dalla NGM o RNAi NGM alimentazione piastre per lo streptococco seminato tuo piastre. Utilizzare due teste di serie THY piastre con un totale di 60 worm al ceppo di streptococco. Incubare le piastre a 25 ° C.
- Usando un microscopio per dissezione, contare il numero di vivi e morti larve L4 su ogni piatto timepoints diversi. Inizialmente, segnare i vermi come morto o vivo ogni 30 min. Da allora in poi, quando vermi rapidamente iniziano a morire, Punteggio loro ad intervalli di 15 min. Utilizzare il plettro di verme sterile delicatamente prod i vermi e determinare se sono vivo o morto. Un worm è considerato morto se non c'è nessun movimento in risposta al pungolo.
- Il test avrà 5-6 ore per completare. Ripetere l'esperimento altre due volte. Dopo il completamento del test, piscina i dati delle due placche. Inserire i dati di ogni gruppo, confrontare le curve di sopravvivenza ed eseguire analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier utilizzando il software statistico.
8. preparazione di pastiglie di agarosio per microscopia
- Sciogliere 2% p/v di agarosio in acqua deionizzata riscaldando la soluzione in un forno a microonde. Un volume di 5 mL di soluzione è sufficiente per preparare 20 vetrini.
- Attaccare il nastro di laboratorio longitudinalmente lungo due lastre di vetro. Questo determinerà lo spessore delle pastiglie dell'agarosi. Posto un vetrino pulito tra le due diapositive nastrate.
- Posto 100 µ l di agarosio fuso al centro del vetrino pulito. Posizionare immediatamente un altro bicchiere pulito in cima l'agarosio fuso e premere delicatamente per rendere un pad. Consentire l'agarosio solidificare e successivamente rimuovere la slitta superiore. Il pad dell'agarosi è pronto per l'uso.
9. osservazione della localizzazione di SKN-1 in risposta all'infezione di streptococco
Nota: I passaggi coinvolti in questo saggio sono rappresentati in Figura 2. Localizzazione di SKN-1 è stata determinata utilizzando il ceppo di verme transgenici SKN-1B/C::GFP. Per dimostrare la localizzazione di SKN-1 dovuta alla produzione di H2O2 dal gruppo mitis, wild type (WT), ΔspxB e il complemento di ceppo ΔspxB; spxB + di S. gordonii sono stati usati. Inoltre, il ceppo transgenici reporter SKN-1B/C::GFP e la tecnica di interferenza di RNAi sono stati utilizzati per dimostrano che le componenti del pathway MAPK p38 regolano la localizzazione di SKN-1.
- Pre-riscaldare 35 x 10 mm THY piastre a 37 ° C. Aggiungere 80 µ l di pernottamento culture coltivate dei desiderata ceppi di streptococco e diffondere i batteri completamente su tutta la superficie dell'agar utilizzando una spatola sterile. Incubare le piastre a 37 ° C in un barattolo di candela durante la notte (~ 18 h). Come controllo, piastre di NGM seme tre 35 x 10 mm con 80 µ l di pernottamento coltivate colture di Escherichia coli OP50. Incubare le piastre a 37 ° C per ~ 18 h.
- Il giorno successivo, rimuovere le piastre dal vaso candela e consentire le piastre raffreddare a RT per 10-15 min Wash L4 larve utilizzando M9W da NGM e piastre d'alimentazione NGM RNAi. Raccogliere i vermi in provette coniche da 15 mL.
- Girare i tubi a 450 x g per 1 min. decantare il supernatante e aggiungere 10 mL di M9W.
- Ripetere il punto 9.3 tre volte di più.
- Risospendere i vermi in ~ 250 µ l di M9W e luogo gocce tre 5 µ l della sospensione verme sul coperchio pulito di Petri e stimare il numero di vermi per µ l utilizzando un microscopio per dissezione.
- Aggiungere larve L4 ~ 100 a ogni tuo streptococco seminato e NGM Escherichia coli seminato piastre. Utilizzare tre piastre al ceppo di batteri. Incubare le piastre per 2-3 h a 25 ° C.
- Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatrice, lavarli con M9W e raccogliere i vermi in provette coniche da 15 mL.
- Lavare i vermi 3 x come descritto nei passi 9.3.
- Rimuovere la maggior parte della M9W dall'aspirazione e aggiungere 500 µ l di M9W contenente 2 mM sodio azide o 2mm Tetramisolo cloridrato al pellet di verme. Questo sarà anestetizzare i vermi, assicurando che nessun movimento si verifica quando imaged sotto il microscopio.
Attenzione: Utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE) durante la manipolazione di sodio azide. Preparare la soluzione di azide sotto una cappa chimica. - Incubare i pellet di verme a RT per 15 min. Quindi, individuare 15 µ l della sospensione verme su un blocchetto di agarosio preparati. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti n. 1.5 sopra il pad di agarosio contenente i vermi anestetizzati.
- Utilizzando un microscopio a fluorescenza, visualizzare la localizzazione di SKN-1 che utilizzano filtri FITC e DAPI. Vermi di immagine alle 10 x e 20 x ingrandimenti.
- Segnare i vermi sulla base del livello di localizzazione di SKN-1. Nessuna localizzazione nucleare, la localizzazione di SKN-1B/C::GFP nell'anteriore o posteriore del verme e localizzazione nucleare di SKN-1B/C::GFP in tutte le cellule intestinali sono classificati come basso, medio e alto livello di localizzazione, rispettivamente.
- Dopo aver segnato i micrografi fluorescente, determinare le differenze statistiche di chi-quadrato e test esatto di Fisher, utilizzando software statistico.
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Representative Results
Gruppo del mitis S. mitis, S. oralis e S. gordonii rapidamente uccisi i vermi, al contrario di S. mutans, S. salivarius e non patogeni di e. coli OP50 (Figura 3A). La sopravvivenza mediana per S. mitis, S. oralis e S. gordonii era 300 min, min 300 e 345 min, rispettivamente. Per determinare se l'uccisione è stata mediata dalle H2O2, catalasi è stata completata a THY agar. L'uccisione dei vermi è stata abolita in presenza di catalasi (Figura 3B). Per confermare ulteriormente se streptococcica derivata H2O2 mediata uccisione dei vermi, sopravvivenza sul ceppo mutante di ΔspxB , ceppo WT e complemento di ceppo ΔspxB; spxB + di S. gordonii è stato analizzato. Morte dei vermi non è stata osservata sul ceppo mutantespxB Δ rispetto al wild-type e integrare ceppi (Figura 3C). Questi dati suggeriscono che l'H2O2 prodotte dal gruppo mitis media uccisione dei vermi. Inoltre abbiamo osservato simile cinetica di uccisione quando i vermi sono stati esposti a isolati clinici degli streptococchi di gruppo mitis ottenuti dal sangue dei malati di cancro (Figura 3D). Sulla base dei dati, è stata valutata la patogenicità causata da H2O2 prodotto dagli streptococchi di gruppo mitis.
Per identificare geni ospitanti che sono essenziali contro le infezioni da streptococcici, skn-1 è stato abbattuto, che codifica per il fattore di trascrizione di risposta di sforzo ossidativo in elegans del c. Quindi, sopravvivenza, in relazione i vermi di controllo trattato di vettore è stato confrontato. Una diminuzione significativa nella sopravvivenza dei vermi atterramento skn-1 è stata osservata rispetto ai vermi di controllo trattato vettoriale (Figura 4A). Questi dati più ulteriormente è stati convalidati utilizzando un ceppo mutante di skn-1 , e la sua sopravvivenza è stata paragonata a quello dei vermi di selvaggio-tipo N2. Abbiamo osservato un simile fenotipo di uccisione come il mutante skn-1 , come si è visto con l'atterramento di skn-1 , dimostrando che SKN-1 ha influenzato la sopravvivenza dei vermi sul gruppo mitis (Figura 4B).
Successivamente, è stato determinato se l'H2O2 prodotte dal gruppo mitis causato localizzazione di SKN-1B/C::GFP nei vermi. Localizzazione di SKN-1B/C::GFP è stata osservata in vermi esposti al selvaggio-tipo e macchie di complemento e non in risposta al ceppo mutante dispxB Δ di s. gordonii (Figura 5A, B). Inoltre, per determinare l'attivazione di SKN-1, componenti del pathway di p38 MAPK sono state abbattute. Localizzazione ridotta di SKN-1B/C::GFP a worms atterramento nsy-1, sek-1, pmk-1 e skn-1 riguardante i vermi di controllo trattato di vettore è stata osservata. I dati suggeriscono la p38 che MAPK è necessaria per l'attivazione di SKN-1 in risposta a H2O2 prodotte dal gruppo mitis (Figura 5C, D).
Figura 1 : Diagramma di flusso che raffigurano i passaggi coinvolti nella preparazione dei saggi sopravvivenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Diagramma di flusso che descrive i passaggi coinvolti nella localizzazione di SKN-1 durante l'infezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : H2O2-uccisione di c. elegans ha mediato dagli streptococchi del gruppo mitis. Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier di larve L4 esposte a (A) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans ed e. coli OP50. (B) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans ed e. coli OP50 il tuo piastre in presenza di 1.000 U della catalasi. (C) S. gordonii WT, mutantespxB Δ e ΔspxB; spxB + complemento ceppi sulle larve di N2 L4. (D) S. oralis (VGS #3), S. oralis (VGS #4), S. mitis (VGS n. 10), S. mitis (VGS #13) ed e. coli OP50. I dati sono rappresentativi di esperimenti ripetuti due o più volte, con n = 60 vermi per ogni condizione. Analisi di Kaplan-Meier log rank è stato utilizzato per confrontare le curve di sopravvivenza e calcolare la sopravvivenza mediana. Valori di P < 0,05 sono stati considerati essere statisticamente significativa. Questa figura è stata modificata e adattata con permesso15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : È necessario per la sopravvivenza dei vermi su SKN-1 S. gordonii. Sopravvivenza (A) di controllo di vettore trattati e skn-1 atterramento vermi esposti a S. gordonii. (B) sopravvivenza di N2 e vermi mutanti skn-1(zu67) ha alimentato il S. gordonii. I dati sono rappresentativi di esperimenti ripetuti due o più volte, con n = 60 vermi per ogni condizione. Analisi di Kaplan-Meier log rank è stato utilizzato per confrontare le curve di sopravvivenza e calcolare la sopravvivenza mediana. Valori di P < 0,05 sono stati considerati essere statisticamente significativa. Questa figura è stata modificata e adattata con permesso15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Streptococcica H2O2 mediata attivazione di SKN-1 è dipenda la via di MAPK p38. (A) immagini rappresentative della localizzazione di SKN-1B/C::GFP in vermi esposti per il WT, mutantespxB Δ e ΔspxB; spxB + complemento ceppi di S. gordonii. Primi piani vengono visualizzati negli angoli superiore destro di ogni immagine. Barra della scala = 100 µm. (B) il grado di localizzazione nucleare di SKN-1B/C::GFP e percentuale di vermi in ogni categoria ha alimentato il WT, mutantespxB Δ e ΔspxB; spxB + complemento ceppi di S. gordonii. Il mutante dispxB Δ (p < 0.0001) rispetto al WT e ΔspxB; spxB + complemento ceppi di S. gordoniisignificativamente sono stati osservati bassi livelli di localizzazione nucleare di SKN-1B/C::GFP. (C) immagini rappresentative della localizzazione di SKN-1B/C::GFP in nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 atterramento e controllo vettoriale trattati worm su S. gordonii. Primi piani vengono visualizzati negli angoli superiore destro di ogni immagine. Barra della scala = 100 µm. (D) il grado di localizzazione nucleare SKN-1B/C::GFP e percentuale di vermi in ogni categoria alimentati nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 atterramento e controllo vettoriale trattati Worm su S. gordonii. Significativamente bassi livelli di localizzazione nucleare di SKN-1B/C::GFP sono stati osservati in nsy-1 (p < 0,01), sek-1 (p < 0,001), pmk-1 (p < 0.0001), atterramentoe skn-1 (p < 0.0001) rispetto al vettore controllo trattato di worms su S. gordonii. Maggiore di 100 vermi esposti per ogni ceppo erano imaged, e l'esperimento fu ripetuto tre volte. Questa figura è stata modificata e adattata con permesso15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi descritti possono essere utilizzati per altri batteri patogeni quali Enterococcus faecium, che produce anche H2O2 cresciuti sotto anaerobico o microaerofili condizioni26. In genere, per più germi patogeni, ci vogliono diversi giorni per settimane per completare le analisi di sopravvivenza. Tuttavia, a causa della produzione robusta di H2O2 dai membri del gruppo di mitis, queste analisi potrebbero essere completate entro 5-6 h nelle condizioni descritte. In questo modo la capacità di schermo più gene candidati coinvolti nell'immunità dell'ospite e la risposta allo stress ossidativo nel corso di un breve periodo di tempo.
In questo protocollo, H2O2 prodotti dai batteri è a diretto contatto con le cellule intestinali del worm, al contrario di altre fonti esogene di ROS che deve attraversare diverse barriere. Questo assicura che l'H2O2 viene consegnato alle cellule intestinali; quindi, una risposta più robusta di uccisione è osservata nel verme. Utilizzando batteri fluorescente identificati, è stato determinato che i vermi devono essere esposti ad agenti patogeni per 30 min per la completa colonizzazione del tratto intestinale15. Si consiglia di usare meno di 1 settimana vecchie targhe di striatura di ceppi di streptococco a garantire loro vitalità e la capacità di produrre H2O2. Inoltre, i ceppi streptococcici devono essere cresciuti in condizioni microaerofile per una produzione ottimale di H2O2. Le larve L4 o 1 giorno di età adulti possono essere utilizzati per questo test. È fondamentale che tutti i vermi usati in un esperimento sono la stessa età e sesso. Vermi più giovani tendono a morire più lentamente rispetto ai vecchi ermafroditi. L4 animali sono più facilmente distinguibili perché loro vulva in via di sviluppo è visibile a metà del corpo come una macchia chiara che contrasta con il resto del corpo. È anche importante che nessun OP50 di e. coli sono trasferiti alle piastre streptococco seminato. Contaminazione di uccidere piastre con e. coli può causare l'attenuazione o l'abrogazione dell'uccisione dei vermi. Per evitare contaminazioni, è necessario raccogliere vermi lontano il prato di e. coli . Quando segnando le analisi di sopravvivenza, si consiglia di osservare il pharyngeal pompaggio, foraggiamento comportamento della testa e del movimento del corpo. Per garantire che il worm è morto, si consiglia di delicatamente il naso, lato del corpo, o nella coda di prod e osservare qualsiasi movimento.
Alimentazione di RNAi e la sopravvivenza dei vermi sul gruppo mitis è stato combinato per identificare i candidati che sono coinvolti nella difesa contro H2O2. Utilizzando il gene skn-1 che codifica per un fattore di trascrizione di risposta di sforzo ossidativo, relativo requisito per la sopravvivenza del worm in risposta a H2O2 è dimostrato qui. Quindi, questo dosaggio può essere adattato allo schermo per parecchi geni e identificare i potenziali candidati necessari per l'immunità e la risposta allo stress ossidativo. RNAi alimentazione dei vermi è ottenuta aggiungendo età sincronizzato larve L1 per la RNAi esprimendo prati di e. coli . Durante il protocollo di sincronizzazione di vite senza fine, è essenziale monitorare lisi delle cuticole verme in presenza di candeggina e idrossido di sodio. La cuticola di adulti e larve si dissolverà continuamente, mentre gli embrioni sono parzialmente protetti da spessa guscio d'uovo. Tuttavia, l'incubazione prolungata in presenza il mix di idrossido di sodio di blead può causare gli embrioni a morire. Pertanto, è importante osservare il tubo contenente i vermi sotto un microscopio per dissezione periodicamente durante lo sbiancamento. Un altro passo da considerare nel protocollo di sincronizzazione è il mantenimento delle larve L1 arrestati. Le larve arrestate possono essere mantenute per il rotatore del tubo per 5 giorni a temperatura ambiente. È consigliabile utilizzare le larve per l'alimentazione di RNAi entro 1-2 giorni dopo la schiusa. Mantenimento prolungato in M9W può provocare la formazione della fase dauer.
Infine, un verme transgenico che esprimono SKN-1 fuso a GFP è stato utilizzato per monitorare l'attivazione della risposta allo stress ossidativo in presenza del gruppo mitis. Che viene visualizzato mediante RNAi che i componenti di p38 MAPK sono necessari per la localizzazione di SKN-1B/C::GFP dei nuclei delle cellule intestinali. È importante utilizzare le fasi L3 o L4 di questo ceppo per osservare la localizzazione di SKN-1B/C::GFP, come localizzazione di SKN-1 tende a diminuire nella fase adulta. Per osservare meglio la localizzazione di SKN-1B/C::GFP, si consiglia di sovrapporre le immagini ottenute utilizzando le impostazioni di filtro FITC e DAPI. Autofluorescenza generati dalle lipofuscine contribuire a fornire contrasto per l'osservazione di SKN-1 localizzazione nel verme. Tuttavia, ha anche dimostrato che il segnale da debolmente espresse reporter GFP è mascherato da autofluorescence emesso da varie fonti nell'intestino del baco. Autofluorescenza ha dimostrato di aumentare con l'età ed è più alto nell'intestino e utero dei elegans del c.27. Per ovviare a questo problema, uno studio recente ha utilizzato un programma di installazione filtro GFP tri-band per monitorare la localizzazione di SKN-1B/C::GFP in c. elegans28. Questa configurazione separa il segnale GFP dal autofluoresence, visualizzazione della GFP e autofluoresence nei canali verdi e gialli, rispettivamente.
C. elegans è utilizzata nel presente protocollo per studiare le interazioni ospite-patogeno e accertare come H2O2 prodotte dal gruppo mitis causa patogenicità. Ancora più importante, utilizzando questo modello, possono essere studiati gli effetti di H2O2 sul reticolo endoplasmatico stress reticolare, danno mitocondriale, mitophagy, autofagia e stress ossidativo. Inoltre, possono essere identificati meccanismi attraverso cui H2O2 agisce come un fattore di virulenza per suscitare le risposte immunitarie interrompendo processi core della cella. Quindi, questo worm è riconosciuto come un sistema potente modello per scoprire nuove intuizioni interazioni ospite-patogeno.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Si ringraziano il Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (The University of Texas, scuola di odontoiatria), Dr. Richard Lamont (Università di Louisville, scuola di odontoiatria) e Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) per la fornitura di laboratorio e ceppi clinici di gli streptococchi di gruppo mitis. Ringraziamo anche il dottor Keith Blackwell (dipartimento di genetica, Harvard Medical School) per i ceppi di c. elegans . Infine, ringraziamo Dr. Danielle Garsin e suo laboratorio (l'Università del Texas, McGovern Medical School) per la fornitura di reagenti e ceppi di vite senza fine per condurre lo studio. Alcuni ceppi di vite senza fine sono stati forniti da CGC, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
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